于曉濤，楊忠杰，應(yīng)真真，裴瑗，張永威，王瑞，2?

（1.漯河市中心醫(yī)院，河南 漯河 462000；2.河南省中藥制劑與加工中醫(yī)藥重點實驗室，河南 漯河 462000）

特發(fā)性肺纖維化（idiopathic pulmonary fibrosis，IPF）是一種特殊的慢性、進展性纖維性肺炎，表現(xiàn)為普通型間質(zhì)性肺炎的組織學(xué)和胸部高分辨CT特征，多發(fā)人群為老年人［1］。IPF 的特征是呼吸困難和肺功能的進行性惡化，且預(yù)后較差，肺纖維化診斷后的中位生存期僅為2～3年［2］。特發(fā)性肺纖維化是由肺泡上皮局部微損傷、遺傳和環(huán)境等多種因素相互作用的結(jié)果［3］。這些肺泡上皮微損傷引發(fā)了異常的上皮-成纖維細(xì)胞交流，誘導(dǎo)基質(zhì)產(chǎn)生肌成纖維細(xì)胞，以及大量細(xì)胞外基質(zhì)積累和肺間質(zhì)重塑［4-5］。肺纖維化進展中纖維細(xì)胞活化過程和細(xì)胞外基質(zhì)合成過程是復(fù)雜的病理過程，是由多種信號通路和細(xì)胞因子共同作用的結(jié)果。因此，明確IPF 進展中準(zhǔn)確可靠的基因和生物標(biāo)志物，挖掘潛在的治療中藥，對特發(fā)性肺纖維化的診斷與治療具有重要意義［6］。

近年來基因芯片技術(shù)與高通量技術(shù)被廣泛應(yīng)用于疾病致病機制基因的識別及藥物治療新靶點的篩選［7-8］。本研究利用GEO 數(shù)據(jù)庫下載特發(fā)性肺纖維化的基因芯片數(shù)據(jù)，確定特發(fā)性肺纖維化組織中的差異基因，并構(gòu)建蛋白互作網(wǎng)絡(luò)，利用CytoHubba 插件確定關(guān)鍵基因，對關(guān)鍵基因進行GO 功能、KEGG 通路分析以明確關(guān)鍵基因的生物學(xué)過程。最后采用Coremine Medical 數(shù)據(jù)庫對關(guān)鍵基因預(yù)測可能的治療中藥，為特發(fā)性肺纖維化的分子機制研究及治療性中藥挖掘提供理論依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 數(shù)據(jù)提取

查找基因表達數(shù)據(jù)庫（https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/）中特發(fā)性肺纖維化組織樣品數(shù)據(jù)，下載編號GSE110147 的基因表達數(shù)據(jù)［9］。GSE110147 數(shù)據(jù)集中包含22 例特發(fā)性肺纖維化患者和11 例正常人肺組織的基因表達數(shù)據(jù)。

1.2 數(shù)據(jù)處理

基于R 語言“l(fā)immar”包對IPF 和正常組織基因數(shù)據(jù)中的探針進行數(shù)據(jù)歸一化，對數(shù)據(jù)進行t檢驗和貝葉斯檢驗，當(dāng)一個基因?qū)?yīng)多個探針時取其平均值，以箱式圖和主成分分析圖檢查樣本標(biāo)準(zhǔn)化的情況和分組間聚類情況。

1.3 差異基因

利用R 語言，通過GPL6244 平臺對應(yīng)“hugene10 sttranscriptcluster.db”包對探針進行基因名稱注釋，差異表達基因（differentially expressed genes，DEGs）以log2（fold change）的絕對值＞2 和P＜0.01 為篩選條件，以log2（fold change）的正、負(fù)代表基因的上、下調(diào)，最后以差異表達基因的歸一化表達情況構(gòu)建火山圖和熱圖。

