莊海容 吳子?xùn)| 陳雪紅 李成軍

增生性玻璃體視網(wǎng)膜病變是一類較為常見的眼科疾病，嚴(yán)重時(shí)會(huì)導(dǎo)致玻璃體積血、視網(wǎng)膜脫落甚至失明。其主要的病理學(xué)機(jī)制為視網(wǎng)膜色素上皮(RPE)細(xì)胞的上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化(EMT)[1-2]。探討RPE細(xì)胞發(fā)生EMT的潛在分子機(jī)制，有助于為增生性玻璃體視網(wǎng)膜病變的防治提供參考依據(jù)。

微小RNA(miRNA)作為轉(zhuǎn)錄后調(diào)節(jié)器，參與了RPE細(xì)胞的EMT過程[3-4]。轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子(TGF)-β1是一種多功能的細(xì)胞因子，在胚胎發(fā)育、傷口愈合、纖維化疾病和癌癥轉(zhuǎn)移期間均能誘發(fā)EMT[5]。Qi等[6]指出，在纖維化肺組織中miR-34a表達(dá)下調(diào)，而過表達(dá)miR-34a可以抑制TGF-β1誘導(dǎo)的肺上皮細(xì)胞EMT。國(guó)外有報(bào)道顯示，miR-34a可以抑制各類腫瘤細(xì)胞的EMT行為[7]。Hou等[8]則明確提出miR-34a-5p可以抑制RPE細(xì)胞增殖與遷移。然而，miR-34a-5p對(duì)RPE細(xì)胞的作用機(jī)制仍未知。

我們初期通過生物信息學(xué)分析發(fā)現(xiàn)，miR-34a-5p與TGF-β/Smad通路主要分子均存在靶向結(jié)合位點(diǎn)。TGF-β/Smad通路的激活可以促進(jìn)細(xì)胞的EMT，這已被大量研究所證實(shí)[9-11]。由此推測(cè)miR-34a-5p可能通過抑制TGF-β/Smad通路阻止RPE細(xì)胞發(fā)生EMT。本研究采用TGF-β1誘導(dǎo)ARPE-19細(xì)胞發(fā)生EMT，同時(shí)上調(diào)細(xì)胞內(nèi)miR-34a-5p的表達(dá)，探討miR-34a-5p對(duì)ARPE-19細(xì)胞TGF-β/Smad通路相關(guān)蛋白表達(dá)及細(xì)胞增殖、遷移和EMT的影響。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 細(xì)胞RPE細(xì)胞系A(chǔ)RPE-19細(xì)胞購自美國(guó)ATCC細(xì)胞庫。將細(xì)胞放入含有體積分?jǐn)?shù)10%胎牛血清的DMEM/F12培養(yǎng)基中，置于37 ℃含體積分?jǐn)?shù)5%的CO2培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)。

1.1.2 試劑與儀器TGF-β1(南京歐凱生物科技有限公司)，Transwell小室(美國(guó)Corning公司)，Lipofectamine 2000轉(zhuǎn)染試劑(美國(guó)Introvigen公司)，MTT細(xì)胞增殖檢測(cè)試劑盒、各類抗體與DMEM/F12培養(yǎng)基(德國(guó)默克公司)，增強(qiáng)型電化學(xué)發(fā)光試劑盒、電泳凝膠(上海碧云天生物技術(shù)有限公司)。細(xì)胞培養(yǎng)箱(武漢培因公司)，激光共聚焦掃描顯微鏡(德國(guó)Zeiss公司)，酶標(biāo)儀(上海賽默飛世爾公司)，凝膠成像分析儀(北京六一儀器廠)。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞分組與干預(yù)將ARPE-19細(xì)胞分為4組：對(duì)照組、TGF-β1組、miR-34a-5p 過表達(dá)組與復(fù)合干預(yù)組，每孔接種5×104個(gè)細(xì)胞于24孔板中，培養(yǎng)至細(xì)胞融合后，對(duì)照組與TGF-β1組采用Lipofectamine 2000轉(zhuǎn)染試劑轉(zhuǎn)染對(duì)照模擬物，miR-34a-5p 過表達(dá)組與復(fù)合干預(yù)組轉(zhuǎn)染miR-34a-5p模擬物，培養(yǎng)24 h后采用無血清培養(yǎng)基饑餓培養(yǎng)12 h，TGF-β1組與miR-34a-5p 過表達(dá)組均添加10 mg·L-1的TGF-β1，復(fù)合干預(yù)組添加10 mg·L-1的TGF-β1與10 μmol·L-1的 TGF-β通路激活劑SRI-011381，各組細(xì)胞繼續(xù)培養(yǎng)24 h，測(cè)定細(xì)胞增殖、遷移與EMT。

