張泳嫻，麥煥庭

（佛山市婦幼保健院，廣東佛山 528000）

孕壹方為筆者所在單位主治不孕不育、著床困難、經(jīng)血不調(diào)的臨床驗(yàn)方，該方由黃芪、黨參、大棗、綿茵陳等藥味組成，起補(bǔ)氣活血、養(yǎng)陰調(diào)經(jīng)、暖宮促孕的作用。研究表明，上述作用與方中君藥黃芪的功效活性密切相關(guān)。黃芪中所含的黃芪甲苷、毛睿異黃酮葡萄糖苷、黃芪皂苷等成分，均能夠起到增強(qiáng)體質(zhì)、促進(jìn)新陳代謝和血液循環(huán)、抗氧化和激活細(xì)胞增殖的藥理作用[1-6]。因此，在含黃芪類(lèi)中藥方劑和中成藥的功效機(jī)制、制備工藝、藥效物質(zhì)等研究中，常以黃芪中的活性成分尤其是黃芪甲苷為指標(biāo)[7]。

為更好地了解孕壹方中黃芪甲苷被生物（大鼠）口服后的吸收、分布、代謝、排泄情況，筆者擬對(duì)其開(kāi)展口服藥物代謝動(dòng)力學(xué)研究，并根據(jù)研究結(jié)果，進(jìn)一步驗(yàn)證該成分能否被生物體充分吸收、利用，為孕壹方的藥效評(píng)價(jià)和功效機(jī)制研究提供科學(xué)依據(jù)。

1 儀器、試藥和材料

UPLC-Xevo 型超高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀（美國(guó)Waters 公司），N-240 干式氮?dú)獯祾邇x（上海那艾精密儀器有限公司），5425R型低溫高速離心機(jī)（德國(guó)Eppendorf 公司），MT 型電子精密分析天平（瑞士Mettler-Toledo 公司）。黃芪甲苷對(duì)照品（批號(hào)：110781-202118）和維拉帕米對(duì)照品（批號(hào)：100223-200102）均購(gòu)自中檢院；孕壹方所用黃芪、黨參、大棗、綿茵陳等藥材飲片購(gòu)自華潤(rùn)三九藥業(yè)股份有限公司；實(shí)驗(yàn)用甲酸、乙腈、甲醇等色譜純?cè)噭┵?gòu)自德國(guó)Merck 公司，去離子水為法國(guó)Millipore 凈水機(jī)制備。SPF 級(jí)SD 大鼠購(gòu)自廣東實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，許可證號(hào)SYXK（粵）2018-0001，飼養(yǎng)條件為溫度25℃±2℃、濕度50%±5%，日常給予清水和大鼠飼料養(yǎng)育7天以上。

2 方法和結(jié)果

2.1 試藥制備 取處方量黃芪、黨參、大棗、綿茵陳等藥材飲片，加水適量煎煮兩次，每次1h，合并煎液，濾過(guò)后濃縮至≤200mL，轉(zhuǎn)移至250mL 量瓶中，加水定容至刻度，即得。

2.2 血樣采集 取SD 大鼠，雌雄各半，灌胃給予10mL 孕壹方藥液，給藥后于0、5min、10min、15min、30min、60min、90min、2h、3h、4h、6h、12h、24h 分別通過(guò)尾緣靜脈取血，血樣轉(zhuǎn)移至預(yù)加肝素的EP管中，-20℃保存，備用。

2.3 血樣處理方法 取血樣，每份樣品精密吸取100μL，置于容量為1.5mL 塑料EP 管中，加含0.1% 甲酸的乙腈溶液300μL，13000rpm 離心10min 后，精密吸取上清液300μL，轉(zhuǎn)移至另一干凈1.5mL 塑料EP 管中，氮?dú)獯蹈?，加?00μL 內(nèi)標(biāo)溶液（含100ng/mL 維拉帕米和0.1%甲酸的甲醇溶液，下同），13000rpm 離心5min，精密吸取上清液80μL，作為供試品溶液。

2.4 樣品檢測(cè)方法 使用Waters ACQUITY UPLC BEH 300 C18 色譜柱（2.1×100mm，1.7μm），色譜柱溫度為40℃，流速為0.3mL/min，流動(dòng)相為A（含0.1%甲酸的乙腈溶液）和B（0.1%甲酸水溶液），ESI 離子源，正負(fù)離子同時(shí)檢測(cè)的MRM 模式，梯度洗脫條件為，0～0.5min，95%→66% B；0.5～1.0min，66%→30% B；1.0～2.0min，30%→0%B；2～2.5min，0→95% B；2.5～3.0min，95%→95%B，進(jìn)樣2.0μL，檢測(cè)離子對(duì)為黃芪甲苷785.6/143.1（CE：20V），維 拉帕米455.0/165.0（CE：25V）。標(biāo)準(zhǔn)添加血樣和藥動(dòng)學(xué)樣品LC-MS 圖譜見(jiàn)圖1。

