周玉蘭 冀俊林 池興旺

(天津市東麗醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科，天津 300300)

2型糖尿病(T2DM)是一種與年齡相關(guān)的代謝性疾病。大量流行病學(xué)數(shù)據(jù)顯示〔1，2〕，T2DM患者認(rèn)知功能障礙的風(fēng)險(xiǎn)較非糖尿病患者增加一倍，T2DM可能加速認(rèn)知功能障礙。然而，T2DM認(rèn)知功能障礙發(fā)病機(jī)制仍是未知的。影像學(xué)研究發(fā)現(xiàn)，糖尿病患者的大腦結(jié)構(gòu)異常，可能加速認(rèn)知能力的下降〔3，4〕。糖尿病大鼠模型實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)〔5〕，光學(xué)顯微鏡觀(guān)察海馬神經(jīng)元數(shù)量明顯減少，海馬神經(jīng)元形態(tài)異常。研究表明，神經(jīng)炎癥和氧化應(yīng)激可能是糖尿病認(rèn)知功能障礙發(fā)生的關(guān)鍵因素〔6，7〕。一旦這些危險(xiǎn)因素被激活，糖尿病患者的認(rèn)知功能將很快下降，最終導(dǎo)致癡呆，這將極大地影響患者的生活質(zhì)量，給患者和社會(huì)帶來(lái)巨大負(fù)擔(dān)。目前沒(méi)有有效的藥物可以預(yù)防或減緩糖尿病患者認(rèn)知功能障礙的發(fā)生及進(jìn)展。因此，開(kāi)發(fā)有效的藥物預(yù)防或延緩糖尿病的認(rèn)知障礙對(duì)人們來(lái)說(shuō)是一個(gè)挑戰(zhàn)。

魚(yú)油是一種天然保健品，由海魚(yú)的脂肪精制而成，富含ω-單不飽和脂肪酸。海魚(yú)油含有4種長(zhǎng)碳鏈多不飽和脂肪酸，包括花生四烯酸(AA)，二十碳五烯酸(EPA)，二十二碳五烯酸(DPA)和二十二碳六烯酸(DHA)。魚(yú)油中的這4種長(zhǎng)鏈脂肪酸EPA和DHA的含量較高，對(duì)人體健康有益。魚(yú)油具有增強(qiáng)免疫力〔8〕、預(yù)防類(lèi)風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎〔9〕、預(yù)防脂肪肝〔10〕和抑制癌癥〔11〕的作用。另有研究表明〔12〕，魚(yú)油可能是預(yù)防和治療糖尿病和抑制癡呆的潛在藥物。為了解魚(yú)油如何預(yù)防糖尿病的認(rèn)知障礙，本研究建立糖尿病動(dòng)物模型來(lái)探索其機(jī)制。

1 材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 30只成年雄性SD大鼠(160～180 g)由華北理工大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。 動(dòng)物處在受控溫度(22±2)℃和12∶12 h光/暗循環(huán)。 大鼠均按照實(shí)驗(yàn)室動(dòng)物指南的護(hù)理和使用進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。大鼠高脂飲食(10%膽固醇10 ml/kg)2 w。 禁食過(guò)夜后，給大鼠腹腔注射40 mg/kg鏈脲佐菌素(STZ)。 對(duì)照組注射生理鹽水。 在高脂肪飲食之前，將所有動(dòng)物分成3組：對(duì)照組(n=10)和糖尿病組(n=10)，標(biāo)準(zhǔn)大鼠飼料喂養(yǎng)。糖尿病+魚(yú)油組(n=10)喂食含有4%魚(yú)油，持續(xù)喂養(yǎng)8 w。STZ給藥后72 h，血糖≥16.7 mmol/L的大鼠作為糖尿病模型。

