黃偉欣，鐘惠嫻，胥愛麗,3，李素梅,3，李養(yǎng)學(xué),3

（1.廣東省第二中醫(yī)院（廣東省中醫(yī)藥工程技術(shù)研究院），廣東廣州 510095；2.廣州中醫(yī)藥大學(xué)，廣東廣州 510405；3.廣東省中醫(yī)藥研究開發(fā)重點實驗室，廣東廣州 510095）

醒神復(fù)元合劑為廣東省第二中醫(yī)院的特色制劑之一，由石菖蒲、白芍、當(dāng)歸、制何首烏、陳皮、法半夏、瓜蔞子、萊菔子、黃芪、珍珠母等10味中藥制成，全方共奏補氣活血，化痰通腑之功效，此方祛邪不傷正，扶正而不戀邪，用于治療氣虛痰瘀證型中風(fēng)后遺癥患者，不失為一首有效的經(jīng)驗方。原質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究中僅對君藥石菖蒲、臣藥當(dāng)歸運用薄層色譜法（TLC）進(jìn)行定性鑒別，卻沒有對主要藥效成分進(jìn)行含量測定。該制劑的君藥為白芍，具有養(yǎng)血斂陰，平抑肝陽的功效，臨床上用于中風(fēng)后氣血兩虛、痰蒙清竅證昏迷等癥[1]。其中芍藥苷是藥材白芍的主要藥效成分，具有鎮(zhèn)靜抗炎鎮(zhèn)痛、抗抑郁、調(diào)節(jié)免疫、心臟保護(hù)等多種藥理作用[2～3]。因此，為進(jìn)一步加強(qiáng)對醒神復(fù)元合劑的質(zhì)量控制，提升醒神復(fù)元合劑的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)，保證該制劑臨床用藥的安全、有效性，本課題對方中君藥石菖蒲、臣藥當(dāng)歸的薄層鑒別方法進(jìn)行了優(yōu)化，并增加了君藥白芍及臣藥陳皮的薄層鑒別。該制劑的君藥為白芍，其中芍藥苷是藥材白芍的主要藥效成分，具有鎮(zhèn)靜抗炎鎮(zhèn)痛、抗抑郁、調(diào)節(jié)免疫、心臟保護(hù)等多種藥理作用[2-3]，將芍藥苷作為醒神復(fù)元合劑的指標(biāo)成分并建立高效液相色譜峰（HPLC）對其含量進(jìn)行測定，完善醒神復(fù)元合劑的質(zhì)量控制標(biāo)準(zhǔn)。

1 儀器與試藥

1.1 儀器 澳華HH-2恒溫水浴鍋（常州金壇良友儀器有限公司）；RE-52AA型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（上?？婆d儀器有限公司）；卡瑪ATS4自動點樣器（瑞士CAMAG公司）；卡瑪TLC成像系統(tǒng)（瑞士CAMAG公司）；雙杰JJ500電子天平（常熟市雙杰測試儀器廠）；TLE-204梅特勒托利多分析天平（瑞士梅特勒托利多公司）；安捷倫高效液相色譜儀（型號：1260/1200，美國安捷倫公司）。

1.2 試劑 石菖蒲對照藥材（批號：121098-201807）、當(dāng)歸對照藥材（批號：120927-201617）、白芍對照藥材（批號：121905-201610）、陳皮對照藥材（批號：120969-201510）、芍藥苷（批號：110736-201943，質(zhì)量分?jǐn)?shù)95.1%），均購買自中國食品藥品檢定研究院。乙腈、乙醇為Merck色譜純試劑，液相用水為屈臣氏飲用水，三氯甲烷、乙酸乙酯、甲醇等其他試劑為分析純。

1.3 分析樣品 醒神復(fù)元合劑（250mL/瓶，批號分別為（20190103、20190601、20200503），均由廣東省第二中醫(yī)院制劑室生產(chǎn)提供。

