靳 荷 楊彬彬 蔣冬冬 鄭 柳 丁芝祥 陸素青

角膜新生血管(CNV)是引起角膜盲的主要疾病之一[1]。我們在早期研究中發(fā)現(xiàn)，CNV也是引起角膜移植排斥反應(yīng)導(dǎo)致移植失敗的主要影響因素[2-5]。2017年，LeBlanc等[6]研究發(fā)現(xiàn)，分泌粒蛋白III(Scg3)和血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)作用相似，都能夠影響糖尿病視網(wǎng)膜病變動物模型中眼底新生血管的生長，成為一種新近發(fā)現(xiàn)的新生血管影響因子，但對其的研究仍僅局限在眼底新生血管，尚未見其對CNV的生長調(diào)控進(jìn)行探索的研究。因此，本研究通過堿燒傷法建立兔CNV模型，應(yīng)用Scg3抗體進(jìn)行干預(yù)治療，觀察CNV的面積和長度變化，應(yīng)用角膜共聚焦顯微鏡、蛋白芯片法觀察Scg3抗體對眼表的影響，評估Scg3抗體是否能夠有效抑制CNV的形成，為CNV的治療提供新的思路以及實驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 實驗動物健康的成年新西蘭白兔45只，由長沙市天勤生物技術(shù)有限公司提供，體重1.7～2.0 kg，雌雄不限。所有動物實驗操作均符合《實驗動物管理條例》，并獲得桂林醫(yī)學(xué)院動物倫理委員會的批準(zhǔn)(批準(zhǔn)號：2019-0005)，給予人道主義關(guān)懷。

1.1.2 主要試劑Scg3多克隆抗體(美國LifeSpan公司)，鹽酸丙美卡因滴眼液(美國Alcon公司)，鹽酸賽拉嗪注射液(長春軍需大學(xué)獸醫(yī)研究所)，戊巴比妥鈉(上海沃凱國藥集團(tuán)化學(xué)試劑公司)，GAPDH抗體(美國Abcam公司)，二抗(美國Affinity Biosciences公司)。蛋白提取試劑盒(上海碧云天生物技術(shù)有限公司)，蛋白芯片檢測試劑盒(美國RayBiotech公司)。

1.2 方法

1.2.1 動物模型及分組處理統(tǒng)一選取兔右眼進(jìn)行實驗。鹽酸賽拉嗪注射液0.2 mL·kg-1肌肉注射配合戊巴比妥鈉30 mg·kg-1耳緣靜脈注射進(jìn)行全身復(fù)合麻醉，麻醉完全后，再用鹽酸丙美卡因滴眼液進(jìn)行眼表面麻醉。將直徑8 mm的圓形濾紙片浸泡于1.0 mol·L-1的氫氧化鈉溶液中10 s，充分浸泡后，用無菌棉簽吸除濾紙片表面多余的氫氧化鈉，將濾紙片置于兔右眼角膜中央40 s后取下，立即用生理鹽水充分沖洗右眼結(jié)膜囊及角膜堿燒傷部位，沖洗持續(xù)約2 min。堿燒傷后予以左氧氟沙星滴眼液滴眼預(yù)防感染。

未做堿燒傷的5只健康新西蘭白兔為對照組，剩余40只兔在進(jìn)行堿燒傷后隨機(jī)分為干預(yù)組和模型組2組(每組20只)，干預(yù)組兔在右眼顳上方結(jié)膜下注射0.1 mL濃度為 0.5 mg·L-1的Scg3抗體工作液，模型組兔注射0.1 mL 1×PBS溶液，均自堿燒傷之日起每隔2 d結(jié)膜下注射1次，觀察周期為14 d。

1.2.2 CNV生長情況于兔眼角膜堿燒傷后的1 d、7 d、14 d，使用裂隙燈顯微鏡攝像系統(tǒng)拍攝兔眼角膜照片。用角膜共聚焦顯微鏡觀察CNV及其血流情況。采用圖像分析軟件(ImageJ)對圖片進(jìn)行分析，測量兔眼CNV的長度(以血管朝向角膜中央生長的最長血管計算)，并測量CNV所占的鐘點數(shù)。按照Rodert公式[7]，即S=C/12×3.14×[r2-(r-l)2]計算新生血管的面積，其中S為CNV面積，C為CNV所占的鐘點數(shù)，r為角膜半徑(按兔的平均角膜半徑7 mm計算)，l為CNV的長度。