圖1 血漿標(biāo)準(zhǔn)添加溶液（含黃芪甲苷100ng/mL，內(nèi)標(biāo)100ng/mL）及峰值（4.00h）血樣LC-MS圖譜

2.5 方法學(xué)考察

2.5.1 線(xiàn)性 取黃芪甲苷對(duì)照品，加甲醇配成濃度為20μg/mL 的溶液。吸取上述溶液，加空白血漿配成濃度為1μg/mL 的血漿標(biāo)準(zhǔn)添加溶液，將該血漿標(biāo)準(zhǔn)添加溶液繼續(xù)加空白血漿逐級(jí)稀釋?zhuān)涑蓾舛确謩e為500、200、100、50、20、10、5、2ng/mL的血漿溶液。吸取上述溶液（含濃度為1μg/mL的溶液）100μL，轉(zhuǎn)移至1.5mL 塑料EP 管中，按“2.3”所述方法制備供試品溶液，再按“2.4”所述方法檢測(cè)血藥濃度，根據(jù)待測(cè)物（黃芪甲苷）和內(nèi)標(biāo)（維拉帕米）的峰面積計(jì)算峰面積比，以峰面積比（x）對(duì)濃度（y）做線(xiàn)性回歸，得方程為y=193.28x-3.0437（r2=0.9962）。上述結(jié)果表明，檢測(cè)方法線(xiàn)性良好，能夠?qū)?～1000ng/mL 血藥濃度范圍的樣品進(jìn)行準(zhǔn)確測(cè)定。

2.5.2 靈敏度 取“2.5.1”項(xiàng)下配制的血漿標(biāo)準(zhǔn)添加溶液，逐級(jí)稀釋至1ng/mL，吸取上述溶液100μL，轉(zhuǎn)移至1.5mL 塑料EP 管中，平行配制6份，按“2.3”所述方法制備供試品溶液，再按“2.4”所述方法檢測(cè)血藥濃度，根據(jù)待測(cè)物（黃芪甲苷）和內(nèi)標(biāo)（維拉帕米）的峰面積計(jì)算峰面積比，并計(jì)算血藥濃度、回收率和回收率的RSD。結(jié)果顯示，平均回收率為100.31%，RSD 為11.79%，表明方法靈敏度良好。

2.5.3 精密度和準(zhǔn)確度 制備3 個(gè)濃度各6 份QC樣品（黃芪甲苷濃度分別為800、100、5ng/mL的血漿標(biāo)準(zhǔn)添加溶液，下同），吸取上述溶液100μL，轉(zhuǎn)移至1.5mL 塑料EP 管中，平行配制6 份，按“2.3”所述方法制備供試品溶液，再按“2.4”所述方法檢測(cè)血藥濃度，根據(jù)待測(cè)物（黃芪甲苷）和內(nèi)標(biāo)（維拉帕米）的峰面積計(jì)算峰面積比，并計(jì)算血藥濃度、回收率和回收率的RSD。結(jié)果顯示，平均回收率為95.11%～102.30%，RSD 為5.07%～10.50%，表明方法精密度和準(zhǔn)確度良好。

2.5.4 穩(wěn)定性 分別考察常溫、進(jìn)樣器、凍融、長(zhǎng)期穩(wěn)定性四個(gè)項(xiàng)目，每個(gè)項(xiàng)目均使用QC 樣品（濃度和數(shù)量同“2.5.3”部分）。常溫穩(wěn)定性考察方法為：QC 樣品放置于常溫（25℃）下8h 后，按“2.3”所述方法制備供試品溶液，再按“2.4”所述方法檢測(cè)血藥濃度；進(jìn)樣器穩(wěn)定性考察方法為：QC 樣品按“2.3”所述方法制備供試品溶液，在LC-MS 自動(dòng)進(jìn)樣器中放置2h 后，再按“2.4”所述方法檢測(cè)血藥濃度；凍融穩(wěn)定性考察方法為：QC 樣品凍存于-20℃，取出，解凍后再次放入冷凍，循環(huán)三次，按“2.3”所述方法制備供試品溶液，再按“2.4”所述方法檢測(cè)血藥濃度；長(zhǎng)期穩(wěn)定性考察方法為：QC 樣品凍存于-20℃，30 天后取出，解凍后按“2.3”所述方法制備供試品溶液，再按“2.4”所述方法檢測(cè)血藥濃度。根據(jù)上述項(xiàng)目所測(cè)得待測(cè)物（黃芪甲苷）和內(nèi)標(biāo)（維拉帕米）的峰面積計(jì)算峰面積比，并計(jì)算血藥濃度、回收率和回收率的RSD。結(jié)果顯示，平均回收率為95.43%～108.28%，RSD為5.05%～10.11%，表明方法所制備樣品穩(wěn)定性良好。

