肝纖維化是由多種因素引起的肝臟疾病，持續(xù)的炎癥反應(yīng)會(huì)加速細(xì)胞外間質(zhì)成分的生成和沉積進(jìn)而促進(jìn)纖維化進(jìn)程，最終進(jìn)展為肝硬化

。肝纖維化最常見(jiàn)的原因是HBV感染，但是抗病毒藥物對(duì)于防治肝纖維化進(jìn)展療效有限

。Wnt/β-catenin通路與調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖和分化、維持機(jī)體內(nèi)穩(wěn)態(tài)環(huán)境等有關(guān)，有研究報(bào)道，cAMP反應(yīng)元件結(jié)合蛋白(CBP)/β-catenin相互作用的選擇性抑制劑(PRI-724)通過(guò)抑制肝臟星狀細(xì)胞活化和促進(jìn)巨噬細(xì)胞介導(dǎo)的炎癥消退，在小鼠肝纖維化模型中顯示出抗纖維化作用

。本研究擬探討Wnt/β-catenin通路相關(guān)蛋白在乙型肝炎肝纖維化進(jìn)程中的變化和臨床意義。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取2017年6月至2020年11月在我院就診的275例慢性HBV攜帶者或非活動(dòng)性乙型肝炎表面抗原(HBsAg)攜帶者(HBV組，

=130例)和慢性乙型肝炎(CHB)患者(

=145例)。慢性 HBV攜帶者為血清HBsAg和HBV DNA陽(yáng)性， HBeAg或HBeAb陽(yáng)性，轉(zhuǎn)氨酶在正常范圍(1年內(nèi)連續(xù)隨訪3次)， 肝組織學(xué)檢查一般無(wú)明顯異常。非活動(dòng)性HBsAg攜帶者為血清HBsAg陽(yáng)性，HBeAg陰性，HBV DNA低于檢測(cè)值下限， 轉(zhuǎn)氨酶在正常范圍(1年內(nèi)連續(xù)隨訪3次)， 肝組織學(xué)檢查一般無(wú)明顯異?；蛴休p微病變。CHB患者符合《慢性乙型肝炎防治指南》的診斷標(biāo)準(zhǔn)，HBsAg陽(yáng)性超過(guò)6個(gè)月，并通過(guò)肝活檢進(jìn)行組織病理學(xué)評(píng)估，其中29例患者未發(fā)生肝纖維化(CHB組)，另116例患者發(fā)生肝纖維化(肝纖維化組)。在肝活檢當(dāng)天收集足夠的血液標(biāo)本用于后續(xù)分析。排除合并甲型肝炎、丙型肝炎、丁型肝炎、戊型肝炎、自身免疫性肝病、肝臟毒性、酒精性肝病、阻塞性黃疸或肝癌患者。該研究獲我院機(jī)構(gòu)審查委員會(huì)批準(zhǔn)并征得了參與者的書(shū)面知情同意。

1.2 研究方法

所以在足球課教學(xué)中，首先要打好基礎(chǔ)，使學(xué)生的基本功漸于扎實(shí)，然后要安排各種活動(dòng)性游戲和接近比賽條件的練習(xí)。提高基本技術(shù)在比賽中的實(shí)踐能力，不僅會(huì)提升學(xué)生實(shí)踐的積極性，而且還能促進(jìn)學(xué)生將學(xué)習(xí)的知識(shí)應(yīng)用于實(shí)踐中，較快的形成自己的能力，從而使學(xué)生以較大的熱情投入到足球課的學(xué)習(xí)中。

通過(guò)運(yùn)用“行動(dòng)素理論”對(duì)趙五娘形象進(jìn)行分析，我認(rèn)為趙五娘更多的是一個(gè)被外界影響的人物，而不是一個(gè)影響外物的人物，因此，我將外界對(duì)她的態(tài)度作為核心故事元素，確立X為“鼓勵(lì)”，反X是“打擊”，非X是“不鼓勵(lì)”，反非X是“不打擊”。矩陣如下圖所示：

