趙晨陽，郭利平

1 浙江中醫(yī)藥大學(xué)，浙江 杭州 310053；2 天津中醫(yī)藥大學(xué)

腦卒中是一種以腦部缺血和出血為主要損傷癥狀的疾病，分為出血性腦卒中和缺血性腦卒中兩大類。其中，缺血性腦卒中較為常見，占腦卒中總數(shù)的80%，是導(dǎo)致殘疾及癡呆的重要原因之一［1］。腦卒中屬于難治性疾病，尚無十分有效的治療手段，急性期治療手段局限于溶栓治療。但仍然存在治療時間窗狹窄、副作用多等問題?；謴?fù)期則著重于神經(jīng)修復(fù)和血管再生。銀杏是傳統(tǒng)的活血化瘀中藥，近年來隨著制藥技術(shù)的發(fā)展，銀杏類藥物組分逐漸明確，注射液純度提升，不良反應(yīng)發(fā)生率下降。銀杏二萜內(nèi)酯葡胺注射液（江蘇康緣藥業(yè)股份有限公司）是目前為數(shù)不多獲批上市的銀杏內(nèi)酯化學(xué)單體注射液，其有效成分銀杏內(nèi)酯A（Ginkgolide A）、B（Ginkgolide B）、K（Ginkgolide K）達99%以上。具有活血化瘀、通絡(luò)止痛的功效，臨床用于中風(fēng)病中經(jīng)絡(luò)（輕中度腦梗死）恢復(fù)期痰瘀阻絡(luò)證，癥見半身不遂、口舌歪斜、言語謇澀、肢體麻木等。根據(jù)中醫(yī)“祛瘀生新”理論，活血化瘀藥物的作用，可歸結(jié)于生新血、生新絡(luò)、生新物三個方面。其中血管在中醫(yī)學(xué)中屬于脈絡(luò)的范疇。喻昌有言：“十二經(jīng)生十二絡(luò)，十二絡(luò)生一百八十系絡(luò)，系絡(luò)生一百八十纏絡(luò)，纏絡(luò)生三萬四千孫絡(luò)。”與現(xiàn)代醫(yī)學(xué)所描述的全身血管系統(tǒng)有異曲同工之妙。因此論治缺血性中風(fēng)恢復(fù)期，當(dāng)從“化瘀生新”著手。目前關(guān)于銀杏內(nèi)酯類在腦卒中疾病中的保護作用主要集中于對急性期的研究，其在后期修復(fù)中發(fā)揮的作用亟待探索。本研究通過網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)對銀杏二萜內(nèi)酯葡胺注射液的核心靶點、功能、信號通路進行分析，探索其作用機制，為藥物臨床應(yīng)用提供進一步的理論依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 化合物及靶點預(yù)測從PubChem（https：//pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/）下載銀杏內(nèi)酯A、B、K的3D結(jié)構(gòu)，在PharmMapper上傳，靶點選擇Druggable Pharmacophore Models（v2017，16159），獲取預(yù)測的靶點，按可能性打分，自上而下分數(shù)逐漸降低，同時得到化合物分子結(jié)構(gòu)與藥效團模型結(jié)合的圖形。

1.2 網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建1）將銀杏內(nèi)酯A、B、K的相關(guān)靶點對應(yīng)的基因名稱輸入STRING數(shù)據(jù)庫，物種限定為人，數(shù)據(jù)庫后臺計算蛋白相互作用的關(guān)系，并將其可視化，設(shè)置隱藏網(wǎng)絡(luò)中的離散節(jié)點，得到蛋白互作網(wǎng)絡(luò)（protein-protein interaction network，PPI network）。2）將基因和化合物信息輸入Cytoscape 3.7.1，繪制化合物-靶點藥物調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，并以圖片的形式導(dǎo)出。3）基因功能和通路分析使用R語言軟件計算，得到基因本體論（gene ontology，GO）功能富集分析和京都基因與基因組百科全書（kyoto encyclopedia of genes and genomes，KEGG）通路富集分析。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 銀杏二萜內(nèi)酯葡胺注射液化合物及靶點預(yù)測根據(jù)PharmMapper結(jié)果，排除在UniProt數(shù)據(jù)庫中找不到對應(yīng)基因名的靶標，預(yù)測銀杏二萜內(nèi)酯葡胺注射液有效成分的靶點分別為Ginkgolide A 72個，Ginkgolide B 67個，Gink-golide K 78個，3D結(jié)構(gòu)見圖1。

圖1 銀杏二萜內(nèi)酯葡胺注射液有效成分3D結(jié)構(gòu)

2.2 網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建

2.2.1 蛋白互作PPI網(wǎng)絡(luò)將銀杏內(nèi)酯A、B、K的相關(guān)靶點導(dǎo)入STRING平臺，得到對應(yīng)靶點蛋白互作PPI網(wǎng)絡(luò)。包括141個節(jié)點、264條邊，平均度值為3.74。其中節(jié)點為靶點蛋白，邊為各蛋白間互作關(guān)系。節(jié)點連接邊數(shù)越多代表其在網(wǎng)絡(luò)中的作用越重要。見圖2。