1.2方法

1.2.1Morris水迷宮檢測(cè) 在魚(yú)油治療后8 w，使用Morris水迷宮(上海欣軟信息科技有限公司)評(píng)估大鼠的學(xué)習(xí)和記憶能力。 在第52天，對(duì)所有動(dòng)物進(jìn)行定位航行試驗(yàn)并持續(xù)4 d。 訓(xùn)練大鼠尋找隱藏在水面下2 cm處的平臺(tái)，尋找和平臺(tái)所花費(fèi)的時(shí)間被記錄為逃避潛伏期。 如果大鼠在60 s內(nèi)未能找到平臺(tái)，則將其引置平臺(tái)上并使其保持10 s，逃避潛伏期記錄為60 s。 在第56天，移除隱藏的平臺(tái)，進(jìn)行空間探索試驗(yàn)以評(píng)估大鼠的空間記憶，給予大鼠60 s在池中自由游泳。 記錄目標(biāo)象限中的大鼠所花費(fèi)的時(shí)間，越過(guò)平臺(tái)的次數(shù)及游泳速度。

1.2.2組織病理學(xué)檢查 行為學(xué)檢測(cè)結(jié)束后，通過(guò)蘇木素-伊紅(HE)染色檢測(cè)海馬CA1區(qū)的形態(tài)學(xué)改變。戊巴比妥鈉(上海榕柏生物技術(shù)有限公司，貨號(hào)：37612；60 mg/kg)麻醉大鼠，200～300 ml 4%多聚甲醛(碧云天，P0099-100 ml)進(jìn)行心臟灌注。 收集組織并后固定，包埋。 將石蠟組織塊切成5 μm厚的切片用于HE染色。 通過(guò)光學(xué)顯微鏡(奧林巴斯CX23)觀(guān)察海馬神經(jīng)元形態(tài)。

1.2.3酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)測(cè)定組織勻漿中腫瘤壞死因子(TNF)-α、白細(xì)胞介素(IL)-6和IL-1β濃度 ELISA測(cè)定大鼠海馬組織中TNF-α(ab100785)，IL-1β(ab9722)和IL-6(234570)濃度〔22〕。 TNF-α、IL-1β和IL-6的ELISA試劑盒購(gòu)自Abcam公司。步驟均按照制造商的說(shuō)明進(jìn)行。 測(cè)定的海馬TNF-α，IL-1β和IL-6濃度的結(jié)果以pg/ml表示。

1.3海馬中過(guò)氧化物水平測(cè)定 將海馬的組織勻漿用于細(xì)胞因子測(cè)定。 使用脂質(zhì)過(guò)氧化物(MDA)測(cè)定試劑盒(A003-1-2)和過(guò)氧化氫酶(CAT)測(cè)定試劑盒(A007-1-1；南京建成生物工程研究所，中國(guó))分別評(píng)估MDA水平和CAT活性。 所有程序遵循制造商的說(shuō)明。

1.4統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS25.0軟件和Sigma Plot10軟件進(jìn)行單因素方差分析(ANOVA)。

2 結(jié) 果

2.1魚(yú)油對(duì)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物認(rèn)知能力的改善 各組間游泳速度沒(méi)有明顯差異(P>0.05)。在定向巡航試驗(yàn)中，糖尿病組比對(duì)照組花費(fèi)更多時(shí)間尋找隱藏平臺(tái)；糖尿病明顯降低了糖尿病大鼠逃避潛伏期(P<0.05)。在空間探索測(cè)試中，糖尿病組穿越平臺(tái)象限的次數(shù)明顯少于對(duì)照組(P<0.05)；在魚(yú)油治療后，糖尿病大鼠穿越平臺(tái)象限的次數(shù)顯著增加(P<0.05)。見(jiàn)表1。

2.2魚(yú)油改善海馬神經(jīng)元形態(tài) 在對(duì)照組中觀(guān)察到很少的異常神經(jīng)元。在糖尿病組中，觀(guān)察到神經(jīng)元混亂無(wú)序，染色模糊，數(shù)量減少。魚(yú)油治療緩解了上述異常的形態(tài)變化。見(jiàn)圖1。

2.3魚(yú)油抑制糖尿病誘導(dǎo)的神經(jīng)炎癥 在糖尿病組海馬中IL-1β、IL-6和TNF-α的水平顯著高于對(duì)照組(P<0.05)；糖尿病+魚(yú)油組海馬中炎癥因子水平較糖尿病組顯著降低(P<0.05)。見(jiàn)表1。