2.4 不同炎癥分級(jí)肝纖維化患者血清Wnt-3a、Wnt-5a、β-catenin、WISP-1、DKK-1水平比較 見(jiàn)表4。

這婚姻生活吧，有時(shí)候就像游戲關(guān)卡似的，每一個(gè)關(guān)卡比前面一個(gè)都更難，需要去一一面對(duì)和化解，但游戲的關(guān)卡是固定的，生活里卻有這樣那樣不確定因素，需要夫妻倆合力去克服，爭(zhēng)取在婚姻關(guān)卡里升級(jí)，一步步走向更好的未來(lái)。

1.2.2 肝纖維化分期和炎癥分級(jí) 根據(jù)2000年西安會(huì)議方案進(jìn)行肝纖維化組織學(xué)分期(S0～S4期)和炎癥分級(jí)(G0～G4)

。S0為無(wú)纖維化，S1～S2為輕中度纖維化，S3～S4為進(jìn)展期纖維化。

1.2.3 血清Wnt/β-catenin通路相關(guān)蛋白表達(dá)測(cè)定 患者在入組后禁食8 h以上，取靜脈血5 ml，進(jìn)行離心操作后取上層清液用于后續(xù)檢測(cè)。血清Wnt-3a、Wnt-5a、β-catenin、Wnt誘導(dǎo)分泌蛋白-1(WISP-1)、Wnt信號(hào)通路抑制分子Dickkopf-1(DKK-1)使用酶聯(lián)免疫吸附法進(jìn)行測(cè)定，試劑盒購(gòu)自武漢CUSABIO公司，操作過(guò)程根據(jù)試劑盒說(shuō)明書(shū)操作。

2 結(jié)果

2.5 肝纖維化患者血清Wnt-3a、Wnt-5a、β-catenin、WISP-1、DKK-1水平與肝功能和肝纖四項(xiàng)指標(biāo)的關(guān)系 經(jīng)Pearson法或Spearman法分析，血清Wnt-3a水平僅與CIV呈正相關(guān)性，血清Wnt-5a、WISP-1水平與ALT、PCⅢ、CIV、LN、HA呈正相關(guān)性，血清β-catenin與PCⅢ、CIV、LN、HA呈正相關(guān)性，而血清DKK-1水平與PCⅢ、CIV、LN呈負(fù)相關(guān)性(

<0.05)。見(jiàn)表5。

2.3 不同分期肝纖維化患者血清Wnt-3a、Wnt-5a、β-catenin、WISP-1、DKK-1水平比較 見(jiàn)表3。

當(dāng)線路短路故障引起斷路器跳閘后，負(fù)荷中無(wú)法自啟動(dòng)的設(shè)備應(yīng)自動(dòng)跳閘。而負(fù)荷中允許重新帶電的設(shè)備，則可以在斷路器重合成功后恢復(fù)供電。重合閘時(shí)間的整定主要取決于短路點(diǎn)電弧的去游離時(shí)間。用戶負(fù)荷中不能參加自啟動(dòng)的設(shè)備須自動(dòng)跳閘。允許重新帶電的負(fù)荷，在斷路器重合后恢復(fù)供電，重合閘時(shí)間主要決定于故障點(diǎn)去游離時(shí)間。

2.2 患者血清Wnt-3a、Wnt-5a、β-catenin、WISP-1、DKK-1水平比較 見(jiàn)表2。

1.2.1 實(shí)驗(yàn)室檢查 檢測(cè)血清氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(ALT)、天冬氨酸氨基轉(zhuǎn)氨酶(AST)、γ-谷氨酰轉(zhuǎn)肽酶(GGT)、堿性磷酸酶(ALP)、總蛋白、白蛋白、總膽紅素(TBil)、間接膽紅素(IBil)、PLT、 α-甲胎蛋白(AFP)、血清HBV感染標(biāo)志分子、肝纖維化標(biāo)志物。定量檢測(cè)HBsAg使用Elecsys HBsAg Ⅱ定量分析儀(德國(guó)羅氏診斷公司)和配套試劑進(jìn)行檢測(cè)；采用實(shí)時(shí)聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(QPCR)法檢測(cè)HBV DNA。采用化學(xué)發(fā)光法檢測(cè)血清肝纖維化標(biāo)志物水平。其他常規(guī)生化指標(biāo)用全自動(dòng)生化分析儀測(cè)定。

2.1 患者一般資料 見(jiàn)表1。

2.6 血清Wnt-5a、WISP-1、DKK-1水平對(duì)進(jìn)展期肝纖維化患者的診斷價(jià)值 經(jīng)ROC曲線分析，血清Wnt-5a、WISP-1、DKK-1水平診斷進(jìn)展期肝纖維化患者的曲線下面積分別為0.786(95%