1.2.3 蛋白芯片法檢測眼前段炎癥因子于兔眼角膜堿燒傷后1 d、7 d、14 d，從模型組與干預(yù)組兔眼瞼緣邊緣和結(jié)膜囊內(nèi)收集眼表淚液，-20 ℃保存。用蛋白芯片檢測試劑盒，通過GenePix 4000B 微針列芯片掃描技術(shù)檢測細(xì)胞間黏附分子-1(ICAM-1)、白細(xì)胞介素-10(IL-10)、轉(zhuǎn)化生長因子-β1(TGF-β1)等炎癥相關(guān)細(xì)胞因子的表達(dá)。

1.2.4 Western blot檢測Scg3蛋白表達(dá)于兔眼角膜堿燒傷后 14 d，取對照組和模型組兔各5只使用過量鹽酸賽拉嗪注射液安樂死后，均取右眼角膜，液氮研磨，蛋白提取試劑盒提取總蛋白，BCA蛋白定量試劑盒進(jìn)行蛋白定量，于100 g·L-1聚丙烯酰胺凝膠中電泳。用濕轉(zhuǎn)電轉(zhuǎn)膜法將蛋白轉(zhuǎn)移到PVDF膜上，搖床封閉1.5 h后，分別加入Scg3抗體(11000)、GAPDH抗體(13000)，4 ℃過夜，加入二抗(13000)室溫下?lián)u床孵育1 h，使用ECL檢測，以GAPDH為內(nèi)參，用ImageJ軟件進(jìn)行相對灰度值定量分析。

2 結(jié)果

2.1 臨床觀察CNV對照組兔角膜未進(jìn)行堿燒傷，觀察期內(nèi)角膜正常，無CNV生長。模型組兔角膜堿燒傷后1 d，可見堿燒傷區(qū)域角膜上皮缺損，角膜緣血管擴(kuò)張，角膜出現(xiàn)明顯炎癥反應(yīng)；堿燒傷后7 d，角膜緣出現(xiàn)CNV向角膜內(nèi)生長；堿燒傷后14 d，可見大量CNV生長。干預(yù)組兔角膜堿燒傷后1 d，可見堿燒傷區(qū)域角膜上皮缺損，角膜緣血管擴(kuò)張，角膜出現(xiàn)明顯炎癥反應(yīng)；但在堿燒傷后7 d和14 d，均無明顯CNV生長，燒傷直徑較模型組明顯縮小，同時，干預(yù)組兔的眼前段反應(yīng)較模型組輕(圖1)。角膜共聚焦顯微鏡觀察可見，堿燒傷后14 d，模型組兔的角膜緣內(nèi)出現(xiàn)大量活動性CNV(圖2)。

圖1 堿燒傷后不同時間點模型組和干預(yù)組兔眼CNV的生長情況(各取2眼典型圖像)

圖2 角膜共聚焦顯微鏡觀察模型組兔角膜堿燒傷后14 d的CNV(箭頭示CNV)

2.2 CNV的長度和面積角膜堿燒傷后7 d和14 d，干預(yù)組中兔眼CNV長度均顯著低于模型組，CNV面積也均較模型組小，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(均為P<0.001)(表1)。

表1 模型組和干預(yù)組兔角膜堿燒傷后不同時間點CNV長度和面積

2.3 Western blot檢測Western blot檢測結(jié)果顯示，與對照組相比，堿燒傷后14 d模型組兔角膜中Scg3蛋白表達(dá)顯著升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)(圖3)。

2.4 蛋白芯片法檢測結(jié)果模型組和干預(yù)組兔眼表淚液中ICAM-1、IL-10、TGF-β1的表達(dá)在堿燒傷后1 d 即迅速增高，堿燒傷后7 d有所降低，堿燒傷后 14 d 進(jìn)一步降低。堿燒傷后7 d、14 d，與模型組相比，干預(yù)組兔眼表淚液中ICAM-1、IL-10、TGF-β1的表達(dá)均顯著降低，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(均為P<0.05)(圖4)。

