高海波張今君張玉換夏慧麗

（1.臺州市食品檢驗檢測中心，浙江臺州 318000；2.綠城農(nóng)科檢測技術(shù)有限公司， 杭州 310056）

茭白又名高筍、茭瓜、高瓜等，是我國特有的水生蔬菜，在我國南方尤其江浙一帶廣泛種植[1]。茭白味道鮮美，營養(yǎng)豐富，富含氨基酸，是深受消費(fèi)者喜愛的蔬菜之一[2]。隨著茭白產(chǎn)業(yè)的迅速擴(kuò)展，茭白的用藥問題日益突出，直接影響茭白的食用安全。

抗生素類藥物是一類廣譜殺菌劑，因其價格低廉且療效顯著，曾長期在我國畜禽水產(chǎn)養(yǎng)殖和醫(yī)療衛(wèi)生行業(yè)中廣泛應(yīng)用。由于使用不當(dāng)，部分抗生素以母體或代謝物形式隨動物排泄物排出，進(jìn)入土壤或水體環(huán)境，進(jìn)而被農(nóng)作物吸收，逐步通過食物鏈進(jìn)入人體并大量蓄積，從而對人體健康造成潛在危害[3～4]。在茭白種植過程中，動物糞便等有機(jī)肥的使用量較大，帶來潛在的抗生素污染風(fēng)險[5～6]，抗生素殘留已然成為影響茭白質(zhì)量安全的重大潛在風(fēng)險之一。目前，有關(guān)畜禽水產(chǎn)等動物源性食品中抗生素殘留問題已經(jīng)引起了廣泛關(guān)注[7～8]，其相對應(yīng)的檢測技術(shù)更是得到了快速發(fā)展[9～11]，但對于以茭白為代表的蔬菜中抗生素殘留卻鮮有研究，國內(nèi)外更未制定相應(yīng)的檢測方法及限量指標(biāo)，存在一定的抗生素殘留風(fēng)險。因此，建立一種簡便、準(zhǔn)確的水生蔬菜中多種抗生素殘留檢測方法十分必要。

本研究在參考國家標(biāo)準(zhǔn)GB 31658.17－2021《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 動物性食品中四環(huán)素類、磺胺類和喹諾酮類藥物殘留量的測定 液相色譜－串聯(lián)質(zhì)譜法》和黃璐等[12]、孫曉冬等[13]方法的基礎(chǔ)上，根據(jù)各類抗生素的化學(xué)特性，優(yōu)化樣品前處理方法、色譜及質(zhì)譜參數(shù)，建立能同時檢測茭白中喹諾酮類、磺胺類和大環(huán)內(nèi)酯類3大類37種抗生素藥物殘留的檢測方法，并對基質(zhì)效應(yīng)的影響進(jìn)行了考察，同時運(yùn)用建立的方法對在農(nóng)貿(mào)市場、超市和種植基地采集的茭白樣品進(jìn)行了抗生素殘留篩查，以更好地指導(dǎo)茭白日常生產(chǎn)，為茭白等水生蔬菜日常監(jiān)管和風(fēng)險評估提供技術(shù)支持。

一、材料與方法

（一）實驗材料

1.材料與試劑。37種抗生素標(biāo)準(zhǔn)品 （純度90.0%～99.9%，德 國Dr.Ehrenstorfer GmbH公司）；乙腈（色譜純，美國Merck公司）；甲醇（色譜純，美國Merck公司）；甲酸（色譜純，上海阿拉丁生化科技股份有限公司）；Oasis PRiME HLB小柱（200 mg/6 mL，美國沃特世公司）；Oasis HLB小柱（200 mg/6 mL，美國沃特世公司）；氯化鈉（分析純，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司）；實驗室用水為Milli-Q超純水。

2.儀器與設(shè)備。AB SCIEX QTRAP 5500三重四極桿－線性離子阱液質(zhì)聯(lián)用儀（美國愛博才思公司）；Allegra X－30R高速冷凍離心機(jī)（美國貝克曼庫爾特公司）；Multimate Reax 12渦旋混勻器（德國海道夫公司）；2150 TH超聲波儀（上海安譜實驗科技股份有限公司）；PR4202ZH/Z電子天平（奧豪斯儀器上海有限公司）。