：0.691～0.882)、0.957(95%

：0.917～0.997)、0.973(95%

：0.949～0.996)，截?cái)嘀捣謩e為220.85 pg/ml、82.34 ng/ml、0.25 ng/ml。見(jiàn)圖1。

2.7 單因素和多因素Logistic回歸模型分析血清Wnt-5a、WISP-1、DKK-1水平與肝纖維化進(jìn)展的關(guān)系 根據(jù)ROC曲線分析得到的最佳截?cái)嘀?，血清Wnt-5a≥220.85 pg/ml、血清WISP-1≥82.34 ng/ml、血清DKK-1≤0.25 ng/ml作為指標(biāo)異常。以是否進(jìn)展至S3～S4期作為因變量(發(fā)生=1，未發(fā)生=0)，將年齡、性別等一般資料和血清Wnt-5a、WISP-1、DKK-1異常表達(dá)情況作為自變量納入回歸模型，結(jié)果顯示，血清Wnt-5a、WISP-1、DKK-1標(biāo)記物異常和肥胖、吸煙史與肝纖維化進(jìn)展風(fēng)險(xiǎn)獨(dú)立相關(guān)(

<0.05)。見(jiàn)表6。

3 討論

HBV感染可導(dǎo)致多種肝臟疾病，包括急性和慢性乙型肝炎、HBV相關(guān)的肝硬化和肝細(xì)胞癌

。盡管已經(jīng)出現(xiàn)了有效的疫苗以及其他的疾病控制措施，但HBV相關(guān)慢性肝臟疾病仍然是一個(gè)嚴(yán)重的全球健康問(wèn)題。HBV相關(guān)肝纖維化進(jìn)展機(jī)制是復(fù)雜的，病毒和宿主因素都可以影響HBV感染導(dǎo)致的肝損傷結(jié)果。眾所周知，Wnt/β-catenin通路是肝癌發(fā)生、發(fā)展的重要機(jī)制，乙型肝炎病毒X蛋白(HBVx)蛋白和HBsAg可以作為致病因子參與Wnt/β-catenin通路的調(diào)節(jié)和誘導(dǎo)，從而促進(jìn)肝癌的發(fā)生

。一些研究也嘗試使用小分子靶向Wnt/β-catenin途徑作為肝癌治療的潛在應(yīng)用

。但是Wnt/β-catenin通路激活在HBV相關(guān)肝纖維化進(jìn)展中的作用研究尚處于起步階段。本研究發(fā)現(xiàn)，乙型肝炎肝纖維化患者血清Wnt-3a、Wnt-5a、β-catenin、WISP-1水平普遍升高，同時(shí)血清DKK-1水平則低于HBV組和CHB組患者；而且隨著肝纖維化疾病進(jìn)展，進(jìn)展期肝纖維化患者血清Wnt-5a、WISP-1水平高于輕中度纖維化患者，同時(shí)血清DKK-1水平低于輕中度纖維化患者；血清Wnt-5a、WISP-1水平升高和/或DKK-1水平降低是參與乙肝肝纖維化進(jìn)程的獨(dú)立危險(xiǎn)因素。

概念分層提供了有用的背景知識(shí)，有利于試驗(yàn)簡(jiǎn)明的高層術(shù)語(yǔ)表達(dá)發(fā)現(xiàn)模式，并有助于多個(gè)抽象層的知識(shí)挖掘。這實(shí)際上就是對(duì)多邊矩陣剖面的選擇。

Wnt/β-catenin通路與細(xì)胞的自我更新、增殖、分化、遷移等過(guò)程具有密切聯(lián)系，激活Wnt/β-catenin 信號(hào)通路與許多器官系統(tǒng)的纖維化有關(guān)，包括肺、腎、心臟、皮膚和肝臟

。小分子Wnt抑制劑在抗小鼠肺、腎和肝纖維化模型中被證明是非常有效的。例如Wnt/β-catenin信號(hào)通路阻斷特異性阻斷劑ICG-001可有效地抑制CBP/β-catenin相互作用減輕博萊霉素誘導(dǎo)的小鼠肺纖維化進(jìn)程

