孔 慧 崔 彥

糖尿病視網(wǎng)膜病變(DR)是一種臨床定義明確、威脅視力的慢性微血管并發(fā)癥，盡管隨著視網(wǎng)膜神經(jīng)血管單位(RVUT)定義的提出，認(rèn)為神經(jīng)元的損傷出現(xiàn)在微血管改變之前，DR的臨床可見特征仍是視網(wǎng)膜微血管系統(tǒng)的改變，包括視網(wǎng)膜不灌注、血管通透性增加，以及病理性眼內(nèi)血管增生[1]。視網(wǎng)膜內(nèi)皮細(xì)胞(REC)被認(rèn)為是糖尿病誘導(dǎo)的血管損傷的主要細(xì)胞靶點(diǎn)，在不同血糖控制情況、糖尿病持續(xù)時(shí)間和有無DR的糖尿病患者中，REC的數(shù)量和功能存在差異。退化性毛細(xì)血管是早期DR的一個(gè)標(biāo)志，是REC和周細(xì)胞共同丟

失的結(jié)果，失去細(xì)胞的血管隨后轉(zhuǎn)化為缺乏血流的基底膜管，由此產(chǎn)生的缺血可能促進(jìn)了以視網(wǎng)膜新生血管為特征的增生型糖尿病視網(wǎng)膜病變(PDR)的發(fā)生[2]。DR時(shí)RVUT發(fā)生炎癥級(jí)聯(lián)反應(yīng)[3]，膠質(zhì)細(xì)胞分泌炎癥因子，REC發(fā)生程序性死亡[4]。本文結(jié)合近年來關(guān)于體內(nèi)外REC的實(shí)驗(yàn)研究，探討DR中高糖等各種病理因素引起的REC結(jié)構(gòu)和功能變化及這些變化發(fā)生的具體機(jī)制，并分析其病理改變?cè)贒R發(fā)生發(fā)展中的作用。

1 REC在視網(wǎng)膜血管系統(tǒng)中的結(jié)構(gòu)和功能

視網(wǎng)膜毛細(xì)血管由一層REC組成，細(xì)胞-細(xì)胞接觸緊密，形成血-視網(wǎng)膜內(nèi)屏障(iBRB)，生理狀態(tài)下健康的REC不僅發(fā)揮著血管被動(dòng)屏障的作用，而且還發(fā)揮著許多重要的生理功能，包括介導(dǎo)血管活性因子的釋放，調(diào)節(jié)血管壁張力、細(xì)胞生長(zhǎng)、內(nèi)穩(wěn)態(tài)和炎癥狀態(tài)。在體內(nèi)，REC一方面必須確保向代謝活躍的視網(wǎng)膜提供氧氣和營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，并允許進(jìn)入視網(wǎng)膜的循環(huán)免疫細(xì)胞檢查是否存在潛在病原體；另一方面通過排除循環(huán)分子毒素、微生物和促炎白細(xì)胞來維持iBRB，保護(hù)視網(wǎng)膜[5]。因此REC是視網(wǎng)膜缺血性疾病的主要參與者，包括DR。

雖然沒有專門的研究確認(rèn)，但REC很可能具有協(xié)助壁肌細(xì)胞和周細(xì)胞感知和傳導(dǎo)機(jī)械力的作用。視網(wǎng)膜內(nèi)皮上包覆有一個(gè)糖萼，這個(gè)結(jié)構(gòu)在內(nèi)皮細(xì)胞和循環(huán)血細(xì)胞之間相互作用，調(diào)控血管緊張度，被認(rèn)為起到機(jī)械傳感器的作用。REC也能作為化學(xué)感受器，在缺氧和高碳酸血癥時(shí)，通過產(chǎn)生包括一氧化氮、花生四烯酸代謝物和內(nèi)皮素-1在內(nèi)的分子介質(zhì)來傳達(dá)視網(wǎng)膜血管舒張或血管收縮的需求，調(diào)控血流動(dòng)力[6]。作為iBRB的形成細(xì)胞，REC的顯著特征是特殊的“閉塞帶(ZO)”細(xì)胞間連接的存在，這些連接與鄰近細(xì)胞形成穩(wěn)定和極其緊密的結(jié)合，保證了循環(huán)血液中的物質(zhì)不能夠隨意進(jìn)入視網(wǎng)膜。

