黃衛(wèi)虎 徐燕 孫朝越 張瑋 王霞

(1吉安市中心人民醫(yī)院醫(yī)學(xué)美容科,江西 吉安 343000;2井岡山大學(xué)附屬醫(yī)院檢驗(yàn)科;3井岡山大學(xué)醫(yī)學(xué)部)

糖尿病合并燙傷不僅給患者帶來(lái)了巨大的精神壓力，同時(shí)嚴(yán)重?fù)p害患者的生活質(zhì)量并造成經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)〔1〕。盡管已證明負(fù)壓引流、抗感染敷料和生長(zhǎng)因子可部分改善燙傷創(chuàng)面的愈合，但專(zhuān)注于最小化傷口或促進(jìn)細(xì)胞增殖的單一治療方法仍無(wú)法獲得令人滿意的結(jié)果。傷口修復(fù)是一個(gè)復(fù)雜而有序的生物學(xué)過(guò)程，包括止血、炎癥反應(yīng)、細(xì)胞增殖和組織重塑〔2〕。在任何一個(gè)階段中出現(xiàn)問(wèn)題都可能延遲傷口愈合。糖尿病患者的高血糖微環(huán)境很可能導(dǎo)致與愈合相關(guān)的生長(zhǎng)因子分泌減少，導(dǎo)致成纖維細(xì)胞增殖減少，這是延遲糖尿病潰瘍愈合的最有害因素之一〔3，4〕。血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(VEGF)在調(diào)節(jié)傷口修復(fù)、胚胎發(fā)育、血管生成和神經(jīng)修復(fù)中起重要作用〔5〕。有研究〔6～8〕表明，當(dāng)上皮組織受損時(shí)，VEGF在傷口表面過(guò)度表達(dá)，刺激成纖維細(xì)胞、膠原蛋白和結(jié)締組織積聚到傷口部位，從而產(chǎn)生新組織并促進(jìn)傷口愈合。在糖尿病慢性潰瘍中，高葡萄糖水平通常會(huì)誘發(fā)過(guò)多的炎癥因子的產(chǎn)生，從而導(dǎo)致炎癥反應(yīng)延長(zhǎng)，由于炎癥滲出物的積累而破壞傷口的微環(huán)境及細(xì)胞損傷。CD146是血管形成的重要標(biāo)志，新生血管的CD146呈高表達(dá)，抗CD146抗體標(biāo)記能很好地區(qū)分新生血管和成熟血管，根據(jù)CD146表達(dá)計(jì)算出的微血管密度(MVD)是新生血管形成的量化指標(biāo)〔9〕。研究表明〔10～12〕，細(xì)胞黏附分子CD146是腫瘤新生血管的標(biāo)志物分子，能夠促進(jìn)VEGF信號(hào)這一血管生成中最為重要的信號(hào)通路的傳導(dǎo)，進(jìn)而促進(jìn)血管生成。同時(shí)，CD146在調(diào)節(jié)炎癥方面顯示出優(yōu)異的功效。就相應(yīng)的作用機(jī)制而言，CD146通過(guò)抑制核轉(zhuǎn)錄因子(NF)-κB信號(hào)通路來(lái)抑制巨噬細(xì)胞介導(dǎo)的炎癥反應(yīng)。因此，使用CD146改善炎癥微環(huán)境，結(jié)合VEGF促進(jìn)細(xì)胞增殖，可能代表一種有效的治療方法，可促進(jìn)糖尿病性潰瘍患者的傷口愈合。四黃油由四黃(黃連、黃柏、黃芩和黃杞子)、紅花、血蝎、白芷、等中藥浸泡于香油，經(jīng)煎煮提煉而成。它有獨(dú)特的多功能，并且已被證明具有良好的生物相容性和低刺激性。使用四黃油治療慢性皮膚潰瘍的優(yōu)勢(shì)包括其對(duì)水和氣體的雙向滲透性及其是防止細(xì)菌入侵和感染的有效屏障。另外，四黃油顯示出良好的可塑性和黏附性，從而延長(zhǎng)了藥物在皮膚表面上的停留時(shí)間。本研究探討四黃油對(duì)糖尿病大鼠燙傷皮膚組織CD146、VEGF表達(dá)及肉芽組織血管密度的影響。

