夏江南 沈 蕾 李晶晶

視網(wǎng)膜缺血-再灌注(RIR)損傷參與了多種眼科疾病發(fā)生和發(fā)展的過程,如急性青光眼、視神經(jīng)病變、糖尿病視網(wǎng)膜病變、視網(wǎng)膜血管阻塞等[1]。RIR損傷的特點(diǎn)是神經(jīng)元廣泛缺失,視網(wǎng)膜形態(tài)變性,視網(wǎng)膜功能喪失,最終導(dǎo)致視力損害和喪失視力[2]。視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞(RGC)是視網(wǎng)膜的一種重要神經(jīng)元,將視網(wǎng)膜通過光傳輸?shù)却碳か@得的信息傳遞給大腦,尤其容易受到RIR的影響[3],因此，以神經(jīng)保護(hù)為基礎(chǔ)的治療可能是減少RGC損傷和改善RIR損傷的新策略。近年來,越來越多的研究表明，炎癥反應(yīng)與RIR損傷有一定的關(guān)系。有研究證明,Toll樣受體4/NOD樣受體熱蛋白結(jié)構(gòu)域相關(guān)蛋白3 (TLR4/NLRP3)炎癥小體的激活參與了RIR的發(fā)生和發(fā)展[4]。NLRP3炎癥小體以半胱天冬酶-1依賴的方式觸發(fā),使細(xì)胞膜崩解而穿孔,導(dǎo)致炎癥因子釋放[5]。To11樣受體(TLRs)是機(jī)體內(nèi)最重要的模式識別受體,如TLR4在調(diào)節(jié)固有免疫及適應(yīng)性免疫中起到重要作用,可誘導(dǎo)下游NLRP3炎癥小體的表達(dá)[6]。在RIR損傷中,TLR4信號轉(zhuǎn)導(dǎo)被激活,導(dǎo)致NLRP3炎癥小體激活,進(jìn)一步觸發(fā)了白細(xì)胞介素(IL)-18和IL-1β的產(chǎn)生,導(dǎo)致視網(wǎng)膜功能改變[7]。Krüppel樣因子7(KLF7)是KLFs轉(zhuǎn)錄因子家族中的一員,可以調(diào)節(jié)細(xì)胞的生長、增殖、遷移、分化、代謝、炎癥和凋亡。有研究報道,KLF7與多種人類疾病有關(guān)，包括癌癥、肥胖、糖尿病、炎癥和心血管疾病等[8]。但是關(guān)于KLF7在眼部疾病中的研究很少，因此，本研究探討KLF7是否通過TLR4/NLRP3炎癥小體的激活調(diào)控細(xì)胞的凋亡,從而影響大鼠RIR的病理過程。

1 材料與方法

1.1 實驗動物健康無眼疾SD大鼠60只,雄性,體重300～350 g,10周齡,購于北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司[SCXK(京)2020-0005]。統(tǒng)一在籠中飼養(yǎng)。室溫21～26 ℃,相對濕度50%～60%,光暗交替各12 h。實驗動物使用遵循《國家實驗動物管理保護(hù)條例》以及《實驗動物醫(yī)學(xué)倫理條例》。

1.2 主要試劑AAV2-KLF7腺病毒購自美國 Vector BioLabs 公司;放射免疫沉淀法(RIPA)裂解液購自濟(jì)南信嘉生物技術(shù)有限公司;兔抗小鼠 KLF7抗體、兔抗小鼠 TLR4抗體、兔抗小鼠髓樣分化因子初次應(yīng)答基因88(MYD88)抗體、兔抗小鼠 NLRP3抗體、兔抗小鼠腫瘤壞死因子受體相關(guān)分子6(TRAF6)抗體均購自美國Sigma公司;辣根酶標(biāo)記山羊抗兔IgG購自北京索萊寶公司;蘇木精-伊紅(HE)購自北京博奧森生物技術(shù)有限公司;ELISA試劑盒、BCA蛋白檢測試劑盒均購自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司;紅霉素眼膏購自河南同源制藥有限公司。

