放射治療是治療惡性腹部疾病的重要手段，然而，它不可避免地會(huì)對(duì)器官造成損害(如放射性肝纖維化)，有時(shí)甚至是致命的

。放射性肝損傷是放射治療和輻射事故的潛在后遺癥。輻射致肝損傷的晚期后遺癥包括實(shí)質(zhì)細(xì)胞嚴(yán)重枯竭，中央靜脈和導(dǎo)管周圍的纖維組織明顯增多

。因此，開(kāi)發(fā)新的預(yù)防策略對(duì)于改善輻射致肝損傷具有重要意義。越來(lái)越多的證據(jù)表明，煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸氧化酶4(NOX4)在肝星狀細(xì)胞和肝細(xì)胞中高表達(dá)，敲低NOX4可抑制氧化應(yīng)激的產(chǎn)生，降低α-平滑肌肌動(dòng)蛋白(α-SMA)的表達(dá)，從而抑制肝纖維化進(jìn)展

。自噬是一種高度保守的代謝過(guò)程，它消除受損成分以維持正常的細(xì)胞內(nèi)穩(wěn)態(tài)，并通過(guò)分解細(xì)胞內(nèi)成分作為替代能源

。最近研究表明，在四氯化碳(CCl

)誘導(dǎo)的急、慢性肝損傷模型中，肝組織自噬活性增強(qiáng)。使用自噬抑制劑或者敲除自噬相關(guān)基因7(ATG7)可抑制肝星狀細(xì)胞激活，導(dǎo)致肝纖維化進(jìn)程受阻

。芍藥苷是我國(guó)傳統(tǒng)中藥芍藥的主要活性成分。芍藥苷具有突出的肝保護(hù)功效，能減輕曼氏血吸蟲(chóng)病肝損傷后肝纖維化

。因此，芍藥苷可能在放射性肝纖維化中具有重要作用。本研究旨在探究芍藥苷對(duì)放射性肝纖維化的作用及其作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 45只SPF級(jí)雄性SD大鼠，體質(zhì)量(200±20)g，飼養(yǎng)在溫度(23±2)℃、濕度(58±2)%、光照可控(12 h光/暗周期)的環(huán)境下，所有大鼠自由進(jìn)食和飲水。待所有大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后，進(jìn)行造模操作。

2.1.1 A組:每天給予患者常規(guī)構(gòu)音障礙康復(fù)練習(xí),每日1次,每次20分鐘,每周5次,持續(xù)2周。B組:在A組基礎(chǔ)上聯(lián)合針灸,每日針灸1次,1次針灸治療(20分鐘),每周五天,持續(xù)2周。

1.2 主要材料 芍藥苷(純度≥98%)購(gòu)自成都德思特生物技術(shù)有限公司；復(fù)方鱉甲軟肝片購(gòu)自內(nèi)蒙古福瑞醫(yī)療科技股份有限公司；Masson三色染色試劑盒購(gòu)自南京森貝伽生物科技有限公司；丙二醇(MDA)檢測(cè)試劑盒和谷胱甘肽(GSH)檢測(cè)試劑盒購(gòu)自北京雷根生物技術(shù)有限公司；超氧化物歧化酶(SOD)活性檢測(cè)試劑盒購(gòu)自北京索萊寶科技有限公司；α-SMA、collagenⅠ和fibronectin抗體購(gòu)自英國(guó)Abcam公司； Bax、Bcl-2和NOX4抗體購(gòu)自美國(guó)GeneTex； Beclin1、LC3和p62抗體購(gòu)自美國(guó)Cell Signaling Technology；GAPDH抗體購(gòu)自武漢三鷹生物技術(shù)有限公司。

1.3 動(dòng)物分組、造模及給藥處理 造模前12 h，大鼠禁食不禁水。將45只SD大鼠隨機(jī)分為對(duì)照組、模型組、陽(yáng)性藥對(duì)照組、芍藥苷低劑量組和芍藥苷高劑量組，每組各9只。除對(duì)照組外，其余組均參照文獻(xiàn)

