張娜娜， 溫曉蕾， 李雙民， 馮麗娜， 霍佳歡， 蘭淑慧，栗佳寧， 郭思柔， 王建華， 齊慧霞*

（1.河北科技師范學(xué)院農(nóng)學(xué)與生物科技學(xué)院，河北 秦皇島 066600；2.河北農(nóng)業(yè)大學(xué)植物保護學(xué)院，河北 保定 071002；3.河北省昌黎縣職業(yè)技術(shù)教育中心，河北 秦皇島 066600）

板栗屬殼斗科，在6 000多年前就已經(jīng)存在相關(guān)記錄，被人們稱作“千果之王”“鐵桿莊稼”。板栗營養(yǎng)豐富，富含蛋白質(zhì)、脂肪、碳水化合物、胡蘿卜素等，具有保健功能，能夠起到養(yǎng)胃、強筋、消腫等功效，因此深受人們喜愛[1]。

板栗內(nèi)腐病又稱栗干腐病、栗黑斑病，有黑斑、褐斑、軟腐3 種類型，主要危害果仁，病斑顏色多為黑色、褐色。發(fā)病初期形成淺褐色病斑，嚴(yán)重時腐爛并有酸味；后期病斑處出現(xiàn)空洞，果仁硬化，濕度大時產(chǎn)生菌絲體，同時病斑處易被細菌侵染形成軟腐[2]。板栗內(nèi)腐病是在貯藏和運輸過程中的常見病害，嚴(yán)重地影響了板栗品質(zhì)，給果農(nóng)帶來巨大的經(jīng)濟損失。板栗內(nèi)腐病主要是由致病微生物侵染從而導(dǎo)致栗仁腐爛[2]，李德茂等[3]對遷西板栗貯藏過程中的致腐微生物進行分離鑒定，共分離出12個屬的真菌，包括毛霉屬、青霉屬、鐮刀菌屬、曲霉屬、疫霉屬和短梗霉屬等，但未對致病菌進行深入研究。本研究室于2020年9—10月對從河北省唐山市遷西縣和遵化市采集的板栗進行調(diào)查時發(fā)現(xiàn)1 種病害，該病害主要危害栗仁，癥狀表現(xiàn)為在栗仁的表面產(chǎn)生黑褐色或深褐色病斑，隨著病斑的蔓延，病斑壞死。因此，本研究通過病原菌分離培養(yǎng)、致病性鑒定、形態(tài)學(xué)和分子生物學(xué)鑒定，明確該病原菌的種類，以期為該病害的防治提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

板栗病果于2020年9—10月采集自河北省唐山市遷西縣栗園，品種為早豐。

PDA 培養(yǎng)基：水1 000 mL，瓊脂粉 20 g，葡萄糖20 g，馬鈴薯200 g。

儀器：PCR 儀(S1000, Bio-rad)、電泳儀(DYY-6C，北京市六一儀器廠)、恒溫培養(yǎng)箱（ZGZ-450，上海丙林電子科技有限公司）、電熱鼓風(fēng)干燥箱（GZX-9140MBE，上海博訊實業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠）、Si顯微鏡（尼康，日本）。

1.2 病原菌的分離與純化

采用組織分離法[4]分離和純化病原菌，從栗果的病健交界處切取5 mm×5 mm 的組織塊，將組織塊用75%乙醇表面消毒30 s，無菌水沖洗3 次，用滅菌濾紙吸干表面水分，接種至PDA 培養(yǎng)基上，每皿3塊，倒置于25 ℃的恒溫箱中培養(yǎng)5 d，待菌落長出后，挑取菌落邊緣處，接種到新的PDA培養(yǎng)基中培養(yǎng)純化，純化后轉(zhuǎn)入斜面試管4 ℃條件下保存?zhèn)溆?。共分離純化出3 株菌株，分別編號為BL-5、BL-7和BL-9。

1.3 病原菌的形態(tài)學(xué)鑒定

將供試菌株接種到PDA 培養(yǎng)基，于25 ℃恒溫條件下培養(yǎng)7 d左右，觀察病原菌在培養(yǎng)基上的菌落形態(tài)，從菌落表面挑取培養(yǎng)物，顯微鏡下觀察菌絲形態(tài)及孢子情況，進行形態(tài)學(xué)鑒定[4-6]，初步確定病原菌分類地位。

