王春瑩，屈耀寧，喬 煒，劉靜靜，胡穎輝

乙型肝炎病毒e抗原(hepatitis B virus e antigen，HBeAg)陽性的慢性乙型肝炎(chronic hepatitis B，CHB)是全球性公共衛(wèi)生問題[1]?？共《局委熆捎行б种埔倚透窝撞《?hepatitis B virus，HBV)復(fù)制，明顯減輕肝組織損害程度，其中恩替卡韋因病毒抑制能力強等優(yōu)點，是目前HBeAg陽性的CHB患者治療的一線用藥[2，3]。但也存在治療早期應(yīng)答率不滿意和用藥療程長等問題。如何早期精準預(yù)測其治療療效是目前研究的重點課題[4]。研究發(fā)現(xiàn)，HBV共價閉合環(huán)狀 DNA(covalently closed circular DNA，cccDNA)是HBV前基因組 RNA(progenomic RNA，pgRNA)復(fù)制的模板，因可轉(zhuǎn)錄成大小不同的mRNA，并翻譯為蛋白質(zhì)，在HBV復(fù)制過程中有重要的臨床意義[5，6]。近期研究指出，HBV cccDNA半衰期長、不易降解，可在肝細胞內(nèi)長期存在，嚴重影響了臨床抗病毒治療的療效且增加了復(fù)發(fā)的風(fēng)險。HBV pgRNA在感染肝細胞時，形成病毒顆粒釋放入血，可反映HBV cccDNA的存在狀態(tài)[7，8]?；谏鲜霰尘?，本研究應(yīng)用恩替卡韋治療了89例CHB患者，并檢測了血清HBV cccDNA和pgRNA水平變化，現(xiàn)報道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料 2018年1月～2020年1月我院收治的HBeAg陽性CHB患者89例，男性53例，女性36例；年齡為28～42歲，平均年齡為(35.6±6.5)歲。符合相關(guān)指南的診斷標準[9]。納入標準：HBeAg陽性，且持續(xù)時間≥6個月，血清HBV DNA定量大于2×104IU/mL，血清谷氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(alanine transaminase，ALT)水平持續(xù)/反復(fù)增高，肝組織學(xué)檢查存在肝炎病變，入組前未接受過抗病毒治療。排除標準：合并其他嗜肝病毒感染、肝癌或失代償期肝病、合并自身免疫性肝炎或酒精性肝炎、藥物性肝損傷、重要器官疾病、脂肪性肝炎。本研究已經(jīng)我院醫(yī)學(xué)倫理委員會審核通過，患者簽署知情同意書。

1.2 治療方法 給予所有入組患者恩替卡韋分散片【蘇州東瑞制藥有限公司，國藥準字H20100129】0.5 mg口服，1次/d，連續(xù)治療觀察48 w。

1.3 血清ALT、HBsAg和HBeAg水平檢測 使用德國西門子公司提供的ADVIA2400生化分析儀檢測血清ALT；使用美國雅培公司提供的Architect i2000型化學(xué)發(fā)光免疫分析儀檢測血清HBsAg和HBeAg水平。

1.4 血清HBV DNA、HBV cccDNA和HBV pgRNA水平檢測 應(yīng)用核酸提取純化試劑(廣州海力特生物科技有限公司)提取血清總RNA。應(yīng)用cDNA合成試劑盒(Thermo Fisher Science，Waltham)逆轉(zhuǎn)錄成cDNA。采用熒光定量PCR法檢測血清HBV DNA(上?？迫A生物工程有限公司)；使用Roche公司提供的COOBAS TAQMAN和COBAS Amliprep系統(tǒng)和采用熒光定量PCR法檢測血清HBV cccDNA和HBV pgRNA水平(南京建邦錦源醫(yī)療科技有限公司提供)。

1.5 療效評估 根據(jù)指南[9]，病毒學(xué)應(yīng)答：血清HBV DNA 載量較基線下降≥2 lgIU/mL或<500 IU/mL；生化學(xué)應(yīng)答：血清ALT水平降至40 U/L一下水平；血清學(xué)應(yīng)答：血清HBeAg陰轉(zhuǎn)，未伴抗HBeAg出現(xiàn)。同時出現(xiàn)病毒學(xué)和生化學(xué)應(yīng)答者為完全應(yīng)答。

2 結(jié)果

2.1 抗病毒治療臨床結(jié)局 89例HBeAg陽性CHB患者經(jīng)恩替卡韋治療48 w后，獲得病毒學(xué)應(yīng)答85例(95.5%)，生化學(xué)應(yīng)答80例(89.9%)，血清學(xué)應(yīng)答9例(10.1%)；獲得完全應(yīng)答75例(84.3%)。

2.2 兩組血生化、血清和病毒學(xué)指標比較 入組時，完全應(yīng)答組血清ALT水平顯著高于，而血清HBsAg、HBeAg、HBV cccDNA和HBV pgRNA水平顯著低于非完全應(yīng)答組(P<0.05，表1)。

表1 兩組血生化、血清和病毒學(xué)指標比較

2.3 各指標預(yù)測CHB患者抗病毒療效的ROC曲線分析 經(jīng)ROC曲線分析提示血清HBV cccDNA聯(lián)合HBV pgRNA檢測CHB患者抗病毒治療后獲得完全應(yīng)答的療效價值較高，優(yōu)于血清HBsAg 或HBeAg檢測(表2、圖1)。