，建立肝纖維化模型。對(duì)照組大鼠只麻醉，不進(jìn)行照射。隨后陽(yáng)性對(duì)照組大鼠灌胃復(fù)方鱉甲軟肝片0.6 g/kg

，芍藥苷低劑量組灌胃芍藥苷0.1 g/kg，芍藥苷高劑量組灌胃芍藥苷0.2 g/kg

，對(duì)照組和模型組大鼠灌胃等量溶劑。所有大鼠每天給藥1次，連續(xù)給藥8周

。

OPNET采用離散事件驅(qū)動(dòng)的模擬機(jī)理和混合建模機(jī)制，并提供了包括模型設(shè)計(jì)、仿真和統(tǒng)計(jì)量收集、分析的各種研究工具，同時(shí)它還引入了面向?qū)ο蟮木幊碳夹g(shù)。OPNET的特點(diǎn)是建模方便，功能強(qiáng)大，尤其是在大規(guī)模網(wǎng)絡(luò)模擬中表現(xiàn)卓越。

1.4 HE染色檢測(cè)肝病理學(xué)變化 末次給藥結(jié)束后，所有大鼠禁食12 h，3%戊巴比妥鈉(50 mg/kg)腹腔注射麻醉大鼠，隨后處死大鼠，取肝臟。4%多聚甲醛固定組織24 h，梯度乙醇脫水，二甲苯透明。組織塊浸蠟、包埋。對(duì)包埋的組織塊進(jìn)行修塊后，切片機(jī)切片。最后將切片置于溫箱中烘干。石蠟切片二甲苯、梯度乙醇脫蠟至水，蒸餾水沖洗切片后，蘇木素染色液染色15 min，切片流水沖洗1 min，1%鹽酸乙醇分化3 s后，氨水返藍(lán)，伊紅染色液染色10 s后，流水沖洗。切片梯度乙醇脫水、二甲苯脫水透明。滴加中性樹(shù)膠至載玻片上封片，顯微鏡下觀察。

1.7 Western blot檢測(cè)α-SMA、collagenⅠ、fibronectin、Bax、Bcl-2、NOX4、Beclin1、LC3和p62蛋白表達(dá) 常規(guī)方法操作。

而實(shí)際上，林某強(qiáng)只是名義上承包了這個(gè)項(xiàng)目，真正負(fù)責(zé)人是林中偉。業(yè)主方城投公司將工程款結(jié)算給市建公司，市建公司扣除管理費(fèi)后再打到林某強(qiáng)的個(gè)人銀行賬戶，林某強(qiáng)的這個(gè)銀行賬戶由林中偉公司的財(cái)務(wù)負(fù)責(zé)人保管。這個(gè)工程的利潤(rùn)一部分用于林中偉公司的開(kāi)支，一部分用于林中偉個(gè)人的開(kāi)支。

1.8 試劑盒檢測(cè)血清MDA、GSH和SOD水平 按照試劑盒說(shuō)明書(shū)所示，檢測(cè)血清中MDA、GSH和SOD水平。

1.5 全自動(dòng)生化儀檢測(cè)血清生化指標(biāo) 末次給藥結(jié)束后，所有大鼠禁食12 h，3%戊巴比妥鈉(50 mg/kg)腹腔注射麻醉大鼠，腹主動(dòng)脈采血，室溫靜置20 min后，12 000 rpm離心20 min取上層血清。采用全自動(dòng)生化儀檢測(cè)血清谷丙轉(zhuǎn)氨酶(ALT)、谷草轉(zhuǎn)氨酶(AST)和堿性磷酸酶(ALP)水平。

1.6 Masson染色檢測(cè)膠原沉積 常規(guī)方法操作。

2.5 芍藥苷對(duì)大鼠自噬的影響 見(jiàn)圖6、表6。

2 結(jié)果

2.1 芍藥苷對(duì)大鼠肝病理學(xué)變化和生化指標(biāo)的影響 對(duì)照組大鼠肝組織無(wú)明顯異常，肝小葉結(jié)構(gòu)完整清晰，肝細(xì)胞排列整齊，呈索狀分布，未見(jiàn)不規(guī)則血竇，匯管區(qū)無(wú)擴(kuò)大，未見(jiàn)藍(lán)色著染膠原沉積；與對(duì)照組相比，模型組大鼠肝細(xì)胞腫脹，胞漿疏松，放射肝索排列紊亂，肝小葉結(jié)構(gòu)受損，在肝小葉中央和匯管區(qū)有大量藍(lán)色著染膠原產(chǎn)生，肝臟/體重比顯著升高(