1.3 方法

1.3.1 實驗分組和動物模型建立將60只大鼠隨機(jī)分為對照組、RIR組和KLF7組,每組各20只。除對照組外,其他組采用前房內(nèi)生理鹽水灌注法建立RIR模型[9]，均以右眼為實驗眼,方法為：采用100 g·L-1水合氯醛以3 mL·kg-1進(jìn)行注射麻醉,麻醉成功后,將大鼠俯臥位固定于鼠架固定器上,復(fù)方托品酰胺散瞳,氯霉素滴眼液清潔結(jié)膜囊,然后進(jìn)行RIR的誘導(dǎo)。將充滿生理鹽水的輸液器始端與血壓計的輸氣管相連接,輸液器尾端連接7號針頭,按壓血壓計氣囊使水銀柱升高至140 mmHg(1 kPa=7.5 mmHg)。在大鼠前瞼裂距角鞏膜緣1.5 mm處將針頭刺入大鼠右眼結(jié)膜下,然后潛行到角鞏膜緣處穿刺進(jìn)入前房。這時水銀顯示的壓力為大鼠眼壓,繼續(xù)使血壓計水銀柱升高至110 mmHg,維持60 min。眼底鏡下觀察到大鼠視網(wǎng)膜蒼白，說明視網(wǎng)膜缺血形成。大鼠加壓60 min后緩慢放開充氣柄開關(guān),待血壓計降至14 mmHg緩慢拔出灌注針頭。術(shù)后在結(jié)膜囊內(nèi)涂紅霉素眼膏預(yù)防感染。KLF7組大鼠腹腔注射2 μL AAV2-KLF7 腺病毒(含1×1011pfu·mL-1病毒),對照組和RIR組大鼠注射100 μL PBS，均每天注射1次，連續(xù)注射7 d。

1.3.2 HE染色觀察大鼠視網(wǎng)膜形態(tài)變化AAV2-KLF7 腺病毒注射7 d后處死每組大鼠各6只,腹腔注射100 g·L-1水合氯醛麻醉處死大鼠,立即摘除眼球,置于體積分?jǐn)?shù)10%福爾馬林中固定,石蠟包埋。石蠟包埋標(biāo)本切成5 μm的切片。切片進(jìn)行HE染色。二甲苯I和二甲苯II去蠟、脫蠟,體積分?jǐn)?shù)分別為95%、80%、70%乙醇浸泡1 min,蒸餾水沖洗1 min,HE染色,逐級酒精脫水,透明,用中性樹膠封片,顯微鏡下拍照。使用Image-Pro Plus軟件進(jìn)行圖像分析,測量神經(jīng)節(jié)細(xì)胞層(GCL)厚度和GCL中RGC數(shù)量,每組隨機(jī)取3眼，每眼測量4次取平均值。

1.3.3 Western blot檢測視網(wǎng)膜組織中KLF7、TLR4、MYD88、NLRP3、TRAF6蛋白表達(dá)水平隨機(jī)取7只大鼠，采用含有苯甲基磺酰氟的RIPA裂解緩沖液裂解視網(wǎng)膜組織,采用BCA蛋白檢測試劑盒測定蛋白濃度,蛋白在十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠中電泳分離,轉(zhuǎn)移到PVDF膜上。然后用體積分?jǐn)?shù)5%牛血清白蛋白(BSA)阻斷細(xì)胞膜,用KLF7(1500)、TLR4(11000)、MYD88(1500)、NLRP3(11000)、TRAF6(1500)一抗和辣根酶標(biāo)記山羊抗兔IgG孵育1 h。采用增強(qiáng)化學(xué)發(fā)光法觀察其免疫反應(yīng),凝膠成像系統(tǒng)進(jìn)行發(fā)光顯影。

1.3.4 TUNEL檢測RGC凋亡按1.3.2中方法，視網(wǎng)膜切片脫蠟,用新鮮配制體積分?jǐn)?shù)1%的Triton X-100室溫孵育30 min,PBS洗3次。配備TUNEL工作液,每個樣品中使用1 μL TdT酶,20 μL熒光標(biāo)記液，滴加配備后TUNEL工作液,在37 ℃中孵育60 min,PBS洗滌3次。滴加體積分?jǐn)?shù)30%的DAPI抗熒光淬滅劑封片,熒光顯微鏡拍照。統(tǒng)計視網(wǎng)膜切片中的TUNEL陽性的RGC數(shù)量,并計算TUNEL陽性細(xì)胞占比。

1.3.5 ELISA法檢測視網(wǎng)膜組織中1L-18和1L-1β表達(dá)水平隨機(jī)取7只大鼠，分離視網(wǎng)膜,勻漿于生理鹽水中,300 r·min-1離心10 min,獲得視網(wǎng)膜蛋白提取物,將其離心處理,1000 r·min-1離心20 min,去除沉淀物,用增強(qiáng)型BCA蛋白檢測試劑盒測定蛋白質(zhì)濃度。按照說明書,使用ELISA試劑盒檢測大鼠視網(wǎng)膜中1L-18和1L-1β表達(dá)水平。

1.4 統(tǒng)計學(xué)處理采用 SPSS 19.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計處理,計量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示,組間計量資料的比較采用t檢驗,多組間比較采用單因素方差分析。檢驗水準(zhǔn)：α=0.05。