1.4 篩選關(guān)鍵基因

以medium confidence ＞0.4 為篩選條件，利用STRING 數(shù)據(jù)庫［10］（https：//string-db.org/）對DEG 進行蛋白質(zhì)相互作用（protein-protein interaction，PPI）分析，并將得到的PPI 互作網(wǎng)絡(luò)導(dǎo)入Cytoscape 軟件（Version 3.7.2），利用CytoHubba插件對差異基因篩選獲得關(guān)鍵基因，CytoHubba 插件具有11 種拓?fù)浞治龇椒ǎ∕CC、DMNC、MNC、Degree、Clustering Coefficient、EPC、BottleNeck、EcCentricity、Closeness、Radiality、Betweenness Stress），以Degree對節(jié)點進行排名，前15名為關(guān)鍵基因（Hub gene）。

1.5 關(guān)鍵基因的功能注釋

將所篩選的關(guān)鍵基因利用DAVID 數(shù)據(jù)庫進行功能富集（GO 基因本體論）。采用Reactome 數(shù)據(jù)庫（https：//reactome.org/）［11］對Hub gene 進行KEGG 的通路富集分析及可視化。以P＜0.05作為顯著性富集篩選標(biāo)準(zhǔn)。

1.6 Coremine Medical數(shù)據(jù)庫

將Hub gene 輸入Coremine Medical 數(shù)據(jù)庫（http：//www.coremine.com/）中，下載該基因的相關(guān)中藥信息，以P＜0.05為條件確定可能的治療性中藥。

2 結(jié)果

2.1 數(shù)據(jù)預(yù)處理

所得箱式圖可見各個樣本中位數(shù)在一個水平線上，PCA圖顯示兩組分離顯著，說明樣本間的歸一化程度好，IPF和正常組樣本表達相互獨立。見圖1。

2.2 差異基因結(jié)果

對GSE110147 的基因數(shù)據(jù)篩選共得到343 個差異表達基因（下調(diào)基因219個，上調(diào)基因124個）。火山圖及熱圖分別見圖2和圖3。

2.3 差異基因PPI網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建及關(guān)鍵基因篩選

差異基因的PPI網(wǎng)絡(luò)中共包含298個節(jié)點，節(jié)點間共649 個相互作用關(guān)系。將相互作用關(guān)系導(dǎo)入Cytoscape軟件，利用軟件中的CytoHubba插件中提供的11種拓?fù)浞治鏊惴▽W(wǎng)絡(luò)中基因節(jié)點進行評分并構(gòu)建重要模塊，并依據(jù)Degree度值評分排序來確定差異基因的關(guān)鍵基因。結(jié)果共得到兩個重要模塊，包含15 個關(guān)鍵基因，分別為CCL2、SKIV2L2、SPP1、HSP90AA1、POLR2B、TPR、RPS13、COL1A1、VCAN、SMC3、COL3A1、COL1A2、MMP1、ESF1 和NCL。見圖4和表1。

表1 差異表達基因中Degree排名前15名的基因

2.4 關(guān)鍵基因GO功能富集和KEGG通路分析

對CCL2、SKIV2L2、SPP1、HSP90AA1、POLR2B、TPR、RPS13、COL1A1、VCAN、SMC3、COL3A1、COL1A2、ESF1、MMP1和NCL共15個關(guān)鍵基因的GO分析顯示，主要富集的生物過程（BP）為細(xì)胞外基質(zhì)的組織、膠原蛋白分解代謝的過程、骨骼系統(tǒng)發(fā)育、膠原原纖維組織以及對氨基酸刺激的細(xì)胞反應(yīng)；細(xì)胞成分（CC）為細(xì)胞外基質(zhì)、膠原蛋白三聚物、細(xì)胞外區(qū)域、細(xì)胞外空間以及I 型膠原三聚體；分子功能（MF）為細(xì)胞外基質(zhì)結(jié)構(gòu)成分、血小板衍生生長因子結(jié)合、poly（A）RNA結(jié)合、mRNA結(jié)合以及相同的蛋白結(jié)合。見圖5。