2 方法與結(jié)果

2.1 TLC鑒別

2.1.1 石菖蒲鑒別 取醒神復(fù)元合劑10mL，用稀鹽酸調(diào)pH值至2～3，高速離心（3000r/min）5min，取上清液，加乙醚20mL振搖提取2次，合并上層乙醚提取液，水浴蒸干提取液，殘渣中加入1mL甲醇使溶解作為石菖蒲供試品溶液。另取石菖蒲對照藥材1g，加實驗用水50mL，煮沸，微沸30min，趁熱用紗布過濾，濾液放冷至室溫，用稀鹽酸調(diào)pH值至2～3，同法制成石菖蒲藥材溶液。分別吸取上石菖蒲述供試品溶液5μL，石菖蒲對照藥材溶液10μL，用Cyciohexane-乙酸乙酯（8:3）為展開劑，展開，取出，熱風(fēng)吹干，放置約1小時至日光下斑點顯色清晰。在365nm下，石菖蒲供試品色譜中，在與石菖蒲對照藥材色譜相應(yīng)的位置上，出現(xiàn)相同的熒光斑點，說明此方法可行。

2.1.2 當(dāng)歸鑒別 取石菖蒲項下處理的石菖蒲供試品溶液作為當(dāng)歸的供試品溶液。另取當(dāng)歸對照藥材1g，移取50mL 1%碳酸氫鈉溶液，超聲處理10min，高速離心（3000r/min）5min，取上清液，用稀鹽酸調(diào)pH值至2～3，同法制成當(dāng)歸藥材溶液。將上述當(dāng)歸對照品溶液、當(dāng)歸對照藥材溶液各吸取10μL，以Cyciohexane-乙酸乙酯（8:3）為展開劑，展開，取出，室溫下自然晾干。在365nm下，當(dāng)歸供試品在與當(dāng)歸對照藥材相應(yīng)位置的色譜圖中，顯相同的熒光斑點，說明此方法可行。

2.1.3 白芍鑒別 取醒神復(fù)元合劑10mL，通過D101型大孔吸附樹脂柱（內(nèi)徑1.5cm，柱高為10cm），用水洗至無色，然后用20%乙醇100mL洗脫，流速1滴/秒，收集20%乙醇洗脫液，水浴蒸干，殘渣加1mL甲醇作為白芍供試品溶液。另取白芍對照藥材1g，加甲醇20mL，振搖5min，棉花濾過，濾液水浴蒸干，殘渣加1mL甲醇作為白芍藥材溶液。吸取白芍供試品溶液、白芍對照藥材溶液各10μL，以Chioroform-乙酸乙酯-Methanol-甲酸（40:5:10:0.2）為展開劑，展開，取出，熱風(fēng)吹干，然后均勻噴以5%香草醛硫酸溶液在薄層板上，105℃烘至斑點顯色清晰。在日光下，白芍供試品在與白芍對照藥材相應(yīng)位置的色譜圖中，顯相同的熒光斑點，說明此方法可行。

2.1.4 陳皮鑒別 取醒神復(fù)元合劑10mL，水浴蒸至近干加適量硅藻土混勻，蒸干加入20mL乙酸乙酯，超聲10min，濾過，濾液水浴蒸干，殘渣中加入1mL甲醇作為陳皮供試品溶液。另取陳皮對照藥材1g，加水50mL，煮沸，微沸30min，趁熱用紗布過濾，水浴蒸至近干加適量硅藻土混勻，蒸干加入20mL乙酸乙酯，同法制成陳皮藥材溶液。吸取上述陳皮供試品溶液、陳皮對照藥材溶液各10μL，以Toluene-乙酸乙酯（3:2）為展開劑，發(fā)現(xiàn)陳皮供試品色譜與陳皮對照藥材色譜對應(yīng)良好，斑點清晰，分離度好，說明此方法可行。見圖1。

2.2含量測定

2.2.1 色譜條件 色譜柱：PhenomenexKinetex XB C18（5μm，4.6×250mm）；流動相：Acetonitrile-0.1%磷酸溶液（15：85）；柱溫：25℃；流速：1.0mL/min；進(jìn)樣量：10μL；檢測波長：230nm；理論塔板數(shù)不低于2000，進(jìn)樣量10μL。