<0.05)，血清ALT、AST、ALP水平以及α-SMA、collagenⅠ和fibronectin蛋白表達(dá)顯著升高(

<0.05)；與模型組比較，陽(yáng)性藥對(duì)照組、芍藥苷低劑量組和芍藥苷高劑量組大鼠肝組織病理學(xué)變化得到明顯改善，肝臟/體重比顯著降低(

<0.05)，血清ALT、AST、ALP水平以及α-SMA、collagenⅠ和fibronectin蛋白表達(dá)顯著降低(

<0.05)，其中芍藥苷的作用呈劑量依賴性。見(jiàn)圖1～ 3，表1、 2。

2.4 芍藥苷對(duì)大鼠氧化應(yīng)激的影響 見(jiàn)表5。

房間的頂是星空以后，劉必芒又突發(fā)奇想，說(shuō)這樣，要充分體現(xiàn)這個(gè)星空包房的的主題，不光星星是星星，明星也是星星，所以，在墻壁上要貼滿明星們的臉的照片，而且要注意剪裁，只要他們的臉，這就能讓人徹底感覺(jué)這個(gè)包廂星光熠熠。

2.3 芍藥苷對(duì)大鼠NOX4蛋白表達(dá)的影響 見(jiàn)圖5、表4。

2.2 芍藥苷對(duì)大鼠細(xì)胞凋亡的影響 見(jiàn)圖4、表3。

3 討論

肝臟非實(shí)質(zhì)細(xì)胞，如枯否細(xì)胞、肝竇內(nèi)皮細(xì)胞和肝星狀細(xì)胞是已知的放射敏感性細(xì)胞。這些細(xì)胞釋放促進(jìn)肝纖維化的各種物質(zhì)，在放射過(guò)程中導(dǎo)致肝臟結(jié)構(gòu)和功能扭曲

。放射性治療還可導(dǎo)致肝實(shí)質(zhì)細(xì)胞死亡。眾所周知，肝細(xì)胞死亡是其他肝病進(jìn)展以及肝纖維化、肝硬化和肝細(xì)胞癌發(fā)展的最終驅(qū)動(dòng)力

。因此，阻斷或逆轉(zhuǎn)肝纖維化可能是阻止其發(fā)展為肝細(xì)胞癌的新方法。

在肝纖維化過(guò)程中，充滿薄層通透性結(jié)締組織的竇周間隙中肝星狀細(xì)胞被激活并分化為肌成纖維細(xì)胞(其特征是α-SMA和collagenⅠ表達(dá)上調(diào))，從而促進(jìn)肝纖維化

。此外，肝細(xì)胞凋亡是肝纖維化的主要特征之一。肝細(xì)胞凋亡主要受Bcl-2家族蛋白的調(diào)控，其中Bcl-2和Bax是重要的凋亡調(diào)控基因

。已有研究表明，海風(fēng)藤通過(guò)減輕氧化應(yīng)激、炎癥反應(yīng)和抑制肝細(xì)胞凋亡，改善CCl

誘導(dǎo)的肝損傷，抑制肝纖維化

。隨著世界中醫(yī)藥研究的發(fā)展，傳統(tǒng)藥用植物中的保肝藥物因其臨床療效好、副作用小而備受關(guān)注

。近年來(lái)的研究表明，芍藥苷具有廣泛的生物活性，包括保護(hù)肝臟、減輕膽汁淤積、減輕肝纖維化、預(yù)防非酒精性脂肪性肝病和多途徑抑制肝癌等

。已有證據(jù)顯示，芍藥苷可明顯降低放射性肝纖維化大鼠肝組織羥脯氨酸含量、血清轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β1、透明質(zhì)酸、collagenⅢ和fibronectin水平，減輕肝損傷和膠原沉積