（二）實驗方法

1.標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制。準(zhǔn)確稱取標(biāo)準(zhǔn)品各10 mg（精確至0.1 mg）置于10 mL容量瓶中，其中喹諾酮類抗生素標(biāo)準(zhǔn)品加入甲酸0.2 mL，用甲醇溶解并定容，配制成質(zhì)量濃度為1 mg/mL的標(biāo)準(zhǔn)儲備液，于－18℃下保存。

2.樣品處理。稱取粉碎均勻的茭白樣品10.00 g，置于50 mL塑料具塞離心管中，加入20 mL 0.1%甲酸乙腈溶液，渦旋振蕩15 min，加入4 g氯化鈉，渦旋混合5 min，在4℃下以8 000 r/min離心5 min，移取5 mL上清液過Oasis PRiME HLB固相萃取柱凈化，收集流出液，過0.22 μm有機(jī)濾膜后待測。

3.儀器條件。色 譜條 件：Waters ACQUITY UPLC BEH C18色譜柱（100 mm×2.1 mm，1.7 μm）；柱溫為35℃；流速為0.2 mL/min；進(jìn)樣體積為5.0 μL；流動相A為含0.1%甲酸水溶液，流動相B為甲醇溶液。梯度洗脫程序：0～1.0 min，95%B；1.0～1.5 min，5%B→15%B；1.5～6.0 min，15%B→63%B；6.0～8.0 min，63%B→98%B；8.0～10.0 min，98%B；10.0～10.1 min，98%B→5%B；10.0～12.0 min，5%B。質(zhì)譜條件：電噴霧離子源（ESI+）；掃描方式為動態(tài)窗口多反應(yīng)監(jiān)測（Scheduled multiple reaction monitoring，SMRM）；電噴霧電壓為5 500 V；霧化氣壓力為344.74 kPa；輔助氣壓力為344.74 kPa；氣簾氣壓力為241.32 kPa；離子源溫度為550℃，各化合物母離子、子離子、去簇電壓及碰撞能量等參數(shù)見表1。

表1 化合物的質(zhì)譜參數(shù)

續(xù)表1

4.數(shù)據(jù)處理。譜圖通過儀器自帶MultiQuant 3.0.2軟件處理，外標(biāo)法定量。數(shù)據(jù)使用Microsoft Excel 2007軟件進(jìn)行處理。

二、結(jié)果與分析

（一）前處理條件優(yōu)化

1.提取溶劑的選擇。目前果蔬等植物源性食品中磺胺類、喹諾酮類、大環(huán)內(nèi)酯類化合物的提取溶劑主要有純乙腈溶液[14]、甲酸乙腈溶液[15～16]、90%乙腈水溶液[17]等。本研究以茭白為基質(zhì)，以各組分的加標(biāo)回收率為指標(biāo)，分別考察80%乙腈水溶液、90%乙腈水溶液、純乙腈溶液、0.1%甲酸乙腈溶液、0.5%甲酸乙腈溶液、1.0%甲酸乙腈溶液6種提取溶劑對37種化合物回收率的影響，結(jié)果見表2。由表2可知，用純乙腈溶液作提取溶劑時，諾氟沙星、依諾沙星等15種喹諾酮類化合物的回收率在50.1%～74.1%之間，普遍低于含甲酸的乙腈溶液作提取溶劑時的回收率；3種含不同濃度甲酸的乙腈溶液作提取溶劑時，隨著甲酸濃度的升高，大部分目標(biāo)化合物的回收率呈現(xiàn)降低趨勢；37種目標(biāo)化合物中有25種化合物在0.1%甲酸乙腈溶液作提取溶劑條件下回收率最高。因此，最終選擇0.1%甲酸乙腈溶液作為提取溶劑。

表2 不同提取溶劑對37種目標(biāo)化合物回收率的影響 （%）

續(xù)表2

2.凈化條件優(yōu)化。參考張居舟和李靜[18]、馬俊美等[19]、卞華等[20]的樣品凈化方法，以空白茭白樣品為基質(zhì)，在10 μg/kg添加水平下，考察Oasis PRiME HLB小柱和Oasis HLB小柱對37種化合物回收率的影響，結(jié)果見圖1。使用Oasis PRiME HLB小柱凈化后各目標(biāo)化合物回收率均在70.5%～105.4%之間，且除羅紅霉素和克拉霉素外，其余目標(biāo)化合物回收率均高于使用Oasis HLB小柱凈化后的回收率。同時使用Oasis PRiME HLB小柱不需要活化和洗脫，大幅度簡化了前處理步驟，最終確定使用Oasis PRiME HLB小柱凈化。