視網(wǎng)膜血管生成是正常血管發(fā)育的一部分，也是缺血性血管病變中視網(wǎng)膜新生血管形成的關(guān)鍵組成部分。內(nèi)皮細(xì)胞能夠特化為尖細(xì)胞(tip cells)和柄樣細(xì)胞(stalk cells),尖細(xì)胞遷移與星形膠質(zhì)細(xì)胞突起一起延伸絲狀足。在每個(gè)尖細(xì)胞的后面，柄樣細(xì)胞增殖生長(zhǎng)成內(nèi)皮芽啟動(dòng)血管的形成[7]。鄰近細(xì)胞間通過Notch系統(tǒng)調(diào)控VEGFR-1和VEGFR-2的相對(duì)表達(dá)競(jìng)爭(zhēng)成為能夠促進(jìn)血管網(wǎng)絡(luò)分支的尖細(xì)胞。毛細(xì)血管中的內(nèi)皮細(xì)胞不是靜態(tài)的，而是通過細(xì)胞間信號(hào)通路動(dòng)態(tài)改變的，相鄰內(nèi)皮細(xì)胞之間的信號(hào)通路在血管的發(fā)育、重塑和穩(wěn)態(tài)中起著重要作用。Notch受體及其配體Dll4和Jagged1調(diào)節(jié)內(nèi)皮細(xì)胞之間的動(dòng)態(tài)和瞬時(shí)細(xì)胞間信號(hào)，糖尿病高糖狀態(tài)會(huì)導(dǎo)致Notch信號(hào)改變[8]。

通過基因芯片分析血管內(nèi)皮基因表達(dá)，證實(shí)了來自不同組織的內(nèi)皮細(xì)胞、大血管與微血管內(nèi)皮細(xì)胞、動(dòng)脈與靜脈內(nèi)皮細(xì)胞之間存在異質(zhì)性。血管內(nèi)皮細(xì)胞的異質(zhì)性同樣在眼內(nèi)存在，REC具有獨(dú)特的分子表型。與脈絡(luò)膜內(nèi)皮細(xì)胞相比，REC中有779個(gè)轉(zhuǎn)錄本有差異表達(dá)，其中330個(gè)轉(zhuǎn)錄本在REC中相對(duì)高表達(dá)。REC表達(dá)了相對(duì)高水平的參與免疫反應(yīng)的轉(zhuǎn)錄本，包括細(xì)胞間黏附分子、細(xì)胞因子、趨化因子、受體和參與合成炎癥蛋白的酶，人REC表達(dá)了相對(duì)較高水平的IL-6轉(zhuǎn)錄本，在短暫接觸脂多糖后該表達(dá)增加了近20倍[9]。REC同時(shí)參與應(yīng)激、細(xì)胞增殖和黏附轉(zhuǎn)錄本的高表達(dá)，表明可能存在對(duì)缺血的獨(dú)特反應(yīng)和新生血管的特異性調(diào)節(jié)[5]。

2 DR時(shí)REC發(fā)生結(jié)構(gòu)和功能變化

DR是一種慢性、進(jìn)行性的低級(jí)別炎癥性疾病,以REC死亡和血管炎癥為特征，是糖尿病的常見微血管并發(fā)癥。DR的早期特點(diǎn)是REC的凋亡和促炎改變，導(dǎo)致脫細(xì)胞毛細(xì)血管和血管通透性改變[10]。多種應(yīng)激源已被證明可以觸發(fā)REC遷移及凋亡，研究最廣泛的是暴露于高糖和炎癥因子。糖尿病的高血糖狀態(tài)是視網(wǎng)膜細(xì)胞結(jié)構(gòu)和功能損傷的主要因素，主要機(jī)制涉及糖基化終末產(chǎn)物、多元醇途徑、PKC、氧化應(yīng)激[11]。炎癥是DR病理生理學(xué)中的另一個(gè)活躍因素[3]。在體內(nèi)高血糖和高炎癥因子水平的作用下，REC發(fā)生凋亡、細(xì)胞表型改變以及遷移能力增強(qiáng)，致使毛細(xì)血管通透性增加或毛細(xì)血管閉塞，分別導(dǎo)致黃斑水腫或視網(wǎng)膜新生血管形成。

