張春瑞 卞艷麗 張體鵬 薛飛

(鄭州澍青醫(yī)學高等?？茖W校臨床醫(yī)學系，河南 鄭州 450000)

肝癌是消化道常見惡性腫瘤，預后較差，中醫(yī)藥療法是當前治療肝癌的重要輔助手段，且中醫(yī)治療具有多靶點、整體治療特點，具有減輕化療不良反應、預防腫瘤復發(fā)、延緩生命等作用，研究中醫(yī)治療的分子機制，以期為臨床中醫(yī)治療提供理論依據(jù)〔1，2〕。千里光是菊科千里光屬的多年生草本植物，常用草藥，黃酮是其主要化學成分，其具有抗菌、抗病毒、抗氧化、抗腫瘤等作用〔3，4〕。研究報道千里光提取物對肝癌細胞株Be17402、SMMC7721，卵巢癌細胞HO8910，胃癌細胞SGC7091具有體外增殖抑制的作用〔5〕。千里光總堿和千里光堿可以抑制體外培養(yǎng)的小鼠黑色素瘤細胞增殖〔6〕。千里光總黃酮對肝癌細胞株SMMC7721、胃癌細胞株SGC7091和乳腺癌細胞株MCF7具有明顯抑制作用〔7〕。但千里光總黃酮對肝癌細胞增殖、凋亡、遷移、侵襲的影響及其機制尚不清楚。microRNA(miR)是一類高度保守的，內(nèi)源性非蛋白編碼的小分子RNA，其在細胞周期調(diào)控，程序性死亡，細胞分化及代謝等活動中發(fā)揮重要作用，可作為中草藥防治肝癌的新靶點〔8〕。研究報道m(xù)iR-520e是一個新的抑癌miRNA，其可抑制肝癌的增殖〔9〕。miR-520e調(diào)節(jié)乳腺癌細胞的增殖，凋亡和遷移〔10〕。因此，本實驗旨在研究千里光總黃酮對肝癌細胞增殖、凋亡、遷移、侵襲的影響及其機制是否與miR-520e有關(guān)。

1 材料與方法

1.1材料 細胞Huh-7購自美國ATCC；千里光購自江蘇省徐州市世元藥業(yè)，經(jīng)鑒定為菊科千里光屬植物千里光；胎牛血清、RPMI1640培養(yǎng)基購自美國Gibco公司；膜聯(lián)蛋白V-異硫氰酸熒光素/碘化丙啶(Annexin V-FITC/PI)凋亡檢測試劑盒、雙熒光素酶報告基因檢測試劑盒購自北京索萊寶科技有限公司；Transwell小室、基質(zhì)膠購于美國BD公司；放射免疫沉淀試驗(RIPA)蛋白裂解液、二喹啉甲酸(BCA)試劑盒、實時熒光定量-聚合酶鏈反應(qRT-PCR)檢測試劑盒購自北京百奧萊博科技有限公司。

1.2千里光總黃酮的制備 千里光藥材烘干至恒重后粉碎，取5 g粗粉，加入60%乙醇200 ml，超聲波輔助提取3次，每次1 h，過濾后合并濾液，減壓旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)，然后定容至100 ml。取所得樣品溶液1 ml于10 ml的容量瓶，加入5%亞硝酸鈉溶液0.4 ml，搖勻，靜置6 min；加入10%硝酸鋁溶液0.4 ml，搖勻，靜置6 min；再加入4%氫氧化鈉溶液4 ml，用乙醇定容至刻度，搖勻，靜置15 min；在510 nm處測定吸光度值。

1.3細胞培養(yǎng)與分組 細胞Huh-7用含10%胎牛血清的RPMI1640培養(yǎng)液在37℃、5%CO2條件下培養(yǎng)，取對數(shù)生長期Huh-7細胞，用濃度分別為12.5、25.0、50.0 μg/ml的千里光總黃酮處理Huh-7細胞，作為低、中、高劑量組；正常培養(yǎng)的細胞作為對照組。將miR-NC、miR-520e轉(zhuǎn)染至Huh-7細胞中，記為miR-NC組、miR-520e組；將miR-NC、miR-520e轉(zhuǎn)染至Huh-7細胞中再用濃度為50.0 μg/ml的千里光總黃酮處理，記為高劑量+miR-NC組、高劑量+miR-520e組。

1.4細胞周期檢測 各組細胞培養(yǎng)48 h后收集細胞，并制備單細胞懸液，加入3 ml預冷的70%乙醇固定，用緩沖液洗滌后加入核糖核酸酶(RNase)A于37℃水浴30 min，加入400 μl PI，4℃避光30 min，上機檢測激發(fā)波長488 nm處紅色熒光，重復3次。用流式細胞儀和DNA細胞周期分析軟件對細胞周期進行檢測分析。