2.4魚(yú)油對(duì)氧化應(yīng)激標(biāo)志物的影響 與對(duì)照組相比，糖尿病組海馬MDA水平顯著升高，CTA活性明顯降低(P<0.05)；糖尿病+魚(yú)油組海馬中的MDA活性較糖尿病組明顯降低，CAT活性明顯升高(P<0.05)。見(jiàn)表1。

表1 各組逃避潛伏期、穿臺(tái)次數(shù)、游泳速度及海馬IL-1β、IL-6、TNF-α水平和MDA、CAT活性比較

3 討 論

T2DM是一種與年齡有關(guān)的全球范圍內(nèi)流行的代謝性疾病。T2DM與認(rèn)知障礙和癡呆有關(guān)，T2DM患者罹患阿爾茨海默病(AD)的風(fēng)險(xiǎn)明顯高于非糖尿病患者。 T2DM引起神經(jīng)退行性疾病的機(jī)制仍不清楚，缺乏有效的藥物來(lái)預(yù)防或延緩疾病的進(jìn)展。因此，尋找有效的治療方法或開(kāi)發(fā)新的藥物來(lái)對(duì)抗糖尿病的認(rèn)知障礙非常必要。

魚(yú)油改善了糖尿病大鼠的行為異常，并伴隨著海馬神經(jīng)元的恢復(fù)，而神經(jīng)元是負(fù)責(zé)學(xué)習(xí)和記憶的大腦區(qū)域。此外，本研究結(jié)果還表明，魚(yú)油的神經(jīng)保護(hù)作用與減輕炎癥細(xì)胞因子和氧化應(yīng)激有關(guān)。

大鼠持續(xù)性高血糖可能導(dǎo)致其行為異常，魚(yú)油可逆轉(zhuǎn)糖尿病引起的空間學(xué)習(xí)和記憶障礙。這與以前的研究相似〔13〕，報(bào)道補(bǔ)充了魚(yú)油可以通過(guò)抑制STZ-糖尿病大鼠的神經(jīng)元凋亡來(lái)幫助影響記憶和學(xué)習(xí)能力。

據(jù)推測(cè)，促炎細(xì)胞因子的堆積會(huì)觸發(fā)神經(jīng)炎癥，通過(guò)誘導(dǎo)活性氧(ROS)產(chǎn)生并降低抗氧化劑的水平而導(dǎo)致氧化應(yīng)激〔14〕。本研究結(jié)果與先前的發(fā)現(xiàn)一致。據(jù)報(bào)道，強(qiáng)烈的免疫原性反應(yīng)和氧化應(yīng)激可能進(jìn)一步引起神經(jīng)元損傷〔15〕。 本研究結(jié)果表明，糖尿病大鼠中神經(jīng)元的損傷與促炎性細(xì)胞因子和氧化應(yīng)激密切相關(guān)。魚(yú)油減輕了糖尿病引起的腦損傷。魚(yú)油可以減少促炎因子的表達(dá)，從而抑制肝臟和其他組織的免疫原性反應(yīng)。ω-3脂肪酸DHA是魚(yú)油中的活性成分之一，能夠通過(guò)抑制STZ糖尿病大鼠的海馬神經(jīng)元凋亡來(lái)降低AD的風(fēng)險(xiǎn)并改善癥狀并增強(qiáng)學(xué)習(xí)功能。因此，本文初步確定魚(yú)油通過(guò)抑制促炎因子的表達(dá)從而抑制免疫原性反應(yīng)和氧化應(yīng)激而達(dá)到神經(jīng)保護(hù)作用。但本研究的樣本量較小，且干預(yù)時(shí)間短，在后續(xù)研究中，應(yīng)加大樣本量，延長(zhǎng)干預(yù)時(shí)間，并將從RNA 水平探討促炎因子的表達(dá)，進(jìn)一步完善魚(yú)油改善糖尿病認(rèn)知功能障礙大鼠的機(jī)制。