范曉陽(yáng)，賈世艷，司瑞花，鄭博文，劉光珍?

（1.山西省中醫(yī)藥研究院，山西 太原 030012；2.山西中醫(yī)藥大學(xué)，山西 晉中 030619）

穿山龍是薯蕷植物穿龍薯蕷的干燥根莖［1］，味甘、苦，性溫，歸肺、腎和肝經(jīng)。穿山龍中主要活性成分是甾體皂苷類化合物，主要包括纖細(xì)薯蕷皂苷、薯蕷皂苷等，此外還有黃酮類和菲醌類化合物，目前已經(jīng)從穿山龍中分離出20多種化合物［2-3］，如薯蕷皂苷、苯甲酸等。穿山龍總皂苷具有保肝、抗炎、免疫調(diào)節(jié)、降尿酸、抗腫瘤和腎病治療作用等多種生物學(xué)活性［4-9］，且目前已被用作合成治療冠心病的甾體激素和皂苷類藥物的重要工業(yè)原料［10］。目前的研究表明，穿山龍是抗氧化化合物的良好來(lái)源。顯示出最高活性的組分可進(jìn)一步分離出用于治療相關(guān)疾病的新型、經(jīng)濟(jì)有效和更安全的活性化合物。

本實(shí)驗(yàn)以穿山龍為材料，對(duì)超聲輔助提取工藝進(jìn)行優(yōu)化，在單因素實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上，選擇乙醇濃度、提取時(shí)間、提取溫度、超聲時(shí)間為自變量，以總皂苷的提取率為指標(biāo)，采用響應(yīng)面法優(yōu)化得到穿山龍總皂苷的超聲提取最佳工藝。同時(shí)采用非極性的AB-8 大孔吸附樹(shù)脂對(duì)穿龍山總皂苷進(jìn)行純化，最后考察了總皂苷純化前后的體外抗氧化活性，為穿山龍的進(jìn)一步開(kāi)發(fā)利用提供理論基礎(chǔ)和數(shù)據(jù)支撐。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

穿山龍飲片（山西省中醫(yī)藥研究院提供，經(jīng)劉光珍教授鑒定為正品）；薯蕷皂苷（中國(guó)食品藥品檢定研究院，批號(hào)：20210526，純度：≥98%）。

高氯酸（分析純，批號(hào)：06127635412，天津市申泰化學(xué)試劑有限公司）；冰醋酸（分析純，批號(hào)：20196745198，天津市申泰化學(xué)試劑有限公司）、香草醛（分析純，批號(hào)：06712987156，天津市申泰化學(xué)試劑有限公司）；維生素C（VC）溶液（批號(hào)：060721210618，上海碧云天生物技術(shù)有限公司）。

1.2 儀器與設(shè)備

754 型紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)（上海舜宇恒平科學(xué)儀器有限公司）；DACW-4恒溫水浴鍋（廣州中興實(shí)驗(yàn)儀器有限公司）；FW-100 萬(wàn)能粉碎機(jī)（上海比朗儀器制造）；GZX-ME-Ⅱ電熱恒溫干燥箱（上海發(fā)展醫(yī)療器械有限公司）。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 穿山龍總皂苷的提取工藝流程

穿山龍總皂苷先經(jīng)過(guò)粉碎、過(guò)篩（40 目），再進(jìn)行石油醚回流脫脂，干燥備用。脫脂后的穿山龍粉末先經(jīng)過(guò)超聲輔助提取，后再進(jìn)行乙醇回流提取，濃縮液干燥，得到穿山龍總皂苷粗品［11-12］。

1.3.2 總皂苷的含量測(cè)定

1.3.2.1 標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制

精密稱定薯蕷皂苷對(duì)照品4.00 mg，加甲醇溶解定容至25 mL 容量瓶中，超聲15 min，即得濃度為0.16 mg/mL的薯蕷皂苷標(biāo)準(zhǔn)溶液，備用。

1.3.2.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

取上述配制好的標(biāo)準(zhǔn)溶液，分別精確吸取0.10、0.20、0.40、0.80、1.60、2.00 mL 于磨口具塞試管中，70 ℃水浴蒸發(fā)溶劑，依次加入新配制的5%的香草醛-冰醋酸溶液0.2 mL，高氯酸0.8 mL，搖勻，70 ℃水浴充分反應(yīng)20 min，取出，冰水冷卻5 min，加冰醋酸至10 mL，搖勻，靜置20 min，在波長(zhǎng)370 nm 處測(cè)吸光度值。以薯蕷皂苷的標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度為橫坐標(biāo)，吸光度為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得回歸方程為：