。本研究結(jié)果顯示，芍藥苷給藥處理可明顯改善放射性肝纖維化大鼠肝組織病理學(xué)變化和膠原沉積，降低血清ALT、AST和ALP水平，提示芍藥苷可改善放射性肝纖維化大鼠肝功能。此外，芍藥苷給藥處理可抑制肝組織中α-SMA、collagenⅠ和fibronectin蛋白表達(dá)，抑制肝細(xì)胞中Bax蛋白表達(dá)，促進(jìn)Bcl-2蛋白表達(dá)，提示芍藥苷可通過(guò)抑制肝星狀細(xì)胞激活和肝細(xì)胞凋亡，改善大鼠肝纖維化。

蠹害事史遂讞、斬犯李棖審疑開(kāi)釋讞語(yǔ)、假中書(shū)高垌讞語(yǔ)、軍犯王養(yǎng)禛讞語(yǔ)、軍犯劉堯封胡詠?zhàn)椪Z(yǔ)、徒犯劉維坤讞語(yǔ)、人命事孫述孫府讞語(yǔ)、杖犯張森讞語(yǔ)。[29](P594)

氧化應(yīng)激參與纖維化疾病的發(fā)生發(fā)展。氧化應(yīng)激和活性氧的產(chǎn)生可能是肝星狀細(xì)胞激活和肝損傷的重要機(jī)制

。研究表明，NOX4是NOX家族亞型之一，抑制NOX4表達(dá)可明顯改善組織氧化應(yīng)激損傷，從而減輕細(xì)胞凋亡

。在肝纖維化的相關(guān)研究中，白花丹素通過(guò)下調(diào)NOX4蛋白表達(dá)抑制MDA水平，升高SOD和谷胱甘肽過(guò)氧化物酶(GSH-Px)水平，減輕CCl

誘導(dǎo)的肝纖維化

。同樣的，虎杖苷通過(guò)下調(diào)NOX4表達(dá)來(lái)降低非酒精性脂肪性肝炎大鼠氧化應(yīng)激，從而改善大鼠肝纖維化

。本研究結(jié)果顯示，芍藥苷可明顯降低肝纖維化大鼠NOX4蛋白表達(dá)，提示芍藥苷在放射性肝纖維化中的保護(hù)作用可能與改善組織氧化應(yīng)激損傷有關(guān)。進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，芍藥苷可降低放射性肝纖維化大鼠血清中MDA水平，升高GSH和SOD水平。提示芍藥苷可能通過(guò)下調(diào)NOX4蛋白表達(dá)從而抑制氧化應(yīng)激反應(yīng)，在肝纖維化中發(fā)揮保護(hù)作用。

自噬是哺乳動(dòng)物細(xì)胞內(nèi)成分降解和再循環(huán)的一種過(guò)程，在纖維化等許多病理過(guò)程中都有發(fā)現(xiàn)。關(guān)于肝臟，自噬被認(rèn)為在急性肝損傷和各種原因引起的慢性損傷的肝內(nèi)穩(wěn)態(tài)中扮演著不同的角色

。一方面，自噬激活對(duì)肝臟損傷有保護(hù)作用。在體內(nèi)研究中，用特異性抑制劑3-甲基腺嘌呤藥理上抑制自噬可顯著增加肝臟損傷

。另一方面，在大鼠模型中，炎癥反應(yīng)可介導(dǎo)自噬激活，從而促進(jìn)肝纖維化過(guò)程。人參皂苷Rg3通過(guò)抑制自噬改善硫代乙酰胺誘導(dǎo)的亞急性和慢性肝損傷引起的肝纖維化

。同樣的， Ye等

的研究也證明了自噬拮抗劑羥基氯喹通過(guò)抑制自噬和膠原沉積在肝纖維化大鼠中發(fā)揮抗纖維化作用。本研究結(jié)果顯示，肝纖維化大鼠肝組織中Beclin1和LC3Ⅱ/LC3Ⅰ蛋白表達(dá)上調(diào)，p62蛋白表達(dá)下調(diào)，肝組織中自噬被激活。而芍藥苷能明顯下調(diào)肝纖維化大鼠Beclin1和LC3Ⅱ/LC3Ⅰ蛋白表達(dá)，上調(diào)p62蛋白表達(dá)，從而抑制自噬過(guò)程，提示芍藥苷通過(guò)抑制自噬，在肝纖維化中發(fā)揮保護(hù)作用。

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