鄧杏好，湯鉅添，程潔芳，姚遠(yuǎn)華

（1.佛山市順德區(qū)第三人民醫(yī)院（佛山市順德區(qū)北滘醫(yī)院），廣東佛山 528311；2.廣東省第二中醫(yī)院（廣東省中醫(yī)藥工程技術(shù)研究院），廣東廣州 510095）

仲歸顆粒來自筆者所在單位臨床驗方經(jīng)現(xiàn)代化制劑工藝制備而得，該制劑由杜仲、當(dāng)歸、黃芪等藥味經(jīng)水提后制粒而成，其用于高血壓防治或使用降壓藥后的輔助治療，通過調(diào)節(jié)腎功能和血管內(nèi)皮細(xì)胞緊張度等方法，促進(jìn)患者血壓下降。仲歸顆粒含有多種化學(xué)成分[1-4]，經(jīng)檢索文獻(xiàn)和課題相關(guān)研究表明，方中所含京尼平苷酸、阿魏酸具有較為顯著的iNOS-mRNA 調(diào)控活性[5-6]，能夠較好地實現(xiàn)前述功效。因此，可以使用上述成分作為評價仲歸顆粒質(zhì)量和功效等關(guān)鍵參數(shù)的指標(biāo)。

中藥配方顆粒為中藥飲片經(jīng)現(xiàn)代化、規(guī)范化技術(shù)提取制備的現(xiàn)代化中藥制劑，具有制備工藝先進(jìn)、質(zhì)量穩(wěn)定、提取效率高、使用和攜帶方便等優(yōu)勢，在多個醫(yī)療機構(gòu)的藥學(xué)部門均有較為廣泛的應(yīng)用[7-8]。但目前為止，使用配方顆粒直接混合調(diào)配和全方飲片煎煮后制粒所得的仲歸顆粒是否存在差異，并未進(jìn)行明確的研究[9-10]。本文擬從兩種方法制備的該制劑中京尼平苷酸和阿魏酸的含量著手，基于含量測定結(jié)果，研究上述工藝所得成品是否存在明顯差異，并根據(jù)結(jié)果，結(jié)合效率、性價比等因素，評價其各自的特點和優(yōu)劣。

1 儀器、試劑和材料

1.1 儀器設(shè)備 含量測定使用Waters2695e 高效液相色譜儀，購自美國Waters 公司，配置為光電二極管陣列（PAD）檢測器，柱溫箱，自動進(jìn)樣器；對照品、樣品稱量使用電子精密分析天平購自瑞士Mettler-Toledo 公司；供試品制備用QS-3000 數(shù)顯溫控超聲清洗儀購自昆山超聲儀器廠。

1.2 試劑、試藥和材料 阿魏酸（批號：110773-201915）和京尼平苷酸對照品（批號：111828-201805）購自中國食品藥品檢定研究院。色譜分析用甲醇、乙腈、磷酸購自德國Sigma-Alderich 公司，試驗用超純水購自Watsons；水煎液制粒法使用的各藥味飲片購自廣東康美藥業(yè)股份有限公司；配方顆粒調(diào)配法使用的各藥味配方顆粒購自廣東一方制藥股份有限公司。

2 方法和結(jié)果

2.1 樣品制備 取處方量杜仲、當(dāng)歸、黃芪等仲歸顆粒各藥味飲片，加30 倍量水提取兩次，每次60min，所得煎液合并、濾過，濃縮成稠膏后，加淀粉、糊精等輔料制粒，即得飲片水煎液配制的仲歸顆粒；另取同生藥量的配方顆粒，過篩混勻，即得配方顆粒調(diào)配的仲歸顆粒。精密稱取上述兩種顆粒各約2g，轉(zhuǎn)移至25mL量瓶中，加50%甲醇振搖溶解，繼續(xù)加入該溶劑定容至刻度，密塞，所得溶液超聲處理30min，取出放冷后，加50%甲醇定容至刻度，再使用0.45μm 微孔濾膜濾過，取續(xù)濾液作為供試品溶液。

2.2 對照品溶液制備 取京尼平苷酸和阿魏酸對照品，各精密稱取約5mg，分別轉(zhuǎn)移至5mL 量瓶中，加甲醇溶解后定容至刻度，即得兩種對照品含量均為1mg/mL的對照品溶液。