Y=23.731X-0.273 3，R2=0.997 6，Y 為吸光度，X 為薯蕷皂苷濃度（mg/mL），線性范圍為0.016～0.320 mg/mL。

1.3.2.3 穿山龍總皂苷的含量測(cè)定

取上述提取的總皂苷粗品，用甲醇溶解，配制成濃度為0.16 mg/mL的溶液，吸取1 mL樣品溶液于具塞試管中，用甲醇做對(duì)照，根據(jù)“1.3.2.2”項(xiàng)下標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制的方法測(cè)定吸光度。依據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算出總皂苷濃度，并根據(jù)公式（1）計(jì)算出樣品總皂苷的含量［13］。

其中，d為稀釋倍數(shù)，C為根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算溶液中總皂苷的質(zhì)量濃度（mg/mL），M為稱取的樣品質(zhì)量（mg），V為定容體積（mL）。

1.3.3 穿山龍總皂苷的提取工藝優(yōu)化

1.3.3.1 單因素實(shí)驗(yàn)

取上述預(yù)處理過(guò)的穿山龍粉末1.0 g，固定超聲功率800 W，選取乙醇濃度、提取時(shí)間、提取溫度、超聲時(shí)間4 個(gè)因素，改變其中1 項(xiàng)因素，其他因素不變進(jìn)行單因素實(shí)驗(yàn)。各單因素變量分別是乙醇濃度（20%、40%、60%、80%、100%）、提取時(shí)間（40、60、80、100、120 min）、提取溫度（40、50、60、70、80 ℃）和超聲時(shí)間（10、15、20、25、30 min），提取次數(shù)均為3次。

1.3.3.2 響應(yīng)面優(yōu)化

在單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果的基礎(chǔ)上，選取乙醇濃度（A）、提取時(shí)間（B）、提取溫度（C）和超聲時(shí)間（D）為考察因素，以總皂苷提取得率為指標(biāo)，采用響應(yīng)面法，用Design Expert 8.0軟件進(jìn)行實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)分析，進(jìn)而優(yōu)化穿山龍總皂苷的提取工藝。

1.3.4 穿山龍總皂苷的純化

根據(jù)上述實(shí)驗(yàn)所篩選出的最優(yōu)條件進(jìn)行提取，將提取到的總皂苷采用正丁醇萃取，正丁醇層減壓過(guò)濾濃縮得浸膏，利用非極性的AB-8 大孔吸附樹(shù)脂作為吸附介質(zhì)進(jìn)行純化，總皂苷用水溶解后，上樣，依次用水、70%乙醇洗脫大孔吸附樹(shù)脂，收集70%乙醇洗脫液，濃縮，冷凍干燥［14］。

1.3.5 體外抗氧化活性研究

1.3.5.1 DPPH自由基清除實(shí)驗(yàn)

參考文獻(xiàn)［15］中的方法，測(cè)定樣品清除DPPH 自由基的能力。首先制備DPPH 溶液，將24 mg 的DPPH溶解在100 mL 的甲醇中。將純化前后的總皂苷分別用甲醇配制成濃度為1、2、3、4、5 mg/mL 的待測(cè)液。分別取3 mL 上述各濃度的總皂苷溶液置于不同試管中，再向每只試管中加入0.1 mol/L 的DPPH 溶液3 mL，充分混合后，放置25 min。以無(wú)水乙醇作對(duì)照，在波長(zhǎng)為515 nm 的條件下測(cè)得吸光度A測(cè)定；以無(wú)水乙醇替代3 mL 總皂苷溶液，測(cè)量后得吸光度A空白；于試管中充分混合相同體積不同濃度的上述總皂苷溶液與無(wú)水乙醇，擱置30 min，以VC 溶液為陽(yáng)性對(duì)照，測(cè)得吸光度A對(duì)照，計(jì)算DPPH清除率。