圖1 不同凈化小柱對37種目標(biāo)化合物回收率的影響

（二）色譜條件的優(yōu)化

1.色譜柱的選擇?；前奉?、喹諾酮類、大環(huán)內(nèi)酯類這3類化合物的結(jié)構(gòu)差異性大，而且磺胺類化合物還含多個同分異構(gòu)體，這給色譜分離帶來相當(dāng)?shù)碾y度。為了利于色譜峰分離及峰形改善，本研究參考張嘉楠等[14]、卞華等[20]的研究，選用ACQUITY UPLC BEH C18柱 和Phenomenex Kinelex F5柱 進(jìn) 行分離試驗，結(jié)果見圖2。由圖2所示，在甲醇－0.1%甲酸水流動相條件下，37種化合物在ACQUITY UPLC BEH C18色譜柱上的保留時間范圍為2.0～7.5 min，遠(yuǎn)寬于在Phenomenex Kinelex F5色 譜 柱 上 的2.5～5.5 min，因 此ACQUITY UPLC BEH C18柱對于全部目標(biāo)化合物的分離效果更好。

圖2 不同色譜柱條件下目標(biāo)化合物的總離子流圖

2.色譜分離條件的優(yōu)化。由于這3類抗生素均易溶于甲醇或乙腈，本研究分別考察了甲醇和乙腈作為強(qiáng)洗脫流動相對37種目標(biāo)化合物分離度和靈敏度的影響，結(jié)果見圖3。如圖3所示，在上文“3.儀器條件”部分所述的梯度洗脫條件下，乙腈作強(qiáng)洗脫流動相時，磺胺對甲氧嘧啶、磺胺甲氧噠嗪、磺胺間甲氧嘧啶3種同分異構(gòu)體不能完全有效分離，而甲醇作為強(qiáng)洗脫流動相能將這3種同分異構(gòu)體較好地分離；同時，在甲醇－0.1%甲酸水條件下，37種目標(biāo)化合物中有31化合物的響應(yīng)值較乙腈－0.1%甲酸水條件下的響應(yīng)值增加52%～365%。因此，最終選擇甲醇－0.1%甲酸水作為流動相（在水中加入0.1%甲酸是為了提高目標(biāo)化合物的離子化效率，以提高靈敏度及改善色譜峰峰形）。

圖3 不同流動相條件下甲氧嘧啶、磺胺甲氧噠嗪、磺胺間甲氧嘧啶的提取離子流圖

（三）質(zhì)譜條件的優(yōu)化

1.質(zhì)譜參數(shù)優(yōu)化。正離子模式下，采用直接進(jìn)樣方式將100 μg/L各化合物混合標(biāo)準(zhǔn)溶液經(jīng)蠕動泵注入離子源進(jìn)行質(zhì)譜參數(shù)優(yōu)化，在Q1全掃描模式下得到各化合物的準(zhǔn)分子離子峰。子離子掃描模式對準(zhǔn)分子離子峰進(jìn)行二級質(zhì)譜掃描，從碎裂離子中選取兩個特征離子作為定性和定量離子。在多反應(yīng)監(jiān)測（Multiple reaction monitoring，MRM）掃描模式下優(yōu)化去簇電壓和碰撞能量，使得定量離子與定性離子靈敏度最高，優(yōu)化后37種目標(biāo)化合物的質(zhì)譜參數(shù)見表1。

2.掃描模式的選擇。本研究需要在12 min內(nèi)同時測定37種目標(biāo)化合物，短時間內(nèi)同時監(jiān)測的離子數(shù)量較多，受離子掃描速度的限制，每個化合物因為駐留時間較短無法采集到足夠點(diǎn)數(shù)導(dǎo)致目標(biāo)化合物峰形較差，影響目標(biāo)化合物的定量。為提高目標(biāo)物定量結(jié)果的準(zhǔn)確度和靈敏度，在梯度洗脫條件下，根據(jù)各化合物保留時間，設(shè)定MRM檢測窗口時間60 s，進(jìn)行SMRM掃描，SMRM掃描滿足了色譜峰采集點(diǎn)數(shù)要求，同時提高了色譜峰響應(yīng)。