表2 兩項聯(lián)合預(yù)測患者療效的ROC曲線分析

圖1 各指標預(yù)測CHB患者療效的ROC曲線

3 討論

本研究在89例HBeAg陽性CHB患者經(jīng)恩替卡韋治療48 w 后，84.3%獲得完全應(yīng)答，95.5%獲得病毒學(xué)應(yīng)答，89.9%為生化學(xué)應(yīng)答，10.1%為血清學(xué)應(yīng)答，其中獲得CR者較有關(guān)報道[10,11]高，提示恩替卡韋治療HBeAg陽性CHB患者有較好的療效。以往研究多借助于血清HBV DNA定量及HBeAg水平變化對CHB患者的抗病毒療效進行預(yù)估，但這些指標的預(yù)測價值受到了挑戰(zhàn)[12]。探尋更為有效的預(yù)測標志物以及時調(diào)整HBeAg陽性CHB患者的抗病毒治療方案，對改善患者預(yù)后有十分重要的臨床意義。

HBV cccDNA作為HBV復(fù)制的初始模板，是HBV感染最早能檢測到的復(fù)制中間體。研究證實HBV cccDNA可與細胞內(nèi)核蛋白結(jié)合形成微染色體，穩(wěn)定存在于肝細胞核內(nèi)，可精準地反映HBV的復(fù)制狀態(tài)[13]。HBV cccDNA半衰期長且不易降解，是病毒持續(xù)復(fù)制的根源，也是CHB患者抗病毒治療失敗的影響因素之一。研究發(fā)現(xiàn)HBV cccDNA可利用RNA轉(zhuǎn)錄酶生成pgRNA，而HBV pgRNA可翻譯為多種病毒蛋白，在病毒DNA序列上含有全部遺傳信息，進入細胞漿內(nèi)的病毒核心顆粒在DNA聚合酶的作用下被反轉(zhuǎn)錄為子代DNA負鏈[14，15]，由此推測HBV cccDNA和HBV pgRNA相互作用，共同參與了HBV發(fā)病進程。

早期有學(xué)者研究認為肝組織內(nèi)檢測不到HBV cccDNA可作為CHB患者抗病毒治療的最佳終點[16]，但后續(xù)研究發(fā)現(xiàn)應(yīng)用核苷類抗病毒治療停止后CHB患者出現(xiàn)耐藥和復(fù)發(fā)的風(fēng)險較高[17]。文獻報道指出，當肝組織處于炎癥活動狀態(tài)和肝細胞出現(xiàn)變性壞死時，肝內(nèi)HBV cccDNA被釋放入血液[18]，而PCR熒光探針法等技術(shù)的應(yīng)用使得CHB患者血清HBV cccDNA和HBV pgRNA精準檢測成為可能，這也是本項研究開展應(yīng)用血清HBV cccDNA和HBV pgRNA水平預(yù)測HBeAg陽性慢性乙型肝炎患者在恩替卡韋治療后療效預(yù)測價值研究的主要依據(jù)。本結(jié)果顯示完全應(yīng)答組血清HBeAg、HBV cccDNA和HBV pgRNA水平顯著低于非完全應(yīng)答組，提示恩替卡韋治療前CHB患者血清HBV cccDNA和HBV pgRNA水平低者，可能獲得較好的療效，提示在HBeAg陽性CHB患者抗病毒治療前和治療期間定期監(jiān)測血清HBV cccDNA和HBV pgRNA水平是十分必要的。恩替卡韋等核苷(酸)類似物在治療CHB患者過程中可通過影響 HBV 聚合酶，抑制 HBV pgRNA 逆轉(zhuǎn)錄成 rcDNA，導(dǎo)致新病毒顆粒形成減少，而逐步耗竭HBV cccDNA并減少HBV pgRNA生成，但仍無法阻止新感染的病毒形成HBV cccDNA[19]，這也是長期應(yīng)用核苷(酸)類似物抗病毒治療易出現(xiàn)耐藥且停藥后易復(fù)發(fā)的原因。

此外，本研究結(jié)果顯示血清HBV cccDNA和HBV pgRNA聯(lián)合檢測預(yù)測HBeAg陽性CHB患者在接受恩替卡韋抗病毒治療后療效的AUC為0.888，其靈敏性和特異性較單一項目檢測高，提示這一病毒學(xué)檢測技術(shù)的應(yīng)用將具有一定的臨床意義。相關(guān)研究也發(fā)現(xiàn)定量檢測血清HBV cccDNA水平可精準地評估CHB患者在接受抗病毒治療后的療效[20，21]。本研究也同時發(fā)現(xiàn)檢測血清HBsAg和HBeAg水平預(yù)測HBeAg陽性CHB患者抗病毒治療療效的效能，但兩者單項檢測預(yù)測的價值并不高。當然，檢測血清HBsAg和HBeAg水平發(fā)現(xiàn)，在治療前它們的水平太高的患者可能很難獲得理想的血清學(xué)應(yīng)答或完全應(yīng)答。但病毒學(xué)檢測發(fā)現(xiàn)，當血清HBV cccDNA≤2.5 copies/mL或HBV pgRNA≤5.0 copies/mL時，預(yù)示患者在恩替卡韋治療后獲得完全應(yīng)答的幾率較高，這些結(jié)果或可為HBeAg陽性CHB患者在抗病毒前預(yù)測療效提供幫助。

綜上所述，本研究采用最新的檢測手段檢測了血清HBV cccDNA和HBV pgRNA水平，并分析了兩者聯(lián)合檢測預(yù)測HBeAg陽性CHB患者在恩替卡韋治療后療效的價值，結(jié)果是令人滿意的。兩種病毒學(xué)指標的檢測優(yōu)于檢測常規(guī)的血清學(xué)指標，或許因為后者的血清變動范圍太大，定量檢測的方法也很難標化等原因。但檢測血清病毒學(xué)指標，尤其是這些新指標，同樣存在試劑標準化的挑戰(zhàn)，還可能由于機體排毒的動態(tài)變化，也可造成檢測結(jié)果很難精確的問題。這些都需要在以后的研究中予以闡明。