1.5細胞凋亡檢測 各組細胞培養(yǎng)48 h后用預冷的磷酸鹽緩沖液(PBS)漂洗2次，與500 μl結(jié)合緩沖液混勻。先加入10 μl Annexin V-FITC，再加入5 μl PI，混勻后避光孵育10 min。用流式細胞儀檢測細胞凋亡率。每組設3個復孔，重復3次。

1.6Transwell檢測細胞遷移和侵襲 收集各組細胞，無血清培養(yǎng)后，取200 μl接種于Transwell小室上層，培養(yǎng)24 h后，吸去培養(yǎng)液后用棉簽輕輕擦去上層細胞，PBS洗滌，4%多聚甲醛固定30 min，再用0.1%結(jié)晶紫染色10 min，顯鏡下拍照并計數(shù)發(fā)生遷移的細胞數(shù)量。細胞侵襲實驗在Transwell小室上層加入50 μl基質(zhì)膠，凝固后接種細胞，之后同細胞遷移操作。

1.7Western印跡檢測Ki67、半胱氨酸蛋白酶(Caspase)3、N-鈣黏附蛋白(N-cadherin)、E-鈣黏附蛋白(E-cadherin)蛋白表達 提取各組細胞總蛋白，用BCA試劑盒進行蛋白定量。各組蛋白上樣量60 μg，十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)后，經(jīng)電轉(zhuǎn)將蛋白轉(zhuǎn)移至聚偏氟乙烯(PVDF)上。用5%脫脂牛奶室溫封閉90 min，分別加入相應的一抗(1∶800)，4℃孵育過夜，PBS洗滌3次，每次5 min；再加入二抗(1∶1 500)室溫孵育2 h，PBS洗滌3次，每次10 min，后在暗室中曝光顯影，定影，將膠片用Quantity One凝膠分析軟件處理，測定各組蛋白條帶的灰度值，以目的條帶和GAPDH條帶的比值作為蛋白表達水平。

1.8qRT-PCR檢測miR-520e表達水平 各組細胞培養(yǎng)48 h后提取細胞總RNA，將RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA，進行PCR擴增，每個樣品重復3次，循環(huán)條件為95℃ 30 s，60℃ 30 s；72℃ 30 s，共40個循環(huán)；60℃延長5 min。相對表達量采用2-△△Ct法計算。miR-520e以U6為內(nèi)參，miR-520e上游引物序列：5′-AAAGTGCTTCCTTTTTGAGGG-3′，下游引物序列：5′-GGTGCTTCCTTTTTGAGGG-3′；U6上游引物序列：5′-TCCGATCGTGAAGCCTTC-3′，下游引物序列：5′-GTGCAGGGTCCGACGT-3′。

1.9熒光素酶報告實驗檢測miR-520e對CDK2的靶向調(diào)控 TargetScan數(shù)據(jù)庫顯示miR-520e與CDK2存在結(jié)合位點。構(gòu)建CDK2野生型(WT)和突變型(MUT)熒光素酶表達載體WT-CDK2和MUT-CDK2，用LipofectamineTM2000將WT-CDK2和MUT-CDK2分別與miR-NC和miR-520e共轉(zhuǎn)染至細胞Huh-7中。按照說明書檢測熒光素酶活性。

1.10統(tǒng)計學方法 采用SPSS20.0軟件進行t檢驗、單因素方差分析。

2 結(jié) 果

2.1千里光總黃酮對Huh-7增殖、凋亡的影響 與對照組相比，中、高劑量組G0～G1期細胞所占比例顯著升高，S期細胞所占比例顯著降低(P<0.05)，G2～M期細胞所占比例無顯著差異(P>0.05)；凋亡率顯著升高，且呈劑量依賴性(P<0.05)。見圖1，表1。

2.2千里光總黃酮對Huh-7遷移、侵襲的影響 與對照組相比，中、高劑量組遷移、侵襲細胞數(shù)顯著降低，且呈劑量依賴性(P<0.05)。見表1、圖2。

圖1 千里光總黃酮對Huh-7凋亡率的影響

表1 千里光總黃酮對Huh-7增殖、凋亡、遷移及侵襲的影響

2.3千里光總黃酮對Huh-7中miR-520e及Ki67、Caspase3、N-cadherin、E-cadherin表達的影響 與對照組相比，中、高劑量組miR-520e表達水平顯著升高，Ki67、N-cadherin表達水平顯著降低，Caspase3、E-cadherin表達水平顯著升高，且呈劑量依賴性(P<0.05)。見表2,圖3。

圖2 千里光總黃酮對Huh-7遷移、侵襲細胞數(shù)的影響(結(jié)晶紫染色，×200)

表2 各組miR-520e及Ki67、Caspase3、N-cadherin、E-cadherin蛋白的表達

2.4miR-520e對千里光總黃酮作用的Huh-7增殖、凋亡的影響 與對照組和miR-NC組相比，miR-520e組G0-G1期細胞所占比例顯著升高，S期細胞所占比例顯著降低(P<0.05)，G2-M期細胞所占比例無顯著差異(P>0.05)，凋亡率顯著升高(P<0.05)；與miR-520e組和高劑量+miR-NC組相比，高劑量+miR-520e組G0-G1期細胞所占比例顯著升高，S期細胞所占比例顯著降低(P<0.05)，G2-M期細胞所占比例無顯著差異(P>0.05)，凋亡率顯著升高(P<0.05)。見圖4，表3。