（四）基質(zhì)效應(yīng)研究

1.基質(zhì)效應(yīng)評價。本研究主要采用相對響應(yīng)值法來考察基質(zhì)效應(yīng)（Matrix effect，ME），其計算公式為ME＝（樣品基質(zhì)中添加相同含量分析物的響應(yīng)值/在純?nèi)軇┲蟹治鑫锏捻憫?yīng)值）×100%。若ME值＜100%，則為基質(zhì)抑制效應(yīng)；若ME值＞100%，則為基質(zhì)增強(qiáng)效應(yīng)。

本研究將空白茭白樣品按照上文“2.樣品處理”方法進(jìn)行 處 理，分 別 配制2.0、10.0、50.0 μg/L的空白基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)溶液與相對應(yīng)濃度的純?nèi)軇?biāo)準(zhǔn)溶液，通過測定進(jìn)行目標(biāo)分析物響應(yīng)值比較，計算ME值。結(jié)果表明，37種化合物中22種化合物有基質(zhì)抑制效應(yīng)，ME值在67.8%～99.1%之間，其中磺胺二甲基嘧啶、沙拉沙星等7種化合物有中等程度基質(zhì)效應(yīng)，其余15種化合物為弱基質(zhì)增強(qiáng)效應(yīng)，ME值在100.3%～110.7%之間。

2.基質(zhì)效應(yīng)消除。基質(zhì)效應(yīng)的消除目前主要有同位素內(nèi)標(biāo)法、基質(zhì)匹配標(biāo)曲法和減小進(jìn)樣量等方法。由于37種抗生素中部分抗生素的同位素內(nèi)標(biāo)物較難采購且價格昂貴，因此結(jié)合實際采用基質(zhì)匹配標(biāo)曲法消除檢測過程中產(chǎn)生的基質(zhì)效應(yīng)。

（五）方法學(xué)驗證

1.方法的檢出限、定量限和線性范圍。采用空白茭白基質(zhì)溶液配制質(zhì)量濃度為1.0、2.0、5.0、10.0、50.0、100.0 μg/L的混合標(biāo)準(zhǔn)工作溶液，按“3.儀器條件”參數(shù)測定，以各組分的峰面積對應(yīng)標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。結(jié)果顯示，37種化合物在1.0～100.0 μg/L范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，相關(guān)系數(shù)r均＞0.99，以3倍和10倍信噪比（S/N）確定各化合物的檢出限和定量限，檢出限為0.3～1.0 μg/kg，定量限為1.0～3.0 μg/kg，具體見表3。

表3 37種化合物的線性方程、相關(guān)系數(shù)、檢出限及定量限

2.方法的回收率及精密度。以茭白作空白基質(zhì)，添加5.0、10.0、50.0 μg/kg 3個濃度水平的標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行加標(biāo)回收實驗，每個樣品平行測定6次，回收率結(jié)果見表4。結(jié)果表明，37種化合物的回收率在66.9%～108.6%之間，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）在0.6%～8.3%之間。

表4 37種化合物在空白樣品中的加標(biāo)回收率和精密度 （n＝6）

（六）實際樣品測定運(yùn)用建立的方法，對在農(nóng)貿(mào)市場、超市和種植基地隨機(jī)采集的120批次茭白樣品中37種抗生素殘留進(jìn)行篩查分析。發(fā)現(xiàn)5批次茭白樣品中檢出洛美沙星、氟甲喹、雙氟沙星、氧氟沙星4種喹諾酮類藥物，殘留量在4.37～7.29 μg/kg之間；3批次茭白樣品中檢出磺胺二甲基嘧啶，殘留量在3.62～5.81 μg/kg之間。測定結(jié)果表明，茭白中的確存在一定的抗生素藥物殘留風(fēng)險。茭白中抗生素污染的溯源研究將在后續(xù)工作中繼續(xù)探討研究。

三、結(jié)論

本研究采用PRiME HLB固相萃取小柱結(jié)合超高效液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)，對樣品前處理條件、色譜條件和質(zhì)譜條件等進(jìn)行優(yōu)化，建立了茭白中喹諾酮類、磺胺類和大環(huán)內(nèi)酯類3大類37種抗生素的快速篩查和定量方法。該方法簡便有效、定量準(zhǔn)確，可用于茭白樣品中抗生素殘留的快速篩查和風(fēng)險評估。