2.2.2 對照品溶液的制備 精密稱定芍藥苷對照品3.15mg于50mL容量瓶中，通過公式計算需要稀釋的倍數(shù)，加甲醇定容，制成每1mL含59.91μg的溶液，即得。

2.2.3 供試品溶液的制備 拿單標(biāo)移液管取本品約5mL，置50mL量瓶中，加50%乙醇溶液稀釋至刻度，混勻，超聲處理（功率240W，頻率45kHz）5min，放冷，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，即得。

2.2.4 陰性樣品溶液的制備 按照醒神復(fù)元合劑的配方，除去白芍后剩下的九味藥材進(jìn)行煎煮，然后制成陰性對照樣品溶液。

2.2.5 專屬性試驗 將上述溶液各取10μL，按“2.2.1”項下的條件進(jìn)樣，結(jié)果表明，陰性對照溶液色譜圖中芍藥苷峰處無干擾，說明其他藥材對芍藥苷的測定無干擾，見圖2。

圖2 醒神復(fù)元合劑高效液相圖譜

2.2.6 線性關(guān)系考察 用刻度移液管分別精密吸取不同體積芍藥苷對照品溶液適量，置10mL量瓶中，用甲醇定容，搖勻，上下倒置搖勻，制得標(biāo)準(zhǔn)曲線的六個不同濃度的芍藥苷溶液，分別精密吸取10μL，注入液相色譜儀，按“2.2.1”項下色譜條件進(jìn)行測定，分別進(jìn)樣10μL，以芍藥苷對照品μg/mL為橫坐標(biāo)（X），測定的峰面積為縱坐標(biāo)（Y），繪制芍藥苷標(biāo)準(zhǔn)曲線，計算回歸方程，得線性回歸方程為Y=13733.1733X+6982.7718，r=0.9999(n=6)。結(jié) 果 見表1。

表1 芍藥苷標(biāo)準(zhǔn)曲線

2.2.7 精密度試驗 取芍藥苷對照品溶液，并按“2.2.1”項下色譜條件連續(xù)進(jìn)樣6次，計算得到芍藥苷峰面積的RSD為1.92%，表明儀器精密度良好。

2.2.8 穩(wěn)定性試驗 取同一批醒神復(fù)元合劑供試品（S2），按“2.2.2”項下方法制備供試品溶液，并按“2.2.1”項下色譜條件分別于0、2、4、6、8、10、12h進(jìn)樣測定，計算得到峰面積的RSD為1.20%，表明供試品溶液在12 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.2.9 重復(fù)性試驗 取同一批醒神復(fù)元合劑供試品（S2），按“2.2.2”項下方法平行制備6份供試品溶液，并按“2.2.1”項下色譜條件依次進(jìn)樣測定，計算得到芍藥苷含量的RSD為1.43%，表明該方法重復(fù)性良好。

2.2.10 加樣回收率試驗 取同一批醒神復(fù)元合劑供試品（S2）約2.5mL，精密稱定6份，分別置50mL量瓶中，加入各對照品適量，按“2.2.2”項下方法制備供試品溶液，按“2.2.1”項下色譜條件依次測定，計算得到平均加樣回收率分別為96.75%，RSD分別為1.22%，見表2。

表2 醒神復(fù)元合劑芍藥苷平均加樣回收率測定結(jié)果（n=2）

2.2.11 樣品測定結(jié)果 取3批醒神復(fù)元合劑樣品，按“2.2.2”項下方法制備樣品溶液，按“2.2.1”項下色譜條件進(jìn)行測定，計算樣品中芍藥苷的含量，結(jié)果見表3。