Reactome 富集分析（P＜0.05）共篩選出14 條通路，包括糖尿病并發(fā)癥中的AGE/RAGE 信號通路、松弛素信號通路、蛋白質(zhì)消化吸收、IL-17 信號通路、阿米巴病、血小板激活、PI3K/Akt 信號通路、細(xì)胞外基質(zhì)受體相互作用、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、癌癥通路、流體剪切應(yīng)力與動脈粥樣硬化、NOD-like 受體信號通路、黏著斑和人類乳頭瘤病毒感染路。見圖6。

2.5 中藥預(yù)測結(jié)果

對篩選出的15 個關(guān)鍵基因預(yù)測相關(guān)中藥，其中12 個關(guān)鍵基因預(yù)測得到黃芪、三七、桂枝、黃芩、人參、丹參、黨參、桂丁、黃藥和紫蘇等多味中藥。見表2。

表2 關(guān)鍵基因相關(guān)中藥預(yù)測表

3 討論

3.1 特發(fā)性肺纖維化的患者和健康人之間的差異表達基因

IPF 的發(fā)病機制非常復(fù)雜，目前尚不完全清楚。纖維化細(xì)胞的增殖、遷移和活化增加，以及炎癥和氧化應(yīng)激都與IPF 的病因有關(guān)，細(xì)胞外基質(zhì)成分的過量產(chǎn)生也會導(dǎo)致肺纖維化。目前，IPF 的發(fā)病率在全球范圍內(nèi)不斷上升，伴隨著高發(fā)病率、高病死率和不斷增長的經(jīng)濟衛(wèi)生負(fù)擔(dān)，而臨床可用的治療方法卻十分有限。因此，識別新的生物標(biāo)志物以發(fā)現(xiàn)IPF 的潛在治療靶點極為重要。

本研究提取芯片GSE110147 信息，通過生物信息學(xué)方法分析，篩選出特發(fā)性肺纖維化的患者和健康人的343 個差異表達基因，其中包括219 個下調(diào)基因和124 個上調(diào)基因；通過PPI分析篩選出了15 個與IPF 發(fā)病機制相關(guān)的關(guān)鍵候選基因，分別為CCL2、SKIV2L2、SPP1、HSP90AA1、POLR2B、TPR、RPS13、COL1A1、VCAN、SMC3、COL3A1、COL1A2、MMP1、ESF1 和NCL。CC 趨化因子配體2（CCL2）在人類IPF 患者中增加，并且與預(yù)后不良、疾病進展和加重的纖維化結(jié)果相關(guān)［12］。分泌性磷蛋白1（SPP1）是一種磷酸化的酸性糖蛋白，主要包括破骨細(xì)胞、活化的T 細(xì)胞和活化的巨噬細(xì)胞［13］，在IPF 患者肺中增加超過20 倍，是區(qū)分IPF 肺中上調(diào)最多的基因之一［14］。基質(zhì)金屬蛋白酶（MMPs）可以通過降解細(xì)胞外基質(zhì)（ECM）蛋白來限制肺纖維化。除了ECM 蛋白之外，MMPs 還參與了蛋白質(zhì)活性的調(diào)節(jié)，包括潛在生長因子、炎癥介質(zhì)、細(xì)胞表面分子的分裂、抗纖維化生長因子和受體［15］。1 型膠原蛋白（COL1A1、COL1A2）是骨骼、皮膚和肌腱等許多人體組織中最豐富的膠原蛋白，其過表達與組織纖維化疾病呈正相關(guān)［16］。

3.2 關(guān)鍵表達基因的功能與代謝和炎癥信號通路密切相關(guān)

通過對關(guān)鍵基因的KEGG 富集分析發(fā)現(xiàn)，通路主要涉及IL-17 信號通路、糖尿病并發(fā)癥中的AGERAGE 信號通路、松弛素信號通路、蛋白質(zhì)消化吸收、血小板激活、PI3K-Akt 信號通路以及細(xì)胞外基質(zhì)受體相互作用等，進一步表明特發(fā)性肺纖維化與代謝和炎癥反應(yīng)關(guān)系密切。