1.4 致病性鑒定

根據(jù)柯赫氏法則[4]，采用離體接種法檢測病原菌的致病性。選取健康板栗栗果，用75%乙醇表面消毒，無菌水沖洗2 遍，用針刺法在果仁接種部位制造傷口，取7 mm活化后的菌絲塊接種于果仁的傷口部位，保鮮膜固定，以無菌水作為對照，置于培養(yǎng)皿（直徑150 mm）中25 ℃條件下保濕培養(yǎng)，24 h 后去掉菌餅，記錄發(fā)病情況，對發(fā)病栗果的病原菌進行再次分離鑒定，與原接種菌進行比較。

1.5 病原菌的分子鑒定

從培養(yǎng)5 d 的菌株上挑取適量菌絲，放入1.5 mL的滅菌離心管里，用研磨機將其磨碎，按照DNA 基因組試劑盒（康為世紀(jì)生物科技有限公司）說明書提取DNA。對病原菌ITS 序列進行擴增，真菌生物核糖體DNA 引物ITS1 和ITS4 序列分別為：5’-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3’和5’-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3’[7]。PCR 反應(yīng)總體積 25 μL：引物各 1 μL，DNA 模板 2 μL，ddH2O 12.5 μL，2×EsTaqMasterMix 8.5 μL。ITS 擴增程序：94 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃變性30 s，55 ℃退火45 s，72 ℃ 延 伸 1 min，32個 循 環(huán) ；72 ℃ 延 伸10 min；4 ℃保存。用1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測擴增產(chǎn)物，產(chǎn)物樣品合格后送往生工（上海）公司測序。將測序所得菌株DNA-ITS 序列與NCBI 中進行同源性比對，用MEGA-X 軟件構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。

2 結(jié)果與分析

2.1 分離菌株的菌落及形態(tài)特征

BL-5 菌株在PDA 培養(yǎng)基上初期菌絲呈白色，菌落中心部位有淡紅色素；后期菌落逐漸變成深紅色，附著白色菌絲，且菌落中心可見黃色菌絲（圖1），菌絲中心生長密集，邊緣稀疏。菌絲生長速度較快，4～5 d就可長滿90 mm 培養(yǎng)皿。經(jīng)形態(tài)學(xué)鑒定，初步將BL-5 鑒定為禾谷鐮刀菌（Fusarium graminearum）。

圖1 BL-5的形態(tài)特征Fig.1 Morphological characteristics of the BL-5

BL-7 菌株在PDA 培養(yǎng)基上培養(yǎng)6 d 的菌落呈現(xiàn)白色、絨毛狀，圓形或近圓形，菌絲邊緣較稀薄，能產(chǎn)生大量的小型分生孢子，孢子呈長橢圓形或梨形，顏色透明，具有隔膜，表面光滑，分生孢子梗具分枝（圖 2），分生孢子大小為 26.356 μm×182.659 μm～37.728 μm×145.745 μm。經(jīng)形態(tài)學(xué)鑒定，初步將BL-7 鑒定為層出鐮孢菌（Fusarium proliferatum）。

圖2 BL-7的形態(tài)特征Fig.2 Morphological characteristics of the BL-7

BL-9 菌株在PDA 培養(yǎng)基上菌落呈圓形，邊緣光滑，菌絲呈棉絮狀。初期菌落邊緣呈白色，中心呈粉紅色；隨著菌落的生長，后期菌落顏色逐漸變?yōu)檫吘壋蕼\粉紅色，中心呈淺黃色或褐色；從正面觀察，菌落上附有白色絨毛狀菌絲。能夠產(chǎn)生大型的分生孢子，小型分生孢子較少，有隔膜，孢子的兩頭較細長、中間部位粗，似鐮刀，彎曲或直立，具有厚垣孢子（圖3），孢子大小為18.386 μm×359.836 μm～19.385 μm×364.643 μm。經(jīng)形態(tài)學(xué)鑒定，初步將BL-9 鑒定為木賊鐮刀菌（Fusarium equiseti）。