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠視網(wǎng)膜形態(tài)學(xué)變化HE染色結(jié)果顯示,對照組大鼠的視網(wǎng)膜內(nèi)界膜平滑完整,RGC呈單層排列,核較大,核內(nèi)染色質(zhì)分布均勻。內(nèi)叢狀層厚,呈網(wǎng)狀結(jié)構(gòu),內(nèi)核層排列整齊,外核層排列整齊緊密。與對照組相比，RIR組大鼠視網(wǎng)膜內(nèi)層、內(nèi)叢狀層水腫加重,內(nèi)核層、外核層細(xì)胞排列明顯疏松、紊亂,RGC數(shù)量減少。與RIR組相比，KLF7組大鼠內(nèi)界膜恢復(fù)平滑,視網(wǎng)膜水腫逐漸減輕,部分細(xì)胞呈空泡樣變,RGC數(shù)量減少,損傷程度明顯減輕(圖1A)。與對照組相比，RIR組和KLF7組大鼠GCL厚度及GCL中RGC數(shù)量均降低(均為P<0.05)；與RIR組相比，KLF7組大鼠GCL厚度及GCL中RGC數(shù)量均升高(均為P<0.05)(圖1B和圖1C)。

圖1 各組大鼠視網(wǎng)膜形態(tài)變化情況 A：HE染色結(jié)果；B：三組大鼠GCL厚度比較；C：三組大鼠GCL中RGC數(shù)量比較。與對照組相比,*P<0.05;與RIR組相比,#P<0.05。

2.2 各組大鼠視網(wǎng)膜組織中KLF7蛋白表達(dá)水平Western blot檢測結(jié)果顯示,與對照組相比，RIR組大鼠視網(wǎng)膜KLF7蛋白的相對表達(dá)水平升高(P<0.05)。KLF7組大鼠視網(wǎng)膜KLF7蛋白的表達(dá)水平均顯著高于RIR組和對照組(均為P<0.05)(圖2A和圖2B)。

圖2 各組大鼠視網(wǎng)膜中KLF7蛋白的表達(dá) A：Western blot檢測蛋白表達(dá)情況；B：三組大鼠KLF7蛋白相對表達(dá)水平比較。與對照組相比,*P<0.05;與RIR組相比,#P<0.05。

2.3 各組大鼠RGC凋亡TUNEL檢測結(jié)果顯示,與對照組相比，RIR組和KLF7組大鼠視網(wǎng)膜中TUNEL陽性RGC占比均升高(均為P<0.05)。與RIR組相比，KLF7組大鼠視網(wǎng)膜中TUNEL陽性RGC占比降低(P<0.05)(圖3)。

圖3 各組大鼠RGC凋亡情況 A：TUNEL染色代表性圖片；B：三組大鼠TUNEL陽性RGC占比比較。與對照組相比,*P<0.05;與RIR組相比,#P<0.05。

2.4 各組大鼠視網(wǎng)膜組織中TLR4/NLRP3炎癥小體激活情況Western blot檢測結(jié)果顯示,與對照組相比，RIR組和KLF7組大鼠視網(wǎng)膜中TLR4、MYD88、NLRP3、TRAF6 蛋白的相對表達(dá)水平均升高(均為P<0.05)。與RIR組相比，KLF7組大鼠視網(wǎng)膜中TLR4、MYD88、NLRP3、TRAF6 蛋白的相對表達(dá)水平均降低(均為P<0.05)(圖4A和圖4B)。

圖4 各組大鼠TLR4/NLRP3炎癥小體激活情況 A：Western blot檢測蛋白表達(dá)情況；B：三組大鼠TLR4/NLRP3相關(guān)蛋白表達(dá)水平比較。與對照組相比,*P<0.05;與RIR組相比,#P<0.05。

2.5 各組大鼠視網(wǎng)膜組織中1L-18、1L-1β表達(dá)水平ELISA法檢測結(jié)果顯示,與對照組相比，RIR組和KLF7組大鼠視網(wǎng)膜中1L-18、1L-1β表達(dá)水平均升高(均為P<0.05)。與RIR組相比，KLF7組大鼠視網(wǎng)膜中IL-18、IL-1β表達(dá)水平均顯著降低(均為P<0.05)(圖5A和圖5B)。

圖5 各組大鼠視網(wǎng)膜炎癥因子表達(dá)情況 A：三組大鼠視網(wǎng)膜中IL-18表達(dá)水平比較；B：三組大鼠視網(wǎng)膜中IL-1β表達(dá)水平比較。與對照組相比,*P<0.05;與RIR組相比,#P<0.05。

