曹知勇，張青槐，龐宇舟△

1 廣西壯瑤藥工程技術(shù)研究中心，廣西 南寧 530200；2 湖北民族大學(xué)醫(yī)學(xué)部

類(lèi)風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎（rheumatoid arthritis，RA）是臨床高發(fā)的自身免疫性疾病，主要侵犯人體滑膜關(guān)節(jié)，發(fā)病過(guò)程復(fù)雜，和多種血細(xì)胞相關(guān)。其中，與血小板關(guān)系最為密切。血清P-選擇素（Pselectin，CD62P）是一種選擇素黏附分子，在血小板靜止期，它幾乎沒(méi)有表達(dá)。但在血小板被炎性介質(zhì)刺激而活化之后，它被暴露于膜表面，又能脫落至血液中，在細(xì)胞內(nèi)外都產(chǎn)生高表達(dá)。而P-選擇素又能促進(jìn)中性粒細(xì)胞和淋巴細(xì)胞等白細(xì)胞浸潤(rùn)骨膜關(guān)節(jié)，導(dǎo)致骨膜異常增生［1］。這樣不斷惡性循環(huán)，導(dǎo)致RA病情逐漸加重。血小板內(nèi)皮細(xì)胞黏附因子（platelet endothelial cell adhesion molecule 1，PECAM-1）是一種免疫球蛋白超家族黏附分子［2］。RA炎性表達(dá)高的時(shí)候，PECAM-1表達(dá)也會(huì)隨之升高，引導(dǎo)中性粒細(xì)胞和淋巴細(xì)胞做趨化運(yùn)動(dòng)，加強(qiáng)炎性介質(zhì)的浸潤(rùn)滲透。青風(fēng)藤很早便被運(yùn)用于RA的治療，并且療效顯著［3-4］。本研究就青風(fēng)藤生物堿治療RA進(jìn)行分子層面的探討，觀察壯藥青風(fēng)藤對(duì)RA模型大鼠血清P-選擇素、PECAM-1表達(dá)的影響。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物SPF級(jí)SD大鼠40只，8～10周齡，雄性，體質(zhì)量200±20 g，購(gòu)自湖南斯萊克景達(dá)，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物合格證號(hào)：SCXK（湘）2016-002。飼養(yǎng)條件：室溫由空調(diào)控制在23±2℃，相對(duì)濕度55%～68%，高壓墊料，每周更換兩次。標(biāo)準(zhǔn)維持鼠料，自由飲用凈化水。適應(yīng)性喂養(yǎng)7天后開(kāi)始用于實(shí)驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)經(jīng)廣西中醫(yī)藥大學(xué)倫理委員會(huì)審批，符合動(dòng)物實(shí)驗(yàn)要求。

1.2 藥物及儀器青風(fēng)藤干燥藤莖，產(chǎn)地廣西，購(gòu)于廣西中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院，經(jīng)鑒定為防己科植物青藤藤莖。天然牛Ⅱ型膠原蛋白、完全弗氏佐劑（Chondrex公司，批號(hào)200262）；P-選擇素ELISA試劑盒、PECAM-1ELISA試劑盒（南寧市鵬碧實(shí)驗(yàn)室器材經(jīng)營(yíng)部，批號(hào)：20171107，20171109）。Direct-Q5uv型超純水系統(tǒng)［密理博（中國(guó)）有限公司］；單道可調(diào)移液器、MiniSpir型迷你離心機(jī)、5810R型高速臺(tái)式冷凍離心機(jī)（德國(guó)Eppendorf公司）；BD23型小型精密恒溫箱（德國(guó)BINDER公司）；AR224CN電子分析天平［奧豪斯儀（上海）有限公司］；XW-80A型漩渦震蕩器（海南市其林貝爾儀器制造有限公司）；DW86290型低溫保存箱（澳柯瑪股份有限公司）；Infinite M200 pro多功能微孔板檢測(cè)儀（瑞士帝肯貿(mào)易有限公司）。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 模型制備將40只SD大鼠稱(chēng)重后，隨機(jī)分為空白組8只以及造模組32只。將溶于醋酸的牛Ⅱ型膠原蛋白先于4℃低溫保存過(guò)夜，第二天與完全弗氏佐劑以等體積乳化。乳化成功后，對(duì)造模組大鼠背部及尾部多點(diǎn)行皮下注射，誘導(dǎo)形成RA模型，每只大鼠0.15 mL，7天后進(jìn)行第二次注射，方法與第一次注射方法相同。空白組大鼠則注射等量的0.9%氯化鈉溶液［5］。采用關(guān)節(jié)腫脹評(píng)分對(duì)造模大鼠進(jìn)行評(píng)分，分值范圍為0～16分。造模第21天進(jìn)行關(guān)節(jié)評(píng)分，評(píng)分＞4分即認(rèn)定為造模成功。

1.3.2 分組及給藥成模大鼠隨機(jī)分為模型組和青藤堿低、中、高劑量組，每組8只。青藤堿各劑量組分別給予青藤堿混懸液灌胃，濃度依次為：5、10、20 mg/（kg·d）；模型組與空白組灌胃等量0.9%氯化鈉溶液；灌胃劑量10 mg/（kg·d），每日1次，持續(xù)28天。

1.3.3 標(biāo)本采集造模成功后，即進(jìn)行第一輪眼眶取血，離心保存血清。第二次取血于實(shí)驗(yàn)結(jié)束后禁食一夜，次日于大鼠眼眶取血，取出后，靜置2 h，以離心半徑10 cm，3000 r/min離心10 min，用移液槍吸取血清保存于-80℃冰箱，用于實(shí)驗(yàn)檢測(cè)。