圖3 BL-9的形態(tài)特征Fig.3 Morphological characteristics of the BL-9

2.2 致病性鑒定

圖4顯示，健康板栗接種BL-5菌株后3 d開始發(fā)病，初期病斑呈深褐色，外緣處有淡黃色暈圈；后期病斑顏色逐漸加深，呈黑色，外緣仍有黃色暈圈，濕度大時會出現(xiàn)白色或淺紅色菌絲體，有異味并分泌粘狀物。根據(jù)柯赫氏法則，再次從該發(fā)病部位分離病原菌，能夠得到與BL-5 形態(tài)特征相同的病原真菌，因此，證實菌株BL-5為致病菌。

圖4 致病性測定Fig.4 Pathogenicity detection

健康板栗接種BL-7 菌株后2 d 開始發(fā)病，潛育期較短，初期病斑呈深褐色，在中心處可見深黃色病斑，分布不均勻；隨著濕度的增大，病斑處生長白色菌絲。根據(jù)柯赫氏法則，再次從該發(fā)病部位分離病原菌，能夠得到與BL-7 形態(tài)特征相同的病原真菌，因此，證實菌株BL-7為致病菌。

健康板栗接種BL-9 菌株后3 d 開始發(fā)病，初期為淺褐色圓形小病斑，顏色分布均勻，后期病斑邊緣處有深褐色暈圈，中心呈淡黃色或淺褐色，病健交界處明顯。根據(jù)柯赫氏法則，再次從該發(fā)病部位分離病原菌，能夠得到與BL-9 形態(tài)特征相同的病原真菌，因此，證實菌株BL-9為致病菌。

2.3 分子鑒定

以菌株 BL-5、BL-7、BL-9 的基因組 DNA 為模板，以ITS引物進行PCR 擴增，BL-5、BL-7、BL-9分別獲得553、564 和552 bp 條帶；擴增產(chǎn)物測序后與BLAST 進行比對，并建立分子系統(tǒng)發(fā)育樹，結(jié)果（圖 5、6 和 7）表 明 ，BL-5 與 禾 谷 鐮刀 菌（Fusarium graminearum）KJ847741、BL-7與層出鐮孢菌（Fusarium proliferatum）MW686898、BL-9 與木賊鐮刀菌（Fusarium equiseti）KU984711 的同源性都達到了99 %，因此，BL-5、BL-7、BL-9 分別鑒定為禾谷鐮刀菌（Fusarium graminearum）、層出鐮孢 菌（Fusarium proliferatum）、木 賊 鐮 刀 菌（Fusarium equiseti）。

圖5 BL-5的系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.5 Phylogenetic tree of BL-5

圖6 BL-7的系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.6 Phylogenetic tree of BL-7

圖7 BL-9的系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.7 Phylogenetic tree of BL-9

3 討論

國內(nèi)外學(xué)者對板栗內(nèi)腐病病原菌進行了深入的研究，劉建華等[8]發(fā)現(xiàn)，鐮刀菌引發(fā)的板栗栗果內(nèi)腐病的癥斑為黑褐色，與本研究中鐮刀菌引起病癥結(jié)果一致；戴雨生等[9]對板栗病果進行分離鑒定發(fā)現(xiàn)，炭疽菌、小穴殼菌分別占分離菌數(shù)量的36.1%、31.1%，為優(yōu)勢菌；王海霞等[10]從板栗栗仁病部分離出青霉屬、鏈鉻孢屬、絲核菌屬等共11個屬，其中，聚端孢屬、鏈格孢屬、鐮刀菌屬、殼梭孢為優(yōu)勢菌；梁麗松等[11]研究發(fā)現(xiàn)，鐮刀菌屬、鏈鉻孢屬等在板栗病發(fā)部的豐度較高；賀偉等[12]研究發(fā)現(xiàn)，Penicilliumspp 豐度較高；Tziros 等[13]研究表明，Sclerotinia pseudotuberosa引起板栗內(nèi)腐病。綜上所述，不同地區(qū)間引起板栗腐爛的病原菌存在差異，這可能和地理、環(huán)境、氣候等條件有關(guān)。近年來，板栗內(nèi)腐病的發(fā)生逐年加重，嚴(yán)重影響了板栗的產(chǎn)量和品質(zhì)。本研究證實，禾谷鐮刀菌、層出鐮孢菌、木賊鐮刀菌為引起板栗內(nèi)腐病的致病菌，下一步應(yīng)對鐮刀菌的生物學(xué)特性、流行與傳播、藥劑防治等進行深入研究，為板栗內(nèi)腐病的防治提供理論指導(dǎo)。