。此外，ICG-001還能改善單側(cè)輸尿管梗阻引起的小鼠腎臟纖維化和逆轉(zhuǎn)小鼠模型的晚期纖維化損傷

。最近的一項(xiàng)研究報(bào)道提出，CBP/β-catenin相互作用的選擇性抑制劑(PRI-724)通過(guò)抑制肝臟星狀細(xì)胞(HSCs)活化和促進(jìn)巨噬細(xì)胞介導(dǎo)的炎癥消退，在小鼠肝纖維化模型中顯示出抗纖維化作用

。這些發(fā)現(xiàn)都表明阻斷Wnt/β-catenin信號(hào)通路具有治療肝纖維化的潛力。肝臟受損后，HSCs被激活，炎癥細(xì)胞被吸收到損傷部位，以分泌大量促炎癥因子和促纖維化因子，這些細(xì)胞因子直接或間接地激活HSCs

。細(xì)胞外基質(zhì)成分，如膠原蛋白、纖維連接蛋白、彈性蛋白、層粘連蛋白和蛋白多糖等，通過(guò)活化的HSCs過(guò)度產(chǎn)生并在肝臟中大量積累。

朱其榮等

在總結(jié)多種信號(hào)傳導(dǎo)通路對(duì)肝纖維化的影響時(shí)發(fā)現(xiàn)，處于活化狀態(tài)的HSCs中，典型Wnt通路(β-catenin)和非典型Wnt通路(Wnt-5a)相關(guān)蛋白分子在轉(zhuǎn)錄和翻譯水平都較靜止期HSCs細(xì)胞有所增加。另外還有多篇報(bào)道中也證明了這一點(diǎn)

。Beljaars等

在小鼠模型體外研究以及人肝臟組織實(shí)驗(yàn)中證實(shí)，在肝纖維化人體組織中Wnt-5a增加了大約7倍，而在正常肝臟中Wnt-5a表達(dá)水平極低，甚至可以說(shuō)不存在。同樣在誘導(dǎo)的小鼠模型中也證明了肝損傷的小鼠Wnt-5a表達(dá)上升。β-catenin是Wnt途徑的中心介質(zhì)，它是一種多功能蛋白質(zhì)，被磷酸化激活后可以移位到細(xì)胞核中，作為轉(zhuǎn)錄輔助激活因子發(fā)揮作用，進(jìn)而調(diào)節(jié)下游數(shù)百個(gè)致病基因的轉(zhuǎn)錄和翻譯過(guò)程

。值得注意的是，β-catenin是可以作為分泌蛋白進(jìn)入人體外周循環(huán)血中，并且在血清樣本中也可以被檢測(cè)到，這在其他的疾病中也有所報(bào)道

。WISP-1屬于CCN家族成員，是Wnt/β-catenin通路活化后的下游靶基因之一。Li等

的研究顯示，WISP-1具有促進(jìn)細(xì)胞肥大和有絲分裂的作用，可刺激HSCs細(xì)胞活化和膠原蛋白表達(dá)，進(jìn)而介導(dǎo)了肝纖維化進(jìn)程。而給予其單克隆抗體后，可降低了CCL4誘導(dǎo)的炎癥因子表達(dá)，說(shuō)明WISP-1具有一定的促炎特性，這可能也是其參與肝纖維化進(jìn)程的重要機(jī)制之一。此外，Wnt 信號(hào)在HSCs活化過(guò)程中被激活，有研究證實(shí)，Wnt受體拮抗劑DKK-1可以抑制Wnt信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，促進(jìn)HSCs恢復(fù)至靜止期或凋亡

。在本研究中，血清Wnt-5a和WISP-1高水平表達(dá)和DKK-1低水平表達(dá)有助于判斷肝纖維化進(jìn)展程度，而且這3項(xiàng)指標(biāo)的變化對(duì)于判斷肝纖維化進(jìn)展風(fēng)險(xiǎn)與其他臨床因素?zé)o關(guān)。

[1]中國(guó)中西醫(yī)結(jié)合學(xué)會(huì)肝病專(zhuān)業(yè)委員會(huì).肝纖維化中西醫(yī)結(jié)合診療指南(2019年版)[J].臨床肝膽病雜志,2019,35(7):1444-1449.