圖2 蛋白互作PPI網(wǎng)絡(luò)

2.2.2 化合物-靶點藥物調(diào)控網(wǎng)絡(luò)將基因和化合物信息輸入Cytoscape 3.7.1，繪制化合物-靶點藥物調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，并以圖片的形式導(dǎo)出，即圖3。外圓圈為基因靶點，內(nèi)部為藥效團，紅線代表藥效團的關(guān)系，藍線代表ppi網(wǎng)絡(luò)關(guān)系。見圖3。

圖3 銀杏二萜內(nèi)酯葡胺注射液化合物-靶點藥物調(diào)控網(wǎng)絡(luò)

2.3 GO富集分析和KEGG通路富集分析銀杏二萜內(nèi)酯葡胺注射液核心基因的GO功能主要涉及以下部分：熱休克蛋白結(jié)合、泛素（樣）蛋白連接酶結(jié)合、煙酰胺腺嘌呤二核苷酸（nicotinamide adenine dinucleotide，NAD）依賴的組蛋白脫乙酰酶活性、中樞神經(jīng)特異性蛋白S100結(jié)合、NAD依賴性蛋白脫乙酰酶活性、熱休克蛋白90（heat shock protein 90，Hsp90）結(jié)合、雄激素受體結(jié)合、脫氧核糖核酸（deoxyribonucleic acid，DNA）聚合酶結(jié)合、微管相關(guān)蛋白tau結(jié)合、類固醇激素受體結(jié)合、核激素受體結(jié)合、組蛋白脫乙酰酶活性、蛋白質(zhì)脫乙酰酶活性、組蛋白乙酰轉(zhuǎn)移酶結(jié)合、DNA結(jié)合受損、p53結(jié)合、酰胺結(jié)合、無序域特異性結(jié)合、輔酶結(jié)合、肽結(jié)合、組蛋白脫乙?；富钚裕℉3-K14特異性）、NAD依賴的組蛋白脫乙酰基酶活性（H3-K14特異性）、脂肽結(jié)合等。見圖4。

圖4 GO功能富集分析柱狀圖

其核心基因的KEGG通路主要涉及：代謝途徑、局部黏附、麻疹、人乳頭瘤病毒感染、前列腺癌、緊密連接、癌癥的途徑、病毒致癌、EB病毒感染、乙肝、Rap1信號通路、乙醛酸和二羧酸酯代謝、RNA轉(zhuǎn)運、MAPK信號通路、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中的蛋白質(zhì)加工、碳代謝、黏附連接、單純皰疹感染、酮體的合成與降解、癌癥中的蛋白聚糖、色氨酸代謝、沙門氏菌感染、卟啉與葉綠素代謝、mRNA監(jiān)測途徑、PI3K-Akt信號通路、Wnt信號通路、IL-17信號通路、孕酮介導(dǎo)的卵母細胞成熟、糖尿病并發(fā)癥中的AGE-RAGE信號通路等。見表1。

表1 KEGG通路

3 討論

本研究基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的理論，通過構(gòu)建化合物-靶點藥物調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，并對核心靶標進行GO功能富集分析和KEGG通路富集分析，發(fā)現(xiàn)銀杏二萜內(nèi)酯葡胺注射液的3種有效成分銀杏內(nèi)酯A、B、K，核心靶標主要有FGF1、UNC45A、USP19、HDAC6、CDKN1B、KPNB1、HSP90AB1、DDX58、PAX6、SNX9、CUL5、CACYBP、RNF8、TRAF4、SIRT3、HDAC7、EZR、MARK1等。結(jié)合文獻研究，認為這些靶標可能通過代謝途徑、黏附連接、緊密連接、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中的蛋白質(zhì)加工、病毒感染以及RAS相關(guān)蛋白1（RASassociated protein 1，Rap1）、促分裂原活化蛋白激酶（mitogen-activate protein kinase，MAPK）、磷脂酰肌醇-3-羥激酶（phosphatidylinositol 3-hydroxy kinase，PI3K）-蛋白激酶B（protein kinase B，又 稱Akt）、無 翅/整 合（wingless/integrated，Wnt）、白細胞介素17（interleukin-17，IL-17）、晚期糖基化終末產(chǎn)物及其受體（advanced glycation end products and receptor for advanced glycation end products，AGERAGE）等信號通路，影響熱休克蛋白結(jié)合、泛素（樣）蛋白連接酶結(jié)合、組蛋白脫乙酰酶活性、組蛋白乙酰轉(zhuǎn)移酶結(jié)合、S100蛋白結(jié)合、tau蛋白結(jié)合等功能，從而參與腦卒中的一系列生理病理過程。

缺血期間氧氣和ATP的消耗會引起錯誤折疊和未折疊的蛋白質(zhì)積聚［2］，長期積累會導(dǎo)致錯誤締合、聚集或蛋白毒性可溶性肽的形成。組成細胞蛋白穩(wěn)定機制反應(yīng)的四個途徑包括熱休克蛋白，泛素-蛋白酶體系統(tǒng)，自噬-溶酶體途徑以及內(nèi)質(zhì)網(wǎng)相關(guān)降解壓力反應(yīng)［3-5］。由GO和KEGG富集分析結(jié)果可知，銀杏二萜內(nèi)酯葡胺注射液可以影響這四個途徑，促進清除蛋白質(zhì)積聚，從而避免腦卒中的進一步發(fā)展。