2.5.5 基質(zhì)效應(yīng) 分別考察溶劑和血漿基質(zhì)效應(yīng)。溶劑基質(zhì)效應(yīng)考察方法為：使用含0.1%甲酸的甲醇溶液為溶劑制備QC 樣品，按“2.3”所述方法制備供試品溶液，再按“2.4”所述方法檢測(cè)；血漿基質(zhì)效應(yīng)的考察方法為：取空白血漿，按“2.3”所述方法操作至“氮?dú)獯蹈伞?，殘?jiān)忧笆鋈軇榧状嫉腝C 樣品溶液復(fù)溶，繼續(xù)處理，所得供試品溶液按“2.4”所述方法檢測(cè)。根據(jù)上述項(xiàng)目所測(cè)得待測(cè)物（黃芪甲苷）和內(nèi)標(biāo)（維拉帕米）的峰面積計(jì)算峰面積比，并計(jì)算血藥濃度、回收率和回收率的RSD。結(jié)果顯示，平均回收率為95.48%～102.31%，RSD 為5.62%～12.54%，表明方法樣品基質(zhì)干擾排除能力良好。

2.6 血藥濃度測(cè)定和藥代動(dòng)力學(xué)參數(shù)計(jì)算 取“2.2”項(xiàng)下所得血樣，按“2.3”所述方法制備供試品溶液，再按“2.4”所述方法檢測(cè)，據(jù)上述項(xiàng)目所測(cè)得待測(cè)物（黃芪甲苷）和內(nèi)標(biāo)（維拉帕米）的峰面積計(jì)算峰面積比，并計(jì)算血藥濃度。所得結(jié)果導(dǎo)入DAS2.0 軟件中，計(jì)算藥代動(dòng)力學(xué)參數(shù)，并使用Graphpad 軟件繪制血藥濃度-時(shí)間曲線(xiàn)（圖2）。結(jié)果顯示，Tmax=4.00h，Cmax=223.2636ng/mL，T1/2=2.577h，MRT=4.294h，AUC0-i=795.331mg/L·h，AUC0-t=834.236mg/L·h。上述結(jié)果表明，大鼠口服孕壹方湯劑后，能夠較為充分地吸收其中所含的黃芪甲苷，且該成分在體內(nèi)的吸收、分布、代謝、排泄情況較為適宜其發(fā)揮藥理活性，表明對(duì)黃芪甲苷進(jìn)行藥代動(dòng)力學(xué)研究能夠較好地反映孕壹方的體內(nèi)運(yùn)動(dòng)過(guò)程和發(fā)揮功效的機(jī)制。

圖2 黃芪甲苷血藥濃度-時(shí)間曲線(xiàn)（n=6）

3 討論

由藥代動(dòng)力學(xué)數(shù)據(jù)可知，黃芪甲苷達(dá)峰時(shí)間和平均駐留時(shí)間較長(zhǎng)（4h 和4.429h），表明服藥后該成分在大鼠體內(nèi)代謝速度較慢，即發(fā)揮最大效用所需時(shí)間較長(zhǎng)。同時(shí)，由圖2 及藥動(dòng)學(xué)中Cmax、AUC 等參數(shù)可知，黃芪甲苷血藥濃度在大鼠體內(nèi)上升較為平緩，但同時(shí)吸收較為充分，可以達(dá)到較為適宜的血藥濃度，上述結(jié)果與文獻(xiàn)報(bào)道及相關(guān)藥理、藥性研究基本相符[7-9]，從藥動(dòng)學(xué)層面證明了黃芪性微溫這一中醫(yī)藥理論。同時(shí)，圖2 的血藥濃度曲線(xiàn)也表明，孕壹方中黃芪的作用較為溫和，對(duì)機(jī)體傷害小，適宜于孕婦或備孕婦女使用。

通常情況下，黃芪甲苷的測(cè)定受到提取方法復(fù)雜、檢測(cè)手段較為特別（如高效液相色譜需使用蒸發(fā)光散射檢測(cè)器）等原因，較難實(shí)現(xiàn)與黃芪中其他成分同時(shí)測(cè)定。本文使用LC-MS法，預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，黃芪甲苷信號(hào)強(qiáng)度較好，圖譜中無(wú)明顯干擾，表明黃芪甲苷能夠?qū)崿F(xiàn)較為充分的離子化，可在質(zhì)譜中與其他成分實(shí)現(xiàn)同時(shí)測(cè)定，為后續(xù)孕壹方及其他含黃芪藥物的多指標(biāo)同時(shí)測(cè)定提供了科學(xué)依據(jù)[9]。

色譜條件選擇方面，原先使用不含0.1%甲酸的乙腈為流動(dòng)相；所用樣品溶劑中，甲醇也不含甲酸。但預(yù)實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，黃芪甲苷信號(hào)強(qiáng)度較弱，在濃度較低時(shí)難以與干擾實(shí)現(xiàn)基線(xiàn)分離。因此，在有機(jī)相中加入甲酸，同時(shí)適當(dāng)調(diào)整液相梯度，確保黃芪甲苷峰在洗脫前于柱內(nèi)充分富集；在進(jìn)入質(zhì)譜時(shí)則受流動(dòng)相和酸度、離子強(qiáng)度影響充分離子化，確保最大限度提高信號(hào)響應(yīng)，增強(qiáng)了檢測(cè)靈敏度。