2.3 樣品測定方法 參考文獻(xiàn)方法并進(jìn)行適當(dāng)修改[10]，吸取供試品和對照品溶液，使用色譜柱為Waters XDB C18（柱長250mm，直徑4.6mm，粒徑5μm），流動相使用乙腈（A）-0.1%磷酸（B），使用梯度洗脫，程序為：0～10min，10%-15%A；10～20min，15%-50%A；20～25min，50%-90%A；25～30min，90%-10%A；后運行10min；流速1.0mL/min，檢測波長238nm（0～10min）、316nm（10～30min），柱溫25℃，進(jìn)樣量10μL。記錄所得色譜圖，以及京尼平苷酸和阿魏酸的峰面積，對照品和供試品色譜圖見圖1。

圖1 對照品和供試溶液色譜圖（對照品溶液中京尼平苷酸和阿魏酸濃度均為100μg/mL）

2.4 樣品測定方法學(xué)考察

2.4.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線和線性 精密吸取京尼平苷酸和阿魏酸對照品溶液，分別吸取1mL，轉(zhuǎn)移至同一5mL量瓶中，混勻后加甲醇定容至刻度，得兩種成分濃度均為200μg/mL 的混合對照品溶液；取上述溶液，逐級稀釋，分別制得京尼平苷酸和阿魏酸濃度均為100、50、20、10、5μg/mL 的溶液。吸取上述溶液，使用“2.3”所述HPLC 方法測定京尼平苷酸和阿魏酸峰面積，以該值為縱坐標(biāo)，濃度為橫坐標(biāo)，進(jìn)行線性回歸，結(jié)果得京尼平苷酸的回歸方程為y=7066.1x-4119.3（r2=0.9998），阿魏酸的回歸方程為y=14287x+26741（r2=0.9991）。上述結(jié)果表明，方法線性良好，能夠在5～200μg/mL濃度范圍內(nèi)對京尼平苷酸和阿魏酸進(jìn)行準(zhǔn)確測定。

2.4.2 精密度考察 使用飲片煎液配制的仲歸顆粒所制備的供試品溶液（下同），使用“2.3”所述HPLC方法連續(xù)測定6次，記錄京尼平苷酸和阿魏酸峰面積，計算峰面積的RSD。結(jié)果顯示，阿魏酸峰面積的RSD 為0.36%，京尼平苷酸為1.32%；經(jīng)檢索2020 年版《中國藥典》，上述數(shù)值符合規(guī)定，表明方法精密度良好。

2.4.3 重復(fù)性考察 按“2.1”所述方法平行制備6份仲歸顆粒供試品溶液，使用“2.3”所述HPLC 方法測定，記錄京尼平苷酸和阿魏酸峰面積，計算各自含量及其RSD。結(jié)果顯示，京尼平苷酸為1.37%，阿魏酸含量的RSD 為0.38%；經(jīng)檢索2020年版《中國藥典》，上述數(shù)值符合規(guī)定，表明方法重復(fù)性良好。

2.4.4 穩(wěn)定性考察 將供試品溶液放置在自動進(jìn)樣器中，分別在放入后0、2、4、6、8、12h 使用“2.3”所述HPLC 方法測定，記錄京尼平苷酸和阿魏酸峰面積，計算各自含量及其RSD。結(jié)果顯示，京尼平苷酸含量的RSD 為2.36%，阿魏酸為0.20%；經(jīng)檢索2020 年版《中國藥典》，上述數(shù)值符合規(guī)定，表明方法所制備樣品在12h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.4.5 回收率測定 取仲歸顆粒1g，置于25mL 兩瓶中，精密加入對照品溶液適量（加入濃度見表1、表2），繼續(xù)按“2.1”所述方法制備供試品溶液，再使用“2.3”所述HPLC 方法測定，記錄京尼平苷酸和阿魏酸峰面積，計算各自含量、回收率及其RSD。結(jié)果顯示，京尼平苷酸的平均回收率為99.41%，回收率的RSD 為3.43%；阿魏酸的平均回收率為98.26%，回收率的RSD 為3.22%；經(jīng)檢索2020 年版《中國藥典》，上述數(shù)值符合規(guī)定，表明方法準(zhǔn)確度良好。