視網(wǎng)膜生理結(jié)構(gòu)的維持需要復(fù)雜的細(xì)胞間相互作用。這些相互作用發(fā)生在稱為細(xì)胞連接的特殊接觸位點(diǎn)，包括緊密連接[如閉合蛋白(occludin)和ZO]、黏附連接[如血管內(nèi)皮鈣黏蛋白(VE-鈣黏蛋白)]和縫隙連接[如連接蛋白43(Cx43)]。iBRB中最豐富的網(wǎng)格蛋白亞型是Claudin-5，Claudin-5與ZO-1的PDZ結(jié)構(gòu)域相互作用，ZO-1是一種大型支架蛋白，作為跨膜蛋白和細(xì)胞骨架之間的橋梁，ZO-1是BRB完整性的標(biāo)志，ZO-1的丟失或減少與屏障滲透性的增加有關(guān)；其他亞型也在視網(wǎng)膜中表達(dá)，如Claudin-1，在糖尿病小鼠視網(wǎng)膜中的表達(dá)降低[12]。VE-鈣黏蛋白在細(xì)胞黏附中起重要作用。DR時(shí)VEGF水平升高導(dǎo)致血管滲漏，同時(shí)VEGF激活PKC-β，使閉合蛋白磷酸化，磷酸化的occludin隨后被泛素化靶向降解，導(dǎo)致血管通透性增加[13]。高糖時(shí)通過TLR4信號(hào)通路減少REC上的occludin和ZO-1的表達(dá)，破壞緊密連接[14]，導(dǎo)致REC通透性增加。在縫隙連接處，相鄰的兩個(gè)內(nèi)皮細(xì)胞上各有一個(gè)半通道進(jìn)行接觸,半通道由6個(gè)連接蛋白組成。也通過調(diào)節(jié)occludin-5和ZO-1等緊密連接蛋白的表達(dá)和定位來參與屏障功能的調(diào)控。CX43是目前研究較多的半通道蛋白，體外高糖培養(yǎng)的人REC的CX43表達(dá)降低，進(jìn)一步下調(diào)緊密連接和黏附連接[15]。在糖尿病大鼠視網(wǎng)膜中，iBRB滲漏增加，炎癥因子(VEGF、TNF-α、IL-1β、ICAM-1、MMP-9)表達(dá)顯著增加，p38 MAPK、NF-κB和TXNIP的蛋白表達(dá)上調(diào)，而緊密連接蛋白(ZO-1、occludin、JAM-A、Claudin-5)表達(dá)顯著降低；在體外實(shí)驗(yàn)中，褪黑素通過抑制p38/TXNIP/NF-κB通路上調(diào)緊密連接蛋白的表達(dá)，降低炎癥因子的產(chǎn)生，從而維持iBRB的完整性[16]。這些在內(nèi)皮細(xì)胞之間附著位點(diǎn)的連接也起到調(diào)節(jié)信號(hào)系統(tǒng)，維持細(xì)胞位置，通過接觸抑制抑制生長(zhǎng)，并保護(hù)細(xì)胞免受凋亡的作用[17]。

血管形成需要內(nèi)皮細(xì)胞增殖和遷移，Notch信號(hào)通路很可能在成人血管穩(wěn)態(tài)中起作用，并受到糖代謝失調(diào)的影響。Yan等[18]在糖尿病小鼠模型的毛細(xì)血管中識(shí)別出Jagged1/Notch信號(hào)的紊亂，認(rèn)為內(nèi)皮細(xì)胞的葡萄糖代謝會(huì)影響Notch信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)和發(fā)育性血管生成。另外，高糖能以時(shí)間依賴性的方式誘導(dǎo)REC中的長(zhǎng)鏈非編碼RNA(lncRNA)-MIAT的表達(dá)，增強(qiáng)REC的增殖和遷移能力，導(dǎo)致病理性血管形成[8]。高糖激活Src、PI3K/Akt1/eNOS和ERKs通路并上調(diào)肝素酶增強(qiáng)了小鼠和人REC的遷移[19]。circHIPK3是一種新的環(huán)狀RNA，作為一種內(nèi)源性的miR-30a-3p海綿，可以隔離和抑制miR-30a-3p的活性，從而導(dǎo)致VEGF-C、FZD4和WNT2的表達(dá)增加，影響血管內(nèi)皮生成功能，在糖尿病相關(guān)的應(yīng)激源后，內(nèi)皮細(xì)胞的circHIPK3表達(dá)顯著上調(diào)；體外高糖培養(yǎng)人REC結(jié)果顯示，circHIPK3表達(dá)增高使人REC的活力提高，增殖、遷移和促血管形成能力均增強(qiáng)[20]。此外，糖尿病環(huán)境中促炎細(xì)胞因子的上調(diào)可能通過靶向REC直接參與誘導(dǎo)血管形成，并通過誘導(dǎo)REC產(chǎn)生促血管生成介質(zhì)來間接誘導(dǎo)血管形成。

