吳 桐，張巧麗，齊雪維

根據(jù)美國癌癥研究協(xié)會估計，2020年全球肝細胞癌(hepatocellular carcinoma，HCC)發(fā)病率位于第六位，死亡率高居第三位[1]。盡管近年來對HCC診斷和治療取得了一些進展，但低生存率、高復發(fā)率和不良預后仍然是不容樂觀的問題[2]。因此，積極尋找預測HCC患者預后的分子標志物和治療靶點對其治療及改善預后具有重要的意義。RNA結(jié)合蛋白(RNA binding proteins，RBPs)是轉(zhuǎn)錄后修飾的重要蛋白，可與其他蛋白質(zhì)或RNA相互作用形成核糖核蛋白復合物，調(diào)控RNA加工、翻譯、輸出和定位，從而維持細胞內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)定[3]。由于基因組的改變、轉(zhuǎn)錄和轉(zhuǎn)錄后修飾調(diào)控及翻譯后修飾等原因可導致腫瘤組織RBPs表達和功能異常[4-6]，這個過程可能參與了腫瘤的發(fā)生發(fā)展[7,8]。RBPs可通過調(diào)控腫瘤生長相關(guān)信號通路和相關(guān)靶基因的表達介導腫瘤細胞增殖[9,10]，也可通過調(diào)節(jié)上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化促進腫瘤細胞轉(zhuǎn)移[11,12]。癌組織RBP表達顯著不同于癌旁組織，且與患者預后密切相關(guān)[13-15]。因此，對RBPs進行系統(tǒng)研究有助于進一步認識腫瘤發(fā)病機制，對治療靶點的篩選和判斷預后具有積極的意義。本研究應用生物信息學方法系統(tǒng)地探討了HCC與癌旁組織差異表達RBPs的功能及其分子機制，并構(gòu)建了預后預測模型，旨在找出獨立的預后生物標志物，從而可以更好地指導臨床治療。

1 資料與方法

1.1 數(shù)據(jù)收集與差異表達分析 從TCGA數(shù)據(jù)庫(至2021年10月7日)下載374例HCC組織和50例癌旁組織RNA-Seq-FPKM數(shù)據(jù)和臨床數(shù)據(jù)。應用R軟件的Limma包對數(shù)據(jù)進行差異表達分析。篩選出腫瘤組織和正常組織差異表達的RBPs(FDR< 0.05 and |log2 FC|>1)。

1.2 GO和KEGG通路富集分析 為了全面分析這些差異表達的RBPs的生物學功能，我們應用R軟件中的clusterProfiler 包進行G0和KEGG通路富集分析，P< 0.05和FDR < 0.05作為統(tǒng)計學上差異顯著的標準。

1.3 蛋白互作網(wǎng)絡(luò)(PPI)的構(gòu)建 應用STRING數(shù)據(jù)庫建立差異蛋白之間的相互作用網(wǎng)絡(luò)，并應用Cytoscape進行網(wǎng)絡(luò)可視化分析，對其中關(guān)鍵模塊進行識別，P<0.05為差異顯著的閾值。

1.4 預后模型的構(gòu)建與驗證 對PPI中的RBPs進行單因素Cox回歸分析，篩選出與生存相關(guān)的RBPs。進一步對納入完整臨床信息的樣本分成測試和驗證隊列，在測試隊列中對生存相關(guān)RBPs進行多因素Cox回歸，構(gòu)建預后模型，并計算出風險得分。每個樣本的風險得分計算公式為：

其中β代表回歸系數(shù)，Exp代表基因表達值，i代表樣本

根據(jù)測試隊列中位風險得分，將兩個隊列患者分為低危組和高危組，進行生存分析，比較兩組總體生存率，并繪制ROC曲線，評價預后模型的效能，AUC>0.6被認為是可接受的模型。將風險得分和其他臨床變量(年齡、性別、腫瘤分級和分期)一起進行單因素和多因素Cox回歸分析，以判斷風險得分是否可以作為獨立的預后因素。同時，我們還根據(jù)預后模型中的RBPs繪制列線圖。

1.5 基因突變分析和蛋白表達水平驗證 應用cBioPortal對風險模型中的RBPs進行基因突變分析。通過HPA在線數(shù)據(jù)庫驗證預后模型中RBPs水平的預測意義。