1.3.5.2 ABTS自由基清除實(shí)驗(yàn)

參考文獻(xiàn)［16］中的方法，用ABTS 評(píng)價(jià)總皂苷純化前后的抗氧化能力。該檢測(cè)方法是基于抗氧化劑清除ABTS 自由基陽(yáng)離子的能力，導(dǎo)致溶液在405 nm 處的吸光度降低。將7 mmol/L ABTS 自由基溶液與2.45 mmol/L K2S2O8溶液混合，將混合液在室溫下于黑暗中放置12 h，得到含有ABTS自由基陽(yáng)離子的深色溶液。將得到的ABTS工作液用水稀釋至在405 nm 波長(zhǎng)下測(cè)得吸光度為0.7 的濃度。將純化前后的總皂苷配制成濃度為1、2、3、4、5 mg/mL的待測(cè)液。取0.1 mL樣品溶液與1.9 mL ABTS 工作液混合，常溫避光放置6 min，在波長(zhǎng)405 nm 處測(cè)定吸光度A測(cè)定；用甲醇為空白，測(cè)定吸光度A空白；于試管中充分混合相同體積不同濃度的上述總皂苷溶液與無(wú)水乙醇，用雙光束分光光度計(jì)測(cè)定溶液的吸光度，測(cè)定時(shí)間為6 min。以VC 溶液為陽(yáng)性對(duì)照，測(cè)得吸光度A對(duì)照，計(jì)算ABTS清除率。

2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.1 單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.1.1 乙醇濃度對(duì)穿山龍總皂苷得率的影響

在提取時(shí)間60 min、超聲時(shí)間15 min、提取溫度60 ℃條件下，分別考察乙醇濃度為20%、40%、60%、80%、100%時(shí)對(duì)總皂苷含量的影響，結(jié)果如圖1A所示。在乙醇濃度為80%時(shí)，總皂苷的含量達(dá)到最大，因此選擇60%、80%、100%濃度的乙醇作為響應(yīng)面設(shè)計(jì)的3個(gè)水平。

2.1.2 提取時(shí)間對(duì)穿山龍總皂苷得率的影響

在乙醇濃度80%、超聲時(shí)間15 min、提取溫度60 ℃條件下，分別考察提取時(shí)間為40、60、80、100、120 min時(shí)對(duì)總皂苷含量的影響，結(jié)果如圖1B所示。在提取時(shí)間為100 min 時(shí)，總皂苷的含量達(dá)到最大，因此選擇80、100、120 min的提取時(shí)間作為響應(yīng)面設(shè)計(jì)的3個(gè)水平。

2.1.3 提取溫度對(duì)穿山龍總皂苷得率的影響

在乙醇濃度80%、超聲時(shí)間15 min、提取時(shí)間100 min 條件下，分別考察提取溫度為40、50、60、70、80 ℃時(shí)對(duì)總皂苷含量的影響，結(jié)果如圖1C所示。在提取溫度為70 ℃時(shí)，總皂苷的含量達(dá)到最大，因此選擇60、70、80 ℃的提取溫度作為響應(yīng)面設(shè)計(jì)的3個(gè)水平。

2.1.4 超聲時(shí)間對(duì)穿山龍總皂苷得率的影響

在乙醇濃度80%、提取時(shí)間100 min、提取溫度70 ℃條件下，分別考察超聲時(shí)間為10、15、20、25、30 min時(shí)對(duì)總皂苷含量的影響，結(jié)果如圖1D所示。在超聲時(shí)間為25 min時(shí)，總皂苷含量達(dá)到最大，因此選擇20、25、30 min的超聲時(shí)間作為響應(yīng)面設(shè)計(jì)的3個(gè)水平。

2.2 響應(yīng)面優(yōu)化穿山龍總皂苷的提取工藝

根據(jù)單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果，采用Design Expert 8.0 軟件進(jìn)行實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)，得出在上述4 個(gè)條件下所提取的總皂苷得率，通過(guò)軟件分析得出最優(yōu)提取工藝條件。見(jiàn)表1、表2。

表1 響應(yīng)面分析因素與水平表

表2 響應(yīng)面設(shè)計(jì)方案及結(jié)果

用實(shí)驗(yàn)得到的以薯蕷皂苷標(biāo)示的總皂苷含量值計(jì)算二階多項(xiàng)式的系數(shù)、回歸系數(shù)和P值，以總皂苷的含量為響應(yīng)值（Y），得到總皂苷含量對(duì)各影響因素的二次多項(xiàng)式回歸模型。