研究顯示IL-17B 可直接作用于肺部上皮細(xì)胞，誘導(dǎo)下游基因表達，促進中性粒細(xì)胞的招募以及Th17細(xì)胞的分化，進而造成肺部嚴(yán)重的炎癥損傷及纖維化發(fā)生，抗生素可能對治療肺纖維化（如IPF）有效果，并且IL-17B 可以作為潛在抗纖維化靶點［17］。AGE/RAGE 信號通路激活可刺激多種促纖維化生長因子的分泌，促進膠原沉積增加，導(dǎo)致組織纖維化，以及RAGE 表達增加［18］。研究顯示纖維化肺呈現(xiàn)AGEs/RAGEs 失衡，這可能與加速衰老過程中的氧化損傷有關(guān)［19］。PI3K/Akt信號通路主要參與細(xì)胞的生長、分化、凋亡及血管生成，能使受體酪氨酸激酶（RTK）活化，使細(xì)胞質(zhì)上的PI3K 轉(zhuǎn)移至細(xì)胞膜，調(diào)控下游缺氧誘導(dǎo)因子-1α（HIF-1α）及活性氧類（ROS）系統(tǒng)等參與肺纖維化過程［20-21］。所篩選的15 個關(guān)鍵基因及其相關(guān)信號通路可作為特發(fā)性肺纖維化預(yù)防及治療的未來研究靶點。

3.3 特發(fā)性肺纖維化治療的潛在中藥

目前沒有治療效果確切的藥物用于特發(fā)性肺纖維化，臨床以糖皮質(zhì)激素和免疫抑制劑為主要治療藥物，雖然對特發(fā)性肺纖維化療效較好，但也常引起較嚴(yán)重的不良反應(yīng)［22］。本文以關(guān)鍵基因篩選治療IPF 的潛在中藥，得到黃芪、三七、丹參、黨參、桂丁、桂枝、黃芩、黃藥、人參和紫蘇等多味中藥。研究發(fā)現(xiàn)三七總皂苷可使肺纖維化小鼠肺組織中PI3K、AKT、mTOR 蛋白磷酸化水平降低，減少細(xì)胞外基質(zhì)以及膠原纖維沉積，以緩解肺纖維化進程［23］。黃芪苷可降低波形纖維蛋白和人Ⅰ型膠原蛋白的表達，并且阻斷H2O2對自噬相關(guān)蛋白如Beclin-1 和LC3A/B 的誘導(dǎo)表達，從而抑制氣道中自噬的形成以緩解ROS 介導(dǎo)的支氣管纖維化［24］。丹芍化纖膠囊由丹參、赤芍、黃芪、銀杏葉等組成，可減輕肺組織的膠原沉積，并調(diào)控TGF-β1/Smads 信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路以發(fā)揮抗肺纖維化的作用［25-26］。

通過對GEO 數(shù)據(jù)庫中特發(fā)性肺纖維化基因數(shù)據(jù)的差異表達分析，共得到CCL2、SKIV2L2、SPP1、HSP90AA1 和POLR2B 等15 個特發(fā)性肺纖維化疾病相關(guān)的關(guān)鍵基因，通過對關(guān)鍵基因富集分析發(fā)現(xiàn)特發(fā)性肺纖維化與代謝和炎癥反應(yīng)關(guān)系密切，預(yù)測發(fā)現(xiàn)黃芪、三七、丹參、黨參、桂丁、黃芩等多味中藥可作用于相關(guān)的關(guān)鍵基因，可作為特發(fā)性肺纖維化疾病潛在的治療中藥。特發(fā)性肺纖維化所篩選的關(guān)鍵基因及預(yù)測的相關(guān)中藥可為后續(xù)特發(fā)性肝纖維化機制研究及藥物治療提供參考，本研究也需要進一步實驗來驗證關(guān)鍵基因及相關(guān)中藥的治療作用。