圖4 miR-520e對千里光總黃酮作用的Huh-7凋亡率的影響

表3 miR-520e對千里光總黃酮作用的Huh-7增殖、凋亡的影響

2.5miR-520e對千里光總黃酮作用的Huh-7遷移、侵襲的影響 與對照組和miR-NC組相比，miR-520e組遷移、侵襲細胞數(shù)顯著降低(P<0.05)；與miR-520e組和高劑量+miR-NC組相比，高劑量+miR-520e組遷移、侵襲細胞數(shù)顯著降低(P<0.05)。見圖5,表4。

圖5 miR-520e對千里光總黃酮作用的Huh-7遷移、侵襲細胞數(shù)的影響(結(jié)晶紫染色，×200)

表4 miR-520e對千里光總黃酮作用的Huh-7遷移、侵襲的影響及各組Ki67、Caspase3、N-cadherin、E-cadherin蛋白的表達

2.6miR-520e對千里光總黃酮作用的Huh-7中Ki67、Caspase3、N-cadherin、E-cadherin表達的影響 與對照組和miR-NC組相比，miR-520e組Ki67、N-cadherin表達水平顯著降低，Caspase3、E-cadherin達水平顯著升高(P<0.05)；與miR-520e組和高劑量+miR-NC組相比，高劑量+miR-520e組Ki67、N-cadherin表達水平顯著降低，Caspase3、E-cadherin達水平顯著升高(P<0.05)。見表4，圖6。

1～5：對照組，miR-NC組，miR-520e組，高劑量+miR-NC組，高劑量+miR-520e組圖6 各組Ki67、Caspase3、N-cadherin、E-cadherin蛋白的表達

2.7miR-520e靶向CDK2 TargetScan數(shù)據(jù)庫預測顯示miR-520e與CDK2存在結(jié)合位點，見圖7。熒光素酶報告實驗顯示，與miR-NC組相比，miR-520e組中轉(zhuǎn)染W(wǎng)T-CDK2的細胞熒光素酶活性顯著降低(P<0.05)；而轉(zhuǎn)染MUT-CDK2的細胞熒光素酶活性無顯著差異(P>0.05)。見表5。

圖7 CDK2的3′UTR含有miR-520e的互補序列

表5 雙熒光素酶報告實驗

3 討 論

黃酮類化合物是一類存在于多種植物中的多酚化合物，其具有許多潛在的藥用價值，研究表明天然黃酮類化合物可抑制腫瘤細胞增殖，誘導細胞凋亡，具有抗腫瘤作用機制〔11〕。研究報道白鳳菜總黃酮可抑制肝癌HepG2細胞增殖和誘導細胞凋亡〔12〕。藤茶總黃酮通過激活細胞凋亡磷脂酰肌醇3激酶/蛋白激酶B(PI3K或AKT)/p53通路進肝癌細胞凋亡，發(fā)揮抗肝癌作用〔13〕。木蝴蝶總黃酮可體外抑制肝癌細胞增殖和遷移〔14〕。已有研究報道千里光總黃酮具有抗腫瘤作用，本研究結(jié)果表明中、高劑量的千里光總黃酮可抑制肝癌細胞增殖、遷移、侵襲，促進細胞凋亡。

研究報道m(xù)iR-520e通過直接靶向Zbtb7a可調(diào)節(jié)非小細胞肺癌細胞的生長，侵襲和遷移〔15〕。miR-520e過表達通過靶向星形膠質(zhì)細胞升高基因(AEG)-1顯著降低了結(jié)直腸癌細胞的增殖，集落形成和侵襲〔16〕。miR-520e通過靶向成纖維細胞生長因子(FGF)19下調(diào)Wnt/β-catenin信號傳導，從而抑制神經(jīng)膠質(zhì)瘤細胞的增殖和侵襲〔17〕。表明miR-520e具有抗癌作用。且已有研究表明miR-520e在肝癌中起抑癌作用〔9〕。本研究結(jié)果表明千里光總黃酮可能通過上調(diào)miR-520e的表達對肝癌起抑癌作用。

周期素依賴性激酶(CDK)2是細胞周期依賴性激酶家族成員之一，驅(qū)動細胞進入細胞周期的S期和M期；其抑制劑可用于癌癥治療〔18〕。研究報道CDK2在原發(fā)性肝癌組織中的表達明顯增加，其高表達與患者生存率低有關(guān)〔19〕，表明CDK2參與肝癌的進展過程，本研究表明miR-520e可通過靶向調(diào)控CDK2影響肝癌進展。

綜上，千里光總黃酮通過調(diào)控miR-520e/CDK2抑制肝癌細胞增殖、遷移、侵襲，促進細胞凋亡。