圖4 蛋白芯片法檢測模型組與干預(yù)組兔眼表淚液中堿燒傷后不同時間各炎癥因子表達(dá)

3 討論

角膜病是主要的致盲性眼病，世界上有超過1000萬的雙眼角膜盲患者，每年新增角膜盲病例高達(dá)150萬～200萬[8]。其中， CNV是引起角膜盲的重要疾病之一[1]。CNV是由于眼部酸堿燒傷、眼外傷、角膜炎、長期不正確配戴角膜接觸鏡或者高危角膜移植等刺激，導(dǎo)致角膜緣新生血管向透明的角膜區(qū)生長形成，進(jìn)而引起角膜水腫、角膜混濁[1]。明顯的角膜混濁和相應(yīng)角膜表面不規(guī)則散光導(dǎo)致的屈光力改變是引起視力下降的主要原因[9-10]。目前多種治療CNV的方案，雖然能夠在一定程度上抑制CNV的生長[11-13]，但是也存在一些副作用，如導(dǎo)致角膜基質(zhì)變薄、眼壓升高、炎癥反應(yīng)加重等[14-16]。

大量研究表明，除VEGF外，其他的血管生長因子也參與誘導(dǎo)CNV的形成[17]。有研究發(fā)現(xiàn)，Scg3和VEGF作用相似，也在新生血管生長中起作用，是一種新近發(fā)現(xiàn)的新生血管影響因子[6，18]。LeBlanc等[6]研究發(fā)現(xiàn)，Scg3僅存在于病理性的新生血管中，即眼底新生血管和CNV中。我們也同樣在蛋白水平上發(fā)現(xiàn)兔角膜CNV組織中有Scg3的表達(dá)。同時，LeBlanc等[6]在研究中發(fā)現(xiàn)，抑制Scg3的表達(dá)可以有效地選擇性抑制眼底病理性新生血管的生長，而對正常毛細(xì)血管的功能無明顯影響。但其研究僅局限在Scg3對眼底新生血管的作用，并未探索抑制Scg3的表達(dá)對CNV的生長調(diào)控作用。CNV形成機(jī)制與糖尿病視網(wǎng)膜病變中新生血管形成機(jī)制并不完全相同。CNV形成機(jī)制主要為促新生血管生成與抗新生血管生成系統(tǒng)的失衡導(dǎo)致[19]；而糖尿病視網(wǎng)膜病變新生血管形成主要是由于糖尿病所導(dǎo)致的高血糖、低氧微環(huán)境，激活許多下游靶基因?qū)е?，包括激活炎癥細(xì)胞因子和血管活性肽因子等[20]。但是，炎癥細(xì)胞因子在CNV和糖尿病視網(wǎng)膜病變新生血管的形成中均起到重要作用[21]。我們在前期研究中也發(fā)現(xiàn)，炎癥反應(yīng)相關(guān)的細(xì)胞因子能夠刺激新生血管相關(guān)因子活化，進(jìn)而刺激新生血管的形成[3]。同時，我們也在兔眼的CNV模型中發(fā)現(xiàn)有Scg3的表達(dá)。所以，我們推測抗Scg3能夠在一定程度上抑制CNV的生長，同時減輕眼表的炎癥反應(yīng)。