1.2.2 Ki67熒光染色檢測(cè)細(xì)胞增殖情況收集各組細(xì)胞，室溫下用40 g·L-1的多聚甲醛固定20 min，PBS 沖洗3次，用體積分?jǐn)?shù)10% 牛血清白蛋白在37 ℃孵育30 min，并與Ki67單抗在4 ℃孵育過夜，次日與DAPI 染色液在37 ℃孵育5 min，使用激光共聚焦顯微鏡拍照。

1.2.3 劃痕實(shí)驗(yàn)與Transwell實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞遷移和侵襲能力劃痕實(shí)驗(yàn)：使用無血清培養(yǎng)基培養(yǎng)細(xì)胞，用無菌移液管尖端在各組細(xì)胞培養(yǎng)基上刮擦形成同寬度的傷口，用PBS洗滌細(xì)胞，于37 ℃含體積分?jǐn)?shù)5% CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，顯微鏡下拍照。 Transwell實(shí)驗(yàn)：采用胰蛋白酶消化細(xì)胞，取2×104個(gè)細(xì)胞加入Transwell上室，將400 μL含體積分?jǐn)?shù)10% 胎牛血清的DMEM/F12培養(yǎng)基加入下室，將Transwell小室置于37 ℃含體積分?jǐn)?shù)5% CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，18 h后去除膜上未遷移細(xì)胞，室溫下使用40 g·L-1多聚甲醛固定15 min，然后使用1 g·L-1結(jié)晶紫染色20 min，于顯微鏡下隨機(jī)選取5個(gè)視野對(duì)細(xì)胞進(jìn)行計(jì)數(shù)。

1.2.4 免疫熒光染色測(cè)定細(xì)胞EMT相關(guān)蛋白表達(dá)情況細(xì)胞EMT標(biāo)記物，包括上皮標(biāo)志物鈣黏蛋白E、間質(zhì)化標(biāo)志物α平滑肌肌動(dòng)蛋白(α-SMA)與纖維連接蛋白。收集各組細(xì)胞，室溫下用40 g·L-1多聚甲醛固定20 min，PBS 沖洗3次，與體積分?jǐn)?shù)10%的牛血清白蛋白在37 ℃下孵育30 min，并與一抗在4 ℃下孵育過夜，次日加入二抗于37 ℃下孵育1 h，DAPI染色液孵育5 min，使用激光共聚焦顯微鏡拍照。

1.2.5 Western blot檢測(cè)細(xì)胞TGF-β/Smad通路相關(guān)蛋白的表達(dá)采用Western blot測(cè)定TGF-β受體1、2(TGF-βR1、TGF-βR2)，Smad2，Smad3和磷酸化Smad2、3(p-Smad2、p-Smad3)的表達(dá)量。首先裂解細(xì)胞釋放總蛋白，取30 g蛋白樣本進(jìn)行凝膠電泳，轉(zhuǎn)移至聚偏二氟乙烯膜，使用體積分?jǐn)?shù)5%的脫脂牛奶封閉1 h，于4 ℃下與一抗孵育過夜，次日使用PBS (含體積分?jǐn)?shù)0.1%的吐溫-20)清洗膜后，于室溫下加入辣根過氧化物酶標(biāo)記的二抗孵育1 h，再次清洗后，采用增強(qiáng)型電化學(xué)發(fā)光試劑顯影，于凝膠成像儀下拍照，以甘油醛-3-磷酸脫氫酶編碼mRNA作為內(nèi)參，計(jì)算相對(duì)表達(dá)量。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析采用GraphPad Prism 8.0進(jìn)行數(shù)據(jù)分析與圖形繪制，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，采用單因素方差分析與獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)進(jìn)行組間比較。檢驗(yàn)水準(zhǔn)：α=0.05。