研究表明，組蛋白的修飾，如組蛋白的乙酰化作用，在調(diào)控基因表達過程中發(fā)揮著重要作用。在細胞核內(nèi)，組蛋白乙酰化與組蛋白去乙?；^程處于動態(tài)平衡，并由具有相反活性的組蛋白乙酰化轉(zhuǎn)移酶和組蛋白去乙?；福╤istone deacetylases，HDACs）共同調(diào)控［6］。組蛋白去乙?；敢种苿╤istone deacetylase inhibitor，HDACI）在許多中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病中具有保護神經(jīng)的作用［7-8］。多項實驗結(jié)果顯示，組蛋白去乙酰化酶6（histone deacetylase-6，HDAC6）的抑制作用可以保護神經(jīng)元和神經(jīng)膠質(zhì)細胞免受缺血性損傷，并促進中風(fēng)后腦組織的恢復(fù)［9-13］。因此，銀杏二萜內(nèi)酯葡胺注射液的腦神經(jīng)保護作用，應(yīng)與具有組蛋白脫乙酰酶活性、組蛋白乙酰轉(zhuǎn)移酶結(jié)合相關(guān)的核心靶點HDAC6、HDAC7、去乙?；?（sirtuin-3，SIRT3）、配對盒基因6（paired box-6，PAX6）等有關(guān)。另外NIU［14］等研究表明，干預(yù)代謝、類固醇激素生物合成及其他途徑，對腦缺血性損傷可以起到協(xié)同保護的作用。

S100B蛋白（相關(guān)基因靶點為FGF1/CACYBP/EZR）是中樞神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育過程中的神經(jīng)營養(yǎng)因子和神經(jīng)元存活蛋白，具有營養(yǎng)或毒性作用，具體取決于其局部濃度。相關(guān)研究證實，血清低水平S100B蛋白具有神經(jīng)保護作用，但血清高水平S100B蛋白具有神經(jīng)毒性［15］。在生理水平下，S100B蛋白可刺激神經(jīng)突延伸，保護神經(jīng)元存活，并在神經(jīng)元成熟和膠質(zhì)細胞體外增殖中發(fā)揮作用，保護因葡萄糖剝奪引發(fā)的細胞死亡和線粒體功能障礙［16］。當(dāng)血清S100B蛋白水平較高時，S100B蛋白可刺激促炎癥細胞因子的表達，引起細胞凋亡，發(fā)揮其神經(jīng)毒性作用，促進神經(jīng)退行性疾病和神經(jīng)炎癥的發(fā)展［17］。

與核心靶標MARK1、HDAC6、HSP90AB1等相關(guān)的tau蛋白，受MAPK通路調(diào)控。功能失調(diào)的tau是一種神經(jīng)毒性蛋白，在缺血后的神經(jīng)元和腦血管中積累，而且與缺血性卒中的一系列病理變化密切相關(guān)［18-19］。除此之外，p53/MAPK通路還可以通過磷酸化下游效應(yīng)物的局部黏附激酶和Akt，保護中風(fēng)后內(nèi)皮細胞免于凋亡［20-21］。

作為腦缺血再灌注損傷機制里極其重要的一環(huán)，血腦屏障的重要組成部分——腦毛細血管內(nèi)皮細胞，通過形成血漿和腦之間親水分子滲透屏障的頂端緊密連接（tight junctions，TJs），并與相鄰細胞的細胞骨架的黏附連接（adherens junctions，AJs）緊密相連［22］。與銀杏二萜內(nèi)酯葡胺注射液密切相關(guān)的熱休克蛋白以及局部黏附、緊密連接等相關(guān)通路，可通過在腦缺血再灌注損傷后，阻止TJ和可能的AJ蛋白內(nèi)皮細胞亞細胞再分布，來抑制血腦屏障損傷的細胞旁路［23］，從而起到腦保護作用。

近年來的文獻研究報道認為，EB病毒［24］、單純皰疹病毒［25］、乙型肝炎病毒［26］及Rap1［27］、PI3KAkt［28］、Wnt［29］、IL-17［30］、AGE-RAGE［31］等信號通路也參與了腦缺血再灌注損傷的一系列病理過程，因此根據(jù)銀杏二萜內(nèi)酯葡胺注射液的KEGG富集結(jié)果，其治療腦梗死的相關(guān)機制應(yīng)與以上通路有關(guān)。

綜上所述，本研究基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法，全面系統(tǒng)地分析了銀杏二萜內(nèi)酯葡胺注射液治療腦梗死的作用機制，為其臨床應(yīng)用提供了理論依據(jù)，但仍需結(jié)合體內(nèi)外實驗進一步驗證有效成分及靶標的作用機制，以期提高藥效，完善機制研究，從而促進中藥現(xiàn)代化發(fā)展。