表1 京尼平苷酸回收率測定結(jié)果（n=3）

2.5 兩方法樣品測定 按“2.1”項下方法分別制備和調(diào)配仲歸顆粒樣品各10 批（詳見表3），按“2.3”所述HPLC 方法測定，記錄京尼平苷酸和阿魏酸峰面積，計算各自含量。結(jié)果顯示，10 批飲片煎液制備的仲歸顆粒中，京尼平苷酸的含量為0.1758～0.1942mg/g，阿魏酸的含量為0.4036～0.4987mg/g；10批配方顆粒調(diào)配的仲歸顆粒中，上述兩種成分的含量分別為0.1383～0.1894mg/g 和0.3126～0.4650mg/g。

表3 飲片煎液配制和配方顆粒調(diào)配的仲歸顆粒京尼平苷酸和阿魏酸含量測定結(jié)果

2.6 數(shù)據(jù)處理和統(tǒng)計分析 根據(jù)“1.4”項下所得含量測定結(jié)果，計算兩種方法制備的仲歸顆粒的含量，將所得含量數(shù)據(jù)導(dǎo)入SPSS 24.0 軟件中，數(shù)據(jù)呈現(xiàn)形式為平均值±標(biāo)準(zhǔn)差；對兩組數(shù)據(jù)進(jìn)行Student-T檢驗，分別比較各組樣品中阿魏酸與京尼平苷酸含量總和的差異；同時，對兩個指標(biāo)性成分也分別進(jìn)行Student-T 檢驗，研究單成分組與組之間差異。對兩種方法制備的10 批樣品進(jìn)行Student-T檢驗結(jié)果顯示，飲片煎液配制法和配方顆粒調(diào)配法所得樣品中，以每一批樣品阿魏酸和京尼平苷酸含量總和計，兩種方法所得結(jié)果無顯著性差異（P＞0.05）；但對兩種成分分開檢驗的結(jié)果則顯示，兩種方法所得樣品中阿魏酸和京尼平苷酸的含量均存在顯著性差異（P＜0.05）。

3 討論

根據(jù)含量測定結(jié)果，可知兩種方法制備樣品中目標(biāo)成分的含量無明顯差異，但飲片混合煎煮法所得顆粒含量相對較為接近。由“2.2”項下結(jié)果可知，單成分比較時，兩種方法存在組間顯著性差異。其可能的原因是當(dāng)使用兩種指標(biāo)性成分的加和值進(jìn)行統(tǒng)計分析時，由于數(shù)值增大，數(shù)值差異所占比例減小，因此導(dǎo)致T 檢驗無法得出顯著性差異的結(jié)果；而當(dāng)分開計算時，數(shù)值相對較小，各組對應(yīng)樣品間差異值占比增加，因此能夠發(fā)現(xiàn)顯著性差異。綜合上述結(jié)果，可知兩種制備方法導(dǎo)致指標(biāo)性成分差異明顯的原因，可能是直接使用配方顆?；旌希脴悠方?jīng)篩分后不同程度存在損失的情況。同時混合過程中顆粒難以攪拌均勻，導(dǎo)致各批次樣品差異較大[7-8]。上述情況在未開發(fā)仲歸顆粒，該方以配方顆粒配制時也存在。由于調(diào)配后由患者自行沖服，受其依從性和相關(guān)操作影響，仲歸顆粒調(diào)配和使用的穩(wěn)定性、均一性更無法保證。由于使用飲片同時煎煮提取后再將浸膏制粒時，各藥味中的活性成分均溶于統(tǒng)一分散系統(tǒng)中，在轉(zhuǎn)移、合并、濃縮過程中，上述成分不易丟失，因此均一性和穩(wěn)定性較好[9]。

綜上所述，雖然從成本和含量等方面分析，配方顆粒直接混合調(diào)配仲歸顆粒時，與飲片水提液制粒主要指標(biāo)性成分濃度范圍接近，且前者方法更為簡便，但從成品質(zhì)量穩(wěn)定性的角度考慮，后者仍較為適宜。上述研究結(jié)果，除為仲歸顆粒的制備工藝提供了科學(xué)依據(jù)外，進(jìn)一步證明了該制劑的開發(fā)和制備價值。