3 DR中REC炎癥和凋亡

視網(wǎng)膜內(nèi)無細(xì)胞毛細(xì)血管的形成是DR的一個(gè)顯著特征，是由REC和周細(xì)胞的凋亡引起的，促炎細(xì)胞因子誘導(dǎo)活性氧(ROS)和一氧化氮的形成，通過形成過氧亞硝酸鹽，降低Hsp27含量，導(dǎo)致REC凋亡[21]。REC缺失預(yù)示著DR增殖前形式的視網(wǎng)膜損傷。REC凋亡發(fā)生在許多應(yīng)激源的反應(yīng)中，包括高糖、氧化應(yīng)激、缺氧，最廣泛的研究是暴露于高糖。在糖尿病動(dòng)物模型中，視網(wǎng)膜血管暴露于高糖會(huì)引起細(xì)胞凋亡導(dǎo)致REC丟失[22]。動(dòng)物體內(nèi)晚期糖基化終末產(chǎn)物及ROS顯著增加了細(xì)胞凋亡。DR中Caspase-3蛋白激活通過線粒體通路、Fas-FasL配體依賴通路，以及炎癥介導(dǎo)的TNF、IL-1β通路這三種途徑介導(dǎo)REC凋亡。

糖尿病患者和實(shí)驗(yàn)性糖尿病或半乳糖血癥動(dòng)物模型的REC的死亡增加[23]。然而在高糖誘導(dǎo)REC的體外研究中，得到了相互矛盾的結(jié)果。一些體外研究表明，暴露于高糖的REC活力降低，凋亡增加[19,24-26]。而另一些研究中，高糖對(duì)REC凋亡沒有影響[27]，甚至促進(jìn)細(xì)胞增殖[28-30]，間歇性高糖對(duì)人REC的增殖作用高于持續(xù)性高糖，高糖對(duì)培養(yǎng)過程中大血管和微血管內(nèi)皮細(xì)胞的活力和凋亡具有不同的影響[28]。這些研究表明，REC對(duì)高糖的反應(yīng)可能是復(fù)雜的，涉及直接和間接的影響，因此可能受到物種、細(xì)胞制備和培養(yǎng)條件等差異的影響。

也有觀點(diǎn)認(rèn)為,是細(xì)胞因子而不是高糖誘導(dǎo)REC中的炎癥途徑和凋亡變化，糖尿病相關(guān)內(nèi)皮細(xì)胞損傷主要是由于葡萄糖誘導(dǎo)鄰近細(xì)胞的細(xì)胞因子釋放，而不是高血糖對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞本身的直接影響[3]。Busik等[27]發(fā)現(xiàn)，高糖誘導(dǎo)的炎癥細(xì)胞因子增加導(dǎo)致REC的凋亡，比單純的高糖誘導(dǎo)的更多?；啄さ囊恍┏煞?IV型膠原非膠原酶1結(jié)構(gòu)域)也被認(rèn)為可以抑制小鼠REC的增殖，并通過降低關(guān)鍵的抗凋亡蛋白Bcl-xL和Bcl-2的水平以刺激細(xì)胞凋亡[31-32]。長(zhǎng)期暴露于高糖會(huì)導(dǎo)致人REC衰老，增加群體倍增時(shí)間[33]。REC死亡可能導(dǎo)致毛細(xì)血管關(guān)閉，加速死亡和隨之而來的內(nèi)皮細(xì)胞加速更新將導(dǎo)致血管壁持續(xù)重塑，最終導(dǎo)致糖尿病視網(wǎng)膜血管的結(jié)構(gòu)改變(微動(dòng)脈瘤、擴(kuò)張)，因?yàn)閺?fù)制周轉(zhuǎn)率的增加將過早地耗盡細(xì)胞的復(fù)制潛能[23]。