2 結(jié)果

2.1 各組ARPE-19細(xì)胞中TGF-β/Smad通路相關(guān)蛋白表達(dá)的比較采用Western blot法檢測(cè)各組ARPE-19細(xì)胞內(nèi)TGF-β/Smad通路相關(guān)蛋白的表達(dá)水平，結(jié)果顯示：與對(duì)照組相比，TGF-β1組細(xì)胞內(nèi)TGF-βR1、TGF-βR2、p-Smad2和p-Smad3的表達(dá)水平均增高(均為P<0.05,圖1)，表明TGF-β1能夠顯著激活A(yù)RPE-19細(xì)胞內(nèi)的TGF-β/Smad信號(hào)通路；另外，與TGF-β1組相比，miR-34a-5p過表達(dá)組能夠明顯逆轉(zhuǎn)TGF-β1對(duì)TGF-β/Smad信號(hào)通路的激活作用(圖1)。除此之外，與miR-34a-5p過表達(dá)組相比，復(fù)合干預(yù)組細(xì)胞內(nèi)TGF-β/Smad信號(hào)通路明顯被激活。以上結(jié)果表明，過表達(dá)miR-34a-5p能夠抑制ARPE-19細(xì)胞內(nèi)TGF-β/Smad信號(hào)通路。

圖1 各組ARPE-19細(xì)胞中TGF-β/Smad通路相關(guān)蛋白表達(dá)情況 *P<0.05。

2.2 各組ARPE-19細(xì)胞增殖能力的比較采用免疫熒光染色檢測(cè)ARPE-19細(xì)胞內(nèi)Ki67蛋白的表達(dá)水平,結(jié)果顯示：對(duì)照組細(xì)胞Ki67陽性率為(8.33±3.21)%；與對(duì)照組相比，TGF-β1組細(xì)胞Ki67陽性率為(19.33±2.50)%，明顯升高(P<0.05)。另外，與TGF-β1組相比，miR-34a-5p 過表達(dá)組細(xì)胞Ki67陽性率為(6.67±1.52)%，明顯降低(P<0.05)。與miR-34a-5p過表達(dá)組相比，復(fù)合干預(yù)組細(xì)胞Ki67陽性率為(16.67±1.53)%，明顯升高(P<0.05，圖2)。以上結(jié)果表明，過表達(dá)miR-34a-5p能夠通過失活TGF-β/Smad信號(hào)通路抑制ARPE-19細(xì)胞增殖能力。

圖2 各組ARPE-19細(xì)胞Ki67免疫熒光染色結(jié)果(×100)

2.3 各組細(xì)胞遷移和侵襲能力的比較劃痕實(shí)驗(yàn)和Transwell實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示：與對(duì)照組相比，TGF-β1能夠促進(jìn)ARPE-19細(xì)胞遷移和侵襲。除此之外，過表達(dá)miR-34a-5p能夠明顯抑制TGF-β1組ARPE-19細(xì)胞的遷移和侵襲能力。在復(fù)合干預(yù)組內(nèi)，TGF-β通路激活劑SRI-011381能夠明顯逆轉(zhuǎn)過表達(dá)miR-34a-5p對(duì)ARPE-19細(xì)胞遷移能力的抑制作用(圖3)。以上結(jié)果提示，過表達(dá) miR-34a-5p能通過失活TGF-β/Smad信號(hào)通路抑制TGF-β1誘導(dǎo)的ARPE-19細(xì)胞遷移和侵襲。

圖3 各組ARPE-19細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)和Transwell實(shí)驗(yàn)結(jié)果 A：各組細(xì)胞在0 h與48 h的劃痕實(shí)驗(yàn)結(jié)果(×40)；B：各組細(xì)胞Transwell實(shí)驗(yàn)結(jié)果(×40)。