2 結(jié)果

2.1 肝癌患者RBPs基因表達與鑒定 在374個HCC樣本和50個非腫瘤組織中，共收集了1343個RBPs。經(jīng)Limma包進行差異表達分析，鑒定出82個差異表達的RBPs，包含55個上調(diào)的RBPs和27個下調(diào)的RBPs。

2.2 差異表達的RBPs功能富集分析 GO富集分型結(jié)果表明，在生物學過程中，上調(diào)的RBPs主要在調(diào)控mRNA代謝過程和大分子甲基化方面顯著富集，下調(diào)的RBPs在RNA分解、翻譯調(diào)控、核酸磷酸二酯鍵水解和細胞酰胺代謝過程中顯著富集；在分子功能方面，上調(diào)的RBPs主要在催化活性、作用于mRNA 3'-UTR結(jié)合和RNA解旋酶活性方面顯著富集，下調(diào)的RBPs主要在核糖核酸活性方面顯著富集；對細胞成分的分析結(jié)果表明，上調(diào)的RBPs 主要富集于核蛋白顆粒和細胞質(zhì)應激顆粒，下調(diào)的RBPs主要富集于mRNA帽結(jié)合復合物、CCR4-NOT復合物和頂端樹突。KEGG通路富集分析結(jié)果表明，上調(diào)的RBPs顯著富集于mRNA監(jiān)測途徑、癌組織microRNA和RNA轉(zhuǎn)運等信號通路，下調(diào)的RBPs顯著富集于丙型肝炎病毒和甲型流感病毒感染等信號通路(表1)。

表1 KEGG富集分析差異表達的RBPs功能

2.3 PPI網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建和關(guān)鍵模塊的選擇 構(gòu)建PPI網(wǎng)絡(luò)，通過Cytoscape進行了可視化描述(圖1A)，分別以“degree”和“betweenness”兩個拓撲特征的中位數(shù)為標準進行篩選，獲得了6個樞紐基因，即GSPT2、DDX39A、ELAVL2、 IGF2BP1、BOP1和OASL。應用MCODE插件對PPI網(wǎng)絡(luò)進行處理，篩選出2個關(guān)鍵模塊(圖1B)，功能富集分析顯示主要富集于病毒防御反應、Ⅰ型干擾素信號通路、DNA烷基化和DNA甲基化等(表2)。

圖1 PPI網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建A：Cytoscape可視化網(wǎng)絡(luò)；B：篩選的關(guān)鍵模塊

表2 PPI關(guān)鍵模塊RBPs的GO富集分析

2.4 預后相關(guān)RBPs的鑒定 對PPI中差異RBPs進行單因素Cox回歸分析，得到了22個與預后相關(guān)的RBPs(圖2)。

圖2 單因素Cox分析篩選出與預后相關(guān)的RBPs

2.5 預后模型的構(gòu)建與驗證 在測試序列中對預后相關(guān)的RBPs進行了多因素Cox回歸分析，獲得5個RBPs用來構(gòu)建預后模型，即LIN28B、SMG5、PPARGC1A、LARP1B和ANG(圖3)。為了評估預后模型的預測能力，根據(jù)中位風險得分，將測試序列中186例患者分為高危組和低危組行生存分析。結(jié)果顯示，與低危組比，高危組生存率較差(圖4A)。經(jīng)ROC分析顯示，該模型可以很好地預測患者預后，預測1 a/3 a/5 a生存率的AUC分別為0.718/0.731/0.657(圖4B)。為了驗證該預后模型的效能，我們對驗證序列中184例患者進行了生存分析，結(jié)果顯示高危組與低危組生存率之間具有顯著性差異，其預測1 a/3 a/5 a生存率的AUC分別為0.732/0.642/0.627，提示該預后模型具有較好的敏感性和特異性(圖5)。單變量Cox回歸分析提示腫瘤分期和風險得分與預后有關(guān)，多變量Cox回歸分析提示風險得分可以作為獨立的風險因素。

圖3 多因素Cox分析鑒定出影響預后的基因

圖4 預后模型預測生存的ROC曲線A：為生存分析；B：為ROC曲線

圖5 預后模型對測試序列的生存分析A：為生存分析；B：為ROC曲線分析

2.6 列線圖的構(gòu)建與效能 通過列線圖中5個RBPs水平計算HCC患者的預后分值，可為臨床診治工作提供參考(圖6)。

圖6 列線圖預測HCC患者生存率每個RBPs水平對應一個點，將所有的點分值相加計算總分，繪制總分軸與各預后軸之間的垂線，預測HCC患者的生存率

2.7 基因突變分析及其蛋白表達水平驗證 應用cBioPortal對與預后顯著相關(guān)的基因進行基因突變分析，結(jié)果顯示在366例HCC組織中有20%發(fā)生了5個RBPs突變(以mRNA 上調(diào)為主，圖7)。為了驗證這5個RBPs的表達差異，通過HPA在線數(shù)據(jù)庫獲取了它們在HCC組織表達的免疫組化結(jié)果，結(jié)果顯示HCC組織 LARP1B表達陽性，正常組織為陰性，而在腫瘤和正常組織LIN28B表達均為陰性(圖8)。