表3 不同批次醒神復(fù)元合劑芍藥苷含量測定結(jié)果

3 討論

3.1 定性鑒別藥材選擇 原標(biāo)準(zhǔn)石菖蒲TLC項下，供試品的處理加石油醚（60～90℃）振搖提取，以石油醚（60～90℃）-乙酸乙酯（4:1）為展開劑，碘蒸氣熏后，置紫外光燈（365nm）下檢視，供試品色譜與對照藥材色譜有斑點對應(yīng)，但斑點較模糊。參考相關(guān)文獻(xiàn)，本研究根據(jù)石菖蒲所含化學(xué)成分的理化性質(zhì)，供試品用稀鹽酸調(diào)pH值至2～3，加乙醚振搖提取，以環(huán)己烷-乙酸乙酯（8:3）為展開劑，展開，取出，晾干，放置約1小時至斑點顯色清晰，置紫外光燈（365nm）下檢視。結(jié)果顯示，供試品色譜中，在與對照藥材色譜相應(yīng)的位置上，顯相同顏色的熒光斑點，且制備的石菖蒲供試品溶液可繼續(xù)為白芍TLC鑒別所用。原標(biāo)準(zhǔn)當(dāng)歸TLC項下，供試品用稀鹽酸調(diào)pH值至2～3，用乙醚振搖提取，以環(huán)己烷-二氯甲烷-乙酸乙酯-甲酸（4:1:1:0.1）為展開劑，置紫外光燈（365nm）下檢視。結(jié)果表明，供試品色譜在與對照藥材色譜相應(yīng)的位置上，顯相同顏色的熒光斑點，陰性對照無干擾，但供試品色譜的斑點有拖尾現(xiàn)象；將展開劑更換為環(huán)己烷-乙酸乙酯（8:3），結(jié)果供試品色譜在與對照藥材色譜相應(yīng)的位置上，顯相同顏色的熒光斑點，各斑點分布均勻，主斑點更清晰。采用薄層色譜法對醒神復(fù)元合劑中的君藥石菖蒲、白芍、臣藥當(dāng)歸與陳皮進(jìn)行定性鑒別，斑點分離清晰，陰性對照無干擾，專屬性強(qiáng)，重復(fù)性好，可作為醒神復(fù)元合劑有效的定性鑒別研究。曾考察不同藥材的TLC，其中制何首烏、法半夏、黃芪陰性有干擾，故未列入質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)；瓜蔞子、萊菔子、珍珠母未檢出相應(yīng)斑點，未納入質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)。

3.2 含量測定成分選擇 醒神復(fù)元合劑中君藥白芍具有養(yǎng)血調(diào)經(jīng)、柔肝止痛、斂陰止汗的功效，是臨床上最常用的中藥之一，主要成分包括揮發(fā)油類、單帖類、三萜類、黃酮類化合物等[2-4]。其中，含量較高的成分芍藥苷是白芍發(fā)揮功效的主要活性成分，具有抗抑郁、抗炎、鎮(zhèn)痛、保肝等藥理作用。芍藥苷具有明顯的抗抑郁作用，其機(jī)制可能與其下調(diào)大腦皮質(zhì)及海馬組織中NO/cGMP通路有關(guān)。除此之外，芍藥苷還可通過免疫調(diào)節(jié)作用治療常見的多發(fā)性硬化癥[8-11]。綜合考慮，選擇芍藥苷作為醒神復(fù)元合劑含量測定控制指標(biāo)。按本標(biāo)準(zhǔn)擬定的方法對3批醒神復(fù)元合劑樣品進(jìn)行測定，結(jié)果顯示芍藥苷含量均約等于0.78mg/mL，說明同一廠家生產(chǎn)的樣品，芍藥苷的含量接近，生產(chǎn)工藝穩(wěn)定。經(jīng)過對3批樣品的含量測定結(jié)果分析，增加芍藥苷的含量測定項目對提升醒神復(fù)元合劑的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)有必要，通過標(biāo)準(zhǔn)提升反饋與廠家，促使廠家自覺主動改進(jìn)生產(chǎn)工藝，嚴(yán)控原藥材的質(zhì)量，有利于控制產(chǎn)品質(zhì)量，保證產(chǎn)品的有效性。

3.3 方法評價 本試驗中建立了醒神復(fù)元合劑中君藥石菖蒲、白芍，臣藥白芍、陳皮的定性鑒別及主要有效成分芍藥苷的含量測定方法，經(jīng)方法學(xué)驗證，所建立的方法精密度高，重復(fù)性好，穩(wěn)定可靠，可用于醒神復(fù)元合劑的質(zhì)量控制。