葡萄糖異常也是由NLRP3炎癥小體介導(dǎo)的無菌性炎癥反應(yīng)的一個(gè)重要觸發(fā)器。高血糖觸發(fā)REC上調(diào)IL-1β的表達(dá)，IL-1β作為自分泌或旁分泌刺激REC或大膠質(zhì)細(xì)胞中IL-1β的表達(dá)，從而導(dǎo)致IL-1β的持續(xù)過表達(dá)，IL-1β導(dǎo)致ROS的釋放，并促進(jìn)NF-κB易位到細(xì)胞核，從而產(chǎn)生持續(xù)的炎癥反應(yīng)。炎癥小體3(NLRP3)是細(xì)胞內(nèi)的先天免疫蛋白，能夠和ASC、Caspase-1組裝形成炎性蛋白復(fù)合物，促進(jìn)TNF-α和IL-1β成熟和分泌，引起炎癥性細(xì)胞焦亡。DR患者增殖膜中NLRP3、Caspase-1和IL-1β蛋白表達(dá)升高，免疫熒光染色顯示NLRP3和IL-1β共定位于REC[31]。體外高糖培養(yǎng)人REC，NLRP3、Caspase-1和IL-1β mRNA均顯著增加，上清液IL-1β水平呈時(shí)間依賴性升高，炎癥小體的特異性抑制劑MCC950及沉默NEK7能夠抑制NLRP3炎癥小體的激活，Caspase-1和IL-1β前體向成熟Caspase-1和IL-1β的轉(zhuǎn)化[34]。高糖激活人REC中P2X7/NLRP3通路，促進(jìn)炎癥因子IL-1β的表達(dá)和釋放[35]。高糖激活REC上的P2X7受體也能導(dǎo)致促炎介質(zhì)TLR-4、IL-1β、IL-6、TNF-α、IL-8以及VEGF-A和ICAM-1的表達(dá)增加，同時(shí)增強(qiáng)了ROS的產(chǎn)生[15]。糖尿病小鼠激活CD40受體通過Müller細(xì)胞釋放ATP和上調(diào)P2X7雙重機(jī)制誘導(dǎo)REC的凋亡[4]。

4 小結(jié)

REC和嵌在靜脈和毛細(xì)血管的基底膜上的周細(xì)胞共同組成了iBRB的基本框架,周細(xì)胞包裹著REC，提供結(jié)構(gòu)和信號(hào)支持[36]，視網(wǎng)膜內(nèi)皮功能障礙可能是周細(xì)胞的丟失與REC脫失導(dǎo)致脫細(xì)胞毛細(xì)血管形成的共同結(jié)果。盡管本綜述主要探討REC的功能障礙，但REC與周細(xì)胞、Müller細(xì)胞、神經(jīng)元和小膠質(zhì)細(xì)胞共同組成了RVUT，細(xì)胞間的相互作用對(duì)正常的REC功能至關(guān)重要，細(xì)胞間的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)和失調(diào)導(dǎo)致視網(wǎng)膜血管疾病的發(fā)展。在體內(nèi)，糖尿病相關(guān)的REC損傷可能主要是由于葡萄糖誘導(dǎo)鄰近細(xì)胞的細(xì)胞因子釋放，而不是高糖對(duì)REC本身的直接影響。小膠質(zhì)細(xì)胞激活后分泌炎癥因子，神經(jīng)元細(xì)胞死亡后分泌的炎癥因子和ATP都可以導(dǎo)致REC的炎癥反應(yīng)及凋亡。用人脂肪組織來源的基質(zhì)細(xì)胞在小鼠中作為功能周細(xì)胞，可以抑制高糖誘導(dǎo)的牛REC的促炎激活[37]。REC之間以及與其他細(xì)胞間的信號(hào)串?dāng)_是很有意義的研究方向，能夠?yàn)橹委烡R提供新的思路。