3 討論

RIR損傷是眼科常見的疾病,主要病因可能是由于閉角型青光眼急性發(fā)作、視網(wǎng)膜血管阻塞性疾病、糖尿病視網(wǎng)膜病變以及影響視網(wǎng)膜血流的眼科手術(shù)等引起[10]。RIR損傷可引起嚴(yán)重的視力損害,甚至還可以導(dǎo)致視力喪失。目前臨床治療主要是從控制眼壓、改善循環(huán)和營養(yǎng)神經(jīng)等方面進(jìn)行治療[11],但收效甚微。所以,深入了解RIR損傷的生理、病理改變和發(fā)生發(fā)展的過程,進(jìn)一步探討RGC的凋亡路徑，為治療RIR損傷,改善視力提供新思路。

KLF7參與了多種病理和生理的過程,為關(guān)鍵調(diào)控轉(zhuǎn)錄因子,能夠調(diào)控軸突再生、神經(jīng)元形態(tài)、神經(jīng)母細(xì)胞分化和感覺神經(jīng)元存活[12]。在神經(jīng)損傷反應(yīng)中,KLF7能夠介導(dǎo)軸突對損傷的反應(yīng)。相關(guān)研究表明,KLF7 可減輕脊髓損傷大鼠的神經(jīng)損傷,改善其運(yùn)動功能[13]。也有研究表示,KLF7 對氧-葡萄糖剝奪/復(fù)氧誘導(dǎo)的海馬神經(jīng)元RIR細(xì)胞損傷具有保護(hù)作用[14]。為了解KLF7在RIR損傷中的作用,本研究通過HE染色發(fā)現(xiàn),注射AAV2-KLF7 腺病毒的RIR模型大鼠視網(wǎng)膜水腫逐漸減輕,損傷程度明顯減輕,GCL厚度和GCL中RGC數(shù)量都明顯高于RIR模型大鼠。進(jìn)而說明KLF7對機(jī)體免受RIR損傷具有一定的保護(hù)作用。有研究表明，KLF7過表達(dá)可提高RGC的存活率,保護(hù)其電生理功能[15],與本研究結(jié)論相似。

TLR4屬于TLRs家族,研究發(fā)現(xiàn),TLR4在視網(wǎng)膜及中樞神經(jīng)系統(tǒng)缺血-再灌注損傷中起重要作用,TLR4信號能夠激活依賴性MYD88和非依賴性MYD88的通路,促進(jìn)促炎基因和炎癥細(xì)胞因子的表達(dá)[16]。在TLR4信號通路中,通過MYD88募集TRAF6,最終導(dǎo)致免疫發(fā)生,激活炎癥反應(yīng)[17]。NLRP3 是炎癥小體的核心蛋白,可以促進(jìn)IL-18和1L-1β剪切成熟,導(dǎo)致炎癥介質(zhì)大量釋放及DNA損傷,使細(xì)胞發(fā)生滲透性崩解,誘發(fā)炎癥因子形成炎性瀑布效應(yīng),誘導(dǎo)炎癥反應(yīng)激活[18]。相關(guān)研究表明,視網(wǎng)膜缺血-再灌注損傷可通過MYD88、TRAF6誘導(dǎo)TLR4信號激活,進(jìn)而導(dǎo)致NRLP3炎癥小體激活和IL-1β、IL-18的分泌[19]。本研究結(jié)果表明,注射AAV2-KLF7 腺病毒的RIR模型大鼠視網(wǎng)膜組織中TLR4、MYD88、NLRP3、TRAF6 蛋白的表達(dá)水平均顯著低于RIR模型大鼠,IL-1β、IL-18表達(dá)水平顯著低于RIR模型大鼠,從而說明KLF7對機(jī)體免受RIR損傷的保護(hù)作用可能是通過抑制TLR4/NLRP3炎癥小體激活介導(dǎo),為視網(wǎng)膜RIR損傷炎癥反應(yīng)提供了一種新的治療策略。

NLRP3誘導(dǎo)的神經(jīng)炎癥參與了眼病的發(fā)病和發(fā)展,研究表明,部分視神經(jīng)受壓力損傷小鼠模型中,NLRP3敲除后,ASC、Caspase-1、IL-1β表達(dá)減少,RGC存活明顯延長,提示NLRP3炎癥小體加重了炎癥的損傷,進(jìn)一步導(dǎo)致RGC丟失[20]。另外,在之前的研究中已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了TLR4與RGC損傷之間的關(guān)系,TLR4敲除致視神經(jīng)損傷的小鼠RGC存活率高于TLR4野生型小鼠[21]。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn),注射AAV2-KLF7 腺病毒的RIR模型大鼠TUNEL陽性細(xì)胞占比低于RIR模型大鼠,說明KLF7抑制RIR損傷中TLR4/NLRP3炎癥小體的激活來抑制視網(wǎng)膜神經(jīng)細(xì)胞的凋亡。

綜上,KLF7對RIR損傷具有保護(hù)作用,KLF7可能通過抑制TLR4/NLRP3炎癥小體的激活來減輕RIR的損傷。