Y=16.22+0.63×A+0.42×B+0.13×C+0.65×D+0.28×AB-0.23×AC-0.042×AD+0.072×BC-0.22×BD+0.15×CD-3.63×A2-1.45×B2-0.88×C2-1.48×D2

通過(guò)方差分析表可以看出，模型組差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.000 1），失擬項(xiàng)差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.132 4 ＞0.05），說(shuō)明回歸方程的可靠性及顯著性較好。擬合模型R2=0.937 8，預(yù)測(cè)模型R2Adj=0.875 7，變異系數(shù)CV=5.37%，說(shuō)明實(shí)驗(yàn)中所得的結(jié)果與響應(yīng)面軟件預(yù)測(cè)值較為接近，實(shí)驗(yàn)所得結(jié)果誤差較小，由此可知該方法擬合度良好，表明用可以該方法來(lái)對(duì)總皂苷的得率結(jié)果進(jìn)行預(yù)測(cè)和分析，同時(shí)也說(shuō)明了該實(shí)驗(yàn)的穩(wěn)定性較好，見(jiàn)表3。兩兩因素交互作用見(jiàn)圖2?？梢?jiàn)，各因素對(duì)穿山龍總皂苷得率的影響為超聲時(shí)間（D）＞乙醇濃度（A）＞提取時(shí)間（B）＞提取溫度（C）。

表3 回歸方程的方差分析

利用Design-Expert 8.0 軟件求出回歸模型的最大值，即超聲波輔助提取穿山龍總皂苷的最優(yōu)條件為：乙醇濃度80%、提取時(shí)間80 min、提取溫度80 ℃、超聲時(shí)間25 min，在此提取條件下，穿山龍總皂苷的含量為16.24%，RSD值為2.92%。見(jiàn)表4。

表4 最佳提取工藝的驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)

2.3 穿山龍總皂苷的純化

將根據(jù)上述最優(yōu)條件提取到的總皂苷進(jìn)行正丁醇萃取，正丁醇層減壓過(guò)濾濃縮得浸膏，利用非極性的AB-8 大孔吸附樹(shù)脂作為吸附介質(zhì)進(jìn)行純化，總皂苷用水溶解后，上樣，依次用水、70%乙醇洗脫大孔吸附樹(shù)脂，收集70%乙醇洗脫液，濃縮，冷凍干燥。測(cè)定純化后總皂苷的含量，重復(fù)測(cè)量3 次，純化后的總皂苷平均含量為50.49%，RSD值2.42%。

2.4 體外抗氧化活性研究

2.4.1 DPPH 自由基清除能力

在相同濃度下，VC 的DPPH 自由基清除能力遠(yuǎn)大于純化和未純化的總皂苷，純化的總皂苷大于未純化的總皂苷。未純化的總皂苷、純化后的總皂苷IC50值分別為4.9、3.8 mg/mL。見(jiàn)圖3A。

2.4.2 ABTS自由基清除能力

在相同濃度下，VC 的ABTS 自由基清除能力遠(yuǎn)大于純化和未純化的總皂苷，純化的總皂苷大于未純化的總皂苷。未純化的總皂苷、純化后的總皂苷IC50值分別為2.8、2.2 mg/mL。見(jiàn)圖3B。

3 討論

隨著對(duì)穿山龍研究的深入，穿山龍總皂苷的最佳提取方法及其眾多的藥理作用受到越來(lái)越多的關(guān)注［17-19］。本研究中，利用響應(yīng)面法優(yōu)化提取條件，以獲得最大的總皂苷提取率，研究結(jié)果表明乙醇濃度、提取溫度、超聲時(shí)間和提取時(shí)間對(duì)穿山龍總皂苷的提取率有較大的影響。