我們通過查閱文獻(xiàn)，在預(yù)實驗中應(yīng)用0.5 mol·L-1、1.0 mol·L-1、2.0 mol·L-1、4.0 mol·L-1等多種氫氧化鈉溶液濃度和燒傷30 s、40 s、50 s等多個時間點建立兔角膜堿燒傷模型，發(fā)現(xiàn)當(dāng)濃度過大或燒傷時間過長時均容易引起角膜溶解，我們最后選定1.0 mol·L-1的氫氧化鈉溶液燒傷40 s建立兔角膜堿燒傷模型。然后，根據(jù)LeBlanc等[6]的體內(nèi)研究得出的Scg3抗體治療眼底新生血管性疾病的濃度及細(xì)胞實驗中使用的Scg3抗體濃度，我們在預(yù)實驗中進(jìn)一步探索了結(jié)膜下注射Scg3抗體治療CNV的最佳濃度，結(jié)果顯示，Scg3抗體濃度過高時(0.8 mg·L-1或1.0 mg·L-1)會刺激CNV的生長，而Scg3抗體濃度過低時(0.1 mg·L-1或0.3 mg·L-1)則不能抑制CNV的生長，因而我們最終選定0.5 mg·L-1Scg3抗體濃度進(jìn)行實驗。同時考慮到結(jié)膜下注射方式對CNV生長的誘導(dǎo)刺激，我們實驗了不同給藥方式，結(jié)果顯示，將不同濃度的Scg3抗體用滴眼的方式治療CNV，或減少結(jié)膜下注射的次數(shù)，均不能有效抑制CNV的生長。因而，造模成功后采用每2 d結(jié)膜下注射Scg3抗體的給藥方式，將Scg3抗體應(yīng)用于CNV治療，進(jìn)而評估Scg3抗體對CNV的影響。

Edelman等[22]將CNV的形成分為血管生長前的非增殖期和血管生長速度最快的增殖期、血管密度降低的回歸期三個階段。這與本研究中CNV的生長趨勢相一致。堿燒傷后1 d，由于角膜受到堿燒傷的刺激，可見模型組兔堿燒傷區(qū)域角膜上皮缺損，角膜緣血管擴(kuò)張，無CNV長入角膜，為新生血管生長前的非增殖期；堿燒傷后7 d，CNV的生長水平達(dá)到高峰，進(jìn)入增殖期；堿燒傷后14 d，CNV的生長水平進(jìn)一步變緩，CNV的長度及面積達(dá)到最高值，此時處于回歸期。這也與堿燒傷后的炎癥反應(yīng)有關(guān)，IL-10是免疫調(diào)節(jié)和炎癥反應(yīng)中的重要因子[23]，也能夠激活TGF-β的表達(dá)[24]。TGF-β1、ICAM-1均是炎癥反應(yīng)中的重要細(xì)胞因子[25-26]。所以，我們通過蛋白芯片法檢測堿燒傷后1 d、7 d和14 d兔眼表淚液中的IL-10、TGF-β1和ICAM-1的表達(dá)，結(jié)果顯示，堿燒傷后1 d，3個炎癥因子的表達(dá)均明顯升高，堿燒傷 7 d 和14 d均有所降低。角膜堿燒傷后角膜上皮及角膜緣干細(xì)胞損傷，在初始階段，炎癥反應(yīng)使大量的炎癥細(xì)胞被吸引至損傷部位，角膜上皮釋放大量的炎癥因子和血管生長因子，破壞血管生長因子與抗血管生長因子間的平衡，刺激新生血管及淋巴管生成；堿燒傷后14 d，炎癥因子的表達(dá)逐漸減少，炎癥反應(yīng)降低，所以不再出現(xiàn)新的CNV生長，此時CNV的生長也達(dá)到了高峰。在干預(yù)組中，Scg3抗體應(yīng)用之后，CNV的長度和面積均低于模型組，炎癥因子的表達(dá)在堿燒傷后7 d也明顯低于模型組，眼前段的炎癥反應(yīng)明顯降低，CNV的生長被明顯抑制。堿燒傷后14 d，模型組和干預(yù)組兔眼表淚液中的炎癥因子表達(dá)均進(jìn)一步下降，CNV生長已經(jīng)趨于穩(wěn)定，干預(yù)組兔眼中的CNV長度及面積均明顯低于模型組。因此，在兔角膜堿燒傷后，應(yīng)用Scg3抗體干預(yù)，能夠減輕炎癥反應(yīng)，CNV的生長也被明顯抑制。

綜上，我們發(fā)現(xiàn)Scg3抗體在一定程度上可以有效抑制角膜堿燒傷誘導(dǎo)的CNV的生成，其可能與Scg3抗體可以抑制角膜堿燒傷后的炎癥反應(yīng)，從而抑制CNV的生成有關(guān)。我們將進(jìn)一步對Scg3參與CNV及淋巴管形成的機(jī)制進(jìn)行體內(nèi)研究，為CNV的治療或聯(lián)合治療提供新的方案。