圖7 與預后顯著相關(guān)的RBPs基因突變分析A：共有20%HCC組織發(fā)生基因突變；B：顯示每個基因突變的發(fā)生率，其中以基因上調(diào)為主(紅色)

圖8 HCC組織和正常肝組織部分預后模型基因表達(應用HPA數(shù)據(jù)庫獲得) A：LIN28B在HCC組織和正常肝組織表達均為陰性；B：LARP1B在HCC組織呈陽性表達，在正常肝組織呈陰性表達

3 討論

在本研究中，我們在 TCGA數(shù)據(jù)庫374個HCC樣本和50個癌旁樣本鑒別出82個差異表達的RBPs，進一步系統(tǒng)分析了相關(guān)的生物學途徑，并構(gòu)建了HCC的預后預測模型。

在PPI網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建中共篩選出6個核心差異RBPs。研究表明，GSPT2在HCC組織呈高表達，可通過影響細胞周期促進腫瘤進展[16]。DDX39高表達與晚期臨床分期呈正相關(guān)，因為后者可通過β-catenin激活Wnt/β-catenin通路促進HCC的生長、侵襲和轉(zhuǎn)移[17]。ELAVL2可激活內(nèi)源性原癌基因，引起多種腫瘤的進展[18]，并參與了腫瘤化療的耐藥，其高表達可能是食管鱗狀細胞癌患者化療應答不良的獨立危險因素[19]。IGF2BP1可調(diào)控腫瘤細胞增殖、生長、侵襲和化療耐藥所需的一些重要mRNA靶點的表達，與人類各種癌癥的整體生存率和轉(zhuǎn)移率有關(guān)[20]。BOP1可調(diào)控上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化導致HCC的侵襲和遷移[21]，在結(jié)腸癌的轉(zhuǎn)移方面也發(fā)揮著重要的作用，其機制與調(diào)控Wnt/β-catenin信號通路相關(guān)[22]。除了核心RBPs外,其它多種RBPs也在腫瘤的發(fā)生發(fā)展過程中起著重要的作用，如TRIM71通過抑制NF-κB通路促進NSCLC細胞增殖，其表達上調(diào)，與NSCLC腫瘤大小、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、TNM分期和預后不良相關(guān)[23]。在50%以上人肺腺癌癌組織中檢測到NR0B1蛋白，且在男性低分化癌組織中有高表達趨勢[24]。NR0B1蛋白可通過調(diào)節(jié)Wnt/β-Catenin信號通路促進HCC的增殖、侵襲和轉(zhuǎn)移[25]。

通過單因素和多因素Cox回歸分析，最終得到由5個RBPs，即LIN28B、SMG5、PPARGC1A、LARP1B和ANG，構(gòu)建的預后預測模型。研究表明LIN28B可促進HCC發(fā)生、發(fā)展。高表達LIN28B的HCC患者總體生存率顯著縮短[26]。SMG5在多種惡性腫瘤中高度表達，具有作為早期診斷分子標志物的潛力[27]。一項針對中國東部漢族人群肝癌的調(diào)查結(jié)果表明，PPARGC1A與HCC的發(fā)生風險相關(guān)[28]。研究發(fā)現(xiàn)，在HCC組織高水平的LARP1蛋白可使死亡風險增加約35%，并與腫瘤大小、生存時間和Child-Pugh評分相關(guān)[29]。ANG-2在HCC中高度表達，可作為鑒別慢性肝病患者或健康對照者的潛在的腫瘤標志物[30]。應用HPA數(shù)據(jù)庫驗證這5個RBPs的表達，結(jié)果提示 HCC組織LARP1B表達陽性，在正常肝臟組織呈陰性。正常組織和腫瘤組織中LIN28B均為陰性。到目前為止，數(shù)據(jù)庫中還沒有SMG5、PPARGC1A和ANG的相關(guān)資料。