[2]顧宏圖,桂紅蓮,徐列明,等.扶正化瘀片聯(lián)合恩替卡韋治療慢性乙型肝炎肝纖維化的效果觀察[J].臨床肝膽病雜志,2021,37(2):309-313.

[3]Nishikawa K, Osawa Y, Kimura K. Wnt/beta-catenin signaling as a potential target for the treatment of liver cirrhosis using antifibrotic drugs[J].Int J Mol Sci,2018,19(10):3103.

[4]中華醫(yī)學(xué)會(huì)肝病學(xué)分會(huì),中華醫(yī)學(xué)會(huì)消化病學(xué)分會(huì),中華醫(yī)學(xué)會(huì)感染病學(xué)分會(huì).肝纖維化診斷及治療共識(shí)(2019年)[J].中華肝臟病雜志,2019,27(9):657-667.

[5]中華醫(yī)學(xué)會(huì)肝病學(xué)分會(huì).原發(fā)性肝癌二級(jí)預(yù)防共識(shí)(2021年版)[J].臨床肝膽病雜志,2021,37(3):532-542.

[6]Wang W, Smits R, Hao H,

.Wnt/beta-catenin signaling in liver cancers[J].Cancers (Basel),2019,11(7):926.

[7]Dimri M,Satyanarayana A.Molecular signaling pathways and therapeutic targets in hepatocellular carcinoma[J].Cancers (Basel),2020,12(2):491.

[8]Perugorria MJ,Olaizola P,Labiano I,

.Wnt-beta-catenin signalling in liver development, health and disease[J].Nat Rev Gastroenterol Hepatol,2019,16(2):121-136.

[9]Zhou B, Liu Y, Kahn M,

.Interactions between beta-catenin and transforming growth factor-beta signaling pathways mediate epithelial-mesenchymal transition and are dependent on the transcriptional co-activator cAMP-response element-binding protein (CREB)-binding protein (CBP)[J].J Biol Chem,2012,287(10):7026-7038.

[10]Qiao X,Rao P,Zhang Y,

.Redirecting TGF-beta signaling through the beta-catenin/foxo complex prevents kidney fibro-sis[J].J Am Soc Nephrol,2018,29(2):557-570.

[11]Osawa Y, Oboki K, Imamura J,

.Inhibition of cyclic adenosine monophosphate (cAMP)-response element-binding protein (CREB)-binding protein (CBP)/beta-catenin reduces liver fibrosis in Mice[J]. EBioMedicine,2015,2(11):1751-1758.

[12]趙杰,齊永芬,魚(yú)艷榮.氧化應(yīng)激在肝纖維化發(fā)生發(fā)展中的作用[J].臨床肝膽病雜志,2019,35(9):2067-2071.

[13]朱其榮,喻雪琴,陳芳, 等.信號(hào)傳導(dǎo)通路在肝纖維化發(fā)生機(jī)制中的研究進(jìn)展[J].山東醫(yī)藥,2019,59(11):109-112.

[14]李淑琴,朱賢勇,章劍堅(jiān).動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)生化、凝血指標(biāo)及Wnt3a對(duì)肝硬化肝癌病情評(píng)估及預(yù)后判斷的價(jià)值[J].世界華人消化雜志,2018,26(22):1364-1370.

[15]Beljaars L, Daliri S, Dijkhuizen C,

.WNT-5A regulates TGF-beta-related activities in liver fibrosis[J].Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol,2017,312(3):G219-G227.

[16]吳雪蓮,胥潤(rùn).β-catenin參與乳腺癌的可能機(jī)制[J].醫(yī)學(xué)綜述,2020,26(14):2785-2791.

[17]周艷,羅凜.溫經(jīng)通絡(luò)湯聯(lián)合針灸治療風(fēng)寒濕痹型類(lèi)風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎療效及對(duì)血清Wnt-3α、β-catenin、 BMP-2的影響[J].現(xiàn)代中西醫(yī)結(jié)合雜志,2019,28(30):3375-3378.

[18]Li X,Chen Y,Ye W,

.Blockade of CCN4 attenuates CCl4-induced liver fibrosis[J].Arch Med Sci,2015,11(3):647-653.

[19]Kim MM, Schlussel L,Zhao L,

.Dickkopf-1 treatment stimulates hematopoietic regenerative function in infused endothelial progenitor cells[J].J Cell Radiat Res,2019,192(1):53-62.