1.4 觀察指標(biāo)采用ELISA法測(cè)定各組大鼠血清中P-選擇素、PECAM-1水平，操作方法嚴(yán)格按試劑盒說(shuō)明書(shū)操作。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法采用SPSS 23.0統(tǒng)計(jì)軟件統(tǒng)計(jì)。計(jì)量資料以±s表示，采用t檢驗(yàn)。P＜0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 造模后大鼠血清P-選擇素、PECAM-1表達(dá)與空白組比較，造模組大鼠關(guān)節(jié)腫脹明顯，血清中P-選擇素、PECAM-1水平明顯升高（P＜0.05）。見(jiàn)表1。

表1 大鼠造模后P-選擇素、PECAM-1表達(dá)（±s）pg/mL

表1 大鼠造模后P-選擇素、PECAM-1表達(dá)（±s）pg/mL

注：#表示與空白組相比，P＜0.05

組別空白組造模組鼠數(shù)8 32 P-選擇素21.46±2.62 24.35±0.89 PECAM-1 38.57±4.35#39.13±2.71#

2.2 給藥后大鼠血清P-選擇素、PECAM-1表達(dá)與模型組比較，壯藥青風(fēng)藤各劑量組大鼠血清中P-選擇素、PECAM-1表達(dá)均明顯降低（P＜0.05），且壯藥青風(fēng)藤高劑量組明顯低于壯藥青風(fēng)藤低劑量組（P＜0.05）。見(jiàn)表2。

表2 各組大鼠P-選擇素、PECAM-1水平比較（±s）pg/mL

表2 各組大鼠P-選擇素、PECAM-1水平比較（±s）pg/mL

注：*表示與模型組比較，P＜0.05，△表示與青風(fēng)藤低劑量組比較，P＜0.05

組別空白組模型組青風(fēng)藤高劑量組青風(fēng)藤中劑量組青風(fēng)藤低劑量組鼠數(shù)8 8 8 8 8 P-選擇素21.47±3.12*37.93±2.17 24.86±2.79*△28.83±1.78*31.68±2.39*PECAM-1 24.34±1.13*38.56±1.81 28.67±2.23*△29.78±1.84*32.15±2.64*

3 討論

RA是一種病因不甚明確的自身免疫性疾病，在RA發(fā)病過(guò)程中，多項(xiàng)血常規(guī)指標(biāo)高于正常水平。中性粒細(xì)胞、淋巴細(xì)胞、血小板體積寬度以及平均血小板體積等都發(fā)生異常變化。研究發(fā)現(xiàn)，RA發(fā)病過(guò)程中，血小板過(guò)度活化［6］。而P-選擇素和血小板內(nèi)皮細(xì)胞黏附因子表達(dá)的增多就是血小板異?；罨漠a(chǎn)物。楊曉燕等［7］發(fā)現(xiàn)血漿P-選擇素的測(cè)定有助于RA的早期診斷以及病情監(jiān)測(cè)。謝則金等［8］實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)RA病情活動(dòng)時(shí)，會(huì)伴隨有血小板的活化，而P-選擇素的高表達(dá)可作為血小板異?；罨臉?biāo)志。PECAM-1是調(diào)節(jié)白細(xì)胞滲出和血管通透性的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)，它的表達(dá)隨著血小板的變化而變化，參與并維持了血管的完整性［9］。在炎癥初期，PECAM-1有助于白細(xì)胞的識(shí)別和結(jié)合，當(dāng)受炎性因子持續(xù)刺激后，內(nèi)皮細(xì)胞連接部位的PECAM-1減少。這樣一來(lái)，血管通透性增強(qiáng)，促進(jìn)了大量的的血漿蛋白滲出，從而加強(qiáng)體液免疫。TNF-α、IL-1等類(lèi)風(fēng)濕炎性因子能改變內(nèi)皮細(xì)胞PECAM-1的分布，從而參與白細(xì)胞血管滲出和通透性調(diào)節(jié)。血清P-選擇素和PECAM-1的表達(dá)增加都能促進(jìn)血小板活性增加，而血小板的活性增加又能夠?qū)е露叩母弑磉_(dá)［10］。

青風(fēng)藤中，青藤堿是青風(fēng)藤中含量最為豐富的化合物［11］，具有鎮(zhèn)痛，抗炎的功效。臨床使用中發(fā)現(xiàn)，青藤堿能有效緩解關(guān)節(jié)炎癥并抑制骨破壞，尤其是針對(duì)RA過(guò)程中的破骨細(xì)胞（osteoclast cell，OC）。青藤堿能夠抑制OC有關(guān)的信號(hào)通路，從而抑制破骨細(xì)胞對(duì)骨質(zhì)的損傷［12］。吉金雨［13］總結(jié)發(fā)現(xiàn)青藤堿可通過(guò)降低TNF-α、IL-1、IL-6、IL-17的水平從而抑制OC分化，防止RA骨破壞。青藤堿抗炎效果明顯，臨床使用廣泛，不良反應(yīng)較少，且并無(wú)耐藥性［14］。

本實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)，青風(fēng)藤總生物堿能有效消除關(guān)節(jié)腫脹，緩解RA的炎性癥狀。而青風(fēng)藤總生物堿組組間比較發(fā)現(xiàn)，高劑量組的效果最好，最能降低血清P-選擇素和PECAM-1的水平?？梢?jiàn)，使用青風(fēng)藤總生物堿治療RA，也需要達(dá)到一定劑量才能起到治療作用。本實(shí)驗(yàn)證實(shí)了青風(fēng)藤堿能有效治療RA，可能是通過(guò)降低RA模型大鼠血清中P-選擇素和PECAM-1的表達(dá)來(lái)實(shí)現(xiàn)的。