2.4 各組細(xì)胞EMT情況的比較免疫熒光染色結(jié)果顯示：與對(duì)照組相比，TGF-β1組ARPE-19細(xì)胞內(nèi)α-SMA和纖維連接蛋白表達(dá)水平明顯升高，并鈣黏蛋白E的表達(dá)明顯降低，表明TGF-β1能夠促進(jìn)ARPE-19細(xì)胞發(fā)生EMT。另外，與TGF-β1組相比，miR-34a-5p過表達(dá)組ARPE-19細(xì)胞EMT被明顯抑制。在復(fù)合干預(yù)組內(nèi)，TGF-β通路激活劑SRI-011381能夠緩解過表達(dá)miR-34a-5p對(duì)ARPE-19細(xì)胞EMT的抑制作用(圖4)。以上結(jié)果表明，過表達(dá)miR-34a-5p通過抑制TGF-β/Smad信號(hào)通路逆轉(zhuǎn)TGF-β1誘導(dǎo)的EMT。

圖4 各組ARPE-19細(xì)胞 EMT標(biāo)志物(α-SMA、纖維連接蛋白、鈣黏蛋白E)的免疫熒光染色結(jié)果(×200)

3 討論

RPE細(xì)胞在TGF-β、表皮生長(zhǎng)因子與血小板生長(zhǎng)因子等刺激下過度增殖，并向小體或內(nèi)皮層遷移，且不斷轉(zhuǎn)化為成纖維細(xì)胞，進(jìn)一步形成纖維膜，而纖維膜發(fā)生收縮會(huì)造成視網(wǎng)膜發(fā)生褶皺、斷裂，形成新的視網(wǎng)膜，從而造成嚴(yán)重的視力障礙[12-14]。因此，抑制生理或病理?xiàng)l件下RPE細(xì)胞的增殖、遷移與EMT，對(duì)于視網(wǎng)膜粘連或創(chuàng)傷手術(shù)后增生性玻璃體視網(wǎng)膜病變的預(yù)防都具有重要意義。

本研究中使用了ARPE-19細(xì)胞作為研究對(duì)象，同時(shí)采用TGF-β1誘發(fā)ARPE-19細(xì)胞的EMT行為。TGF-β1刺激上皮細(xì)胞是研究中經(jīng)常使用的EMT體外模型[15]。在TGF-β1的刺激下，細(xì)胞逐漸失去上皮形態(tài)，上皮鈣黏蛋白E表達(dá)減少，且分化程度降低，表現(xiàn)為中性細(xì)胞特性，增殖與遷移能力增強(qiáng)，并發(fā)展為纖維細(xì)胞，表達(dá)更多的α-SMA與纖維連接蛋白[16-18]。本研究發(fā)現(xiàn)，過表達(dá) miR-34a-5p能顯著抑制TGF-β1誘導(dǎo)的ARPE-19細(xì)胞增殖、遷移與EMT，同時(shí)過表達(dá) miR-34a-5p抑制了ARPE-19細(xì)胞中TGF-β/Smad通路相關(guān)蛋白的表達(dá)及通路激活，而采用SRI-011381干預(yù)逆轉(zhuǎn)了過表達(dá)miR-34a-5p對(duì)增殖、遷移與EMT抑制的效果。既往證據(jù)顯示，TGF-β/SMAD通路在細(xì)胞EMT、遷移中均發(fā)揮著重要作用[19]。TGF-β1與TGF-βR1和TGF-βR2形成緊密復(fù)合體，激活Smad2與Smad3，進(jìn)而激活下游效應(yīng)分子的表達(dá)，誘發(fā)了增殖、遷移與EMT[20-21]。 由此可知，miR-34a-5p與TGF-β1/2 mRNA 3’UTR區(qū)域結(jié)合并促進(jìn)其降解，導(dǎo)致Smad2與Smad3的磷酸化激活受阻，進(jìn)而抑制了EMT。

綜上所述， miR-34a-5p是通過靶向抑制TGF-β/Smad通路激活來阻止ARPE-19細(xì)胞在應(yīng)激狀態(tài)下的增殖、遷移與EMT，miR-34a-5p/TGF-β/Smad軸有可能成為增生性玻璃體視網(wǎng)膜病變的防治靶點(diǎn)。