乙醇濃度對(duì)總皂苷的提取率影響最大，當(dāng)乙醇濃度從20%增加到80%時(shí)，總皂苷的得率逐步上升，當(dāng)乙醇濃度為80%時(shí)，得率達(dá)到最高值，根據(jù)相似相溶理論，當(dāng)溶劑與溶質(zhì)的極性相似時(shí)，皂苷更容易從細(xì)胞中溶解［20］。提取時(shí)間對(duì)總皂苷得率也有影響，提取時(shí)間在20～100 min 時(shí)，總皂苷的得率呈上升趨勢(shì)，提取速度變緩，當(dāng)提取時(shí)間增加到100 min 時(shí)，總皂苷的得率變化不明顯，可能原因是隨著提取時(shí)間的增加，穿山龍中更多的蛋白質(zhì)和多糖溶解在溶劑中，阻礙了皂苷的溶解［21］，因此，為了提高提取效率和節(jié)約能源，選擇提取時(shí)間為100 min。在研究提取溫度對(duì)總皂苷得率的影響時(shí)發(fā)現(xiàn)，隨著溫度上升，總皂苷得率增加，可能原因是高溫使皂苷分子運(yùn)動(dòng)加快，有利于穿山龍總皂苷的溶出［22］，高溫還可以使皂苷在溶劑中的溶解度增加［23］，導(dǎo)致得率增加，除此之外，還可能是由于超聲時(shí)已經(jīng)破裂的細(xì)胞組織在回流提取中通過(guò)熱量從基質(zhì)中釋放皂苷［24］，當(dāng)溫度增加到70 ℃時(shí)，總皂苷的得率略有下降，可能是因?yàn)闇囟壬?，?dǎo)致某些有效成分的分解或促進(jìn)了皂苷氧化等副反應(yīng)，使總皂苷得率下降。超聲時(shí)間也會(huì)影響總皂苷的得率，由于超聲通過(guò)乙醇溶劑的振幅較大，產(chǎn)率也會(huì)增加，可能是因?yàn)槌晻r(shí)間越長(zhǎng)，穿山龍粉末的分子間振動(dòng)就越劇烈，另一方面是由于超聲波刺激了植物細(xì)胞壁的破裂，并通過(guò)微射流和聲流促進(jìn)沖洗細(xì)胞內(nèi)容物［25］，因此提取率升高，故結(jié)合工藝的成本，選擇最佳的超聲時(shí)間為25 min，隨著超聲時(shí)間的增加，得率下降，可能原因是超聲增加空化過(guò)程中溶劑中的氣泡數(shù)，從而降低超聲能量傳遞到介質(zhì)中的效率［26］，降低了總皂苷得率。

最新研究發(fā)現(xiàn)，有多種中藥植物中含有抗氧化能力很強(qiáng)的化學(xué)物質(zhì)，可以作為合成抗氧化劑的替代品［27］。國(guó)外研究報(bào)道，各種藥用植物，同種植物的不同部分都有一定的抗氧化性，其中皂苷、黃酮、多糖、酚類化合物都有一定的抗氧化性［28］。在本次抗氧化作用實(shí)驗(yàn)研究中，總皂苷純化前后都可以使自由基脫色，采用DPPH、ABTS清除試劑測(cè)定其抗氧化性，穿山龍總皂苷純化后的抗氧化性大于未純化的抗氧化性，然而二者的差別不大，說(shuō)明總皂苷在進(jìn)行純化時(shí)，棄掉了一部分酚類或者其他的化合物，導(dǎo)致這種現(xiàn)象的發(fā)生。

4 結(jié)論

本文以穿山龍總皂苷為研究對(duì)象，采用單因素與響應(yīng)面相結(jié)合的方式對(duì)超聲波輔助提取穿山龍總皂苷的工藝進(jìn)行了優(yōu)化，結(jié)果表明，響應(yīng)面分析的二次模型擬合程度較高，影響總皂苷得率的因素主次順序是超聲時(shí)間（D）＞乙醇濃度（A）＞提取時(shí)間（B）＞提取溫度（C）；提取的最佳工藝為：乙醇濃度80%、提取時(shí)間80 min、提取溫度80 ℃、超聲時(shí)間25 min，在此條件下，總皂苷的含量為16.24%，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)穩(wěn)定?？傇碥战?jīng)過(guò)AB-8 大孔吸附樹(shù)脂進(jìn)行純化，純化后的總皂苷含量為50.49%。

本研究分別采用DPPH、ABTS 自由基清除兩種體外抗氧化實(shí)驗(yàn)對(duì)總皂苷純化前后的抗氧化活性進(jìn)行評(píng)價(jià)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，穿山龍總皂苷純化前后對(duì)DPPH和ABTS 自由基都有一定的清除能力，但清除能力都較VC 弱；總皂苷純化后比未純化的總皂苷體外抗氧化能力增強(qiáng)；其抗氧化活性隨質(zhì)量濃度的增大呈上升趨勢(shì)，穿山龍總皂苷具有抑制自由基生成的作用。