1 材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)材料 24只雄性SPF級(jí)SD大鼠，7～9周齡，體重210～240 g，購(gòu)自湖南斯萊克景達(dá)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物公司。動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)碼為：SCXK(湘)2009-0004。為所有大鼠自適應(yīng)地在籠子中提供飲用水和固體鼠糧。室溫約23℃，相對(duì)濕度為60%，光/暗周期為12 h/12 h。所有大鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)4 w，在此期間測(cè)量并記錄血糖水平。

1.2糖尿病模型建立及燙傷創(chuàng)面制備 ①建立大鼠糖尿病模型：腹腔內(nèi)一次性注射經(jīng)檸檬酸緩沖液稀釋的鏈脲佐菌素(STZ)55 mg/kg；注射后每日檢測(cè)血糖，當(dāng)血糖>13.3 mol/L(基礎(chǔ)血糖<8.9 mol/L)，胰腺組織病理學(xué)檢查證實(shí)胰島細(xì)胞已破壞，則表明建模成功。②Ⅱ度燙傷創(chuàng)面制備：糖尿病模型成功建立后1個(gè)月，3%戊巴比妥鈉(50 mg/kg)腹腔注射麻醉大鼠，每只大鼠的背部用脫毛劑脫毛，在脊柱兩側(cè)燙傷(每個(gè)直徑1.0 cm)。燙傷條件如下：熱頭溫度為85℃，作用在皮膚上的力等于0.5 kg重量，持續(xù)10 s，傷口不做包扎，將每只大鼠單獨(dú)隔離，并提供普通飲食。在傷口形成當(dāng)天開(kāi)始進(jìn)行各種治療。在開(kāi)始四黃油治療之前，用過(guò)氧化氫對(duì)傷口進(jìn)行適當(dāng)處理，并用碘伏消毒。

1.3動(dòng)物分組 將24只深Ⅱ度燙傷糖尿病大鼠隨機(jī)分為實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組，每組12只。實(shí)驗(yàn)組：燙傷后即刻，創(chuàng)面局部涂抹四黃油。對(duì)照組：于相同時(shí)間點(diǎn)，創(chuàng)面局部涂抹等量香油。治療持續(xù)31 d。在第7、14、25和31天，使用數(shù)碼相機(jī)為傷口拍照，并通過(guò)Image Pro plus V6.0分析傷口的愈合過(guò)程。在每個(gè)時(shí)間點(diǎn)計(jì)算傷口愈合率。

1.4Western印跡檢測(cè)蛋白表達(dá) 通過(guò)二喹啉甲酸(BCA)試劑對(duì)動(dòng)物或細(xì)胞中的蛋白質(zhì)進(jìn)行定量，并加入等量的蛋白質(zhì)(體外40 μg)。將提取的蛋白質(zhì)與上樣緩沖液混合，煮沸并在-20℃保存。另外，將20 μl包含40 μg總蛋白質(zhì)的蛋白質(zhì)混合物上樣到12%聚丙烯酰胺凝膠上，80 V電泳分離。2 h后，將分離的蛋白質(zhì)電轉(zhuǎn)到聚偏氟乙烯(PVDF)膜上。隨后，使用5%脫脂牛奶封閉PVDF膜90 min。隨后，添加相應(yīng)的一抗和探針，并將樣品在4℃孵育過(guò)夜。一抗包括以下抗體：α-SMA、膠原Ⅲ、泛角蛋白、VEGF、CD146、轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子(TGF)-β、白細(xì)胞介素(IL)-6、IL-1β、腫瘤壞死因子(TNF)-α和IL-10。接下來(lái)，將樣品與相應(yīng)的二抗(山羊IgG、抗小鼠IgG或與辣根過(guò)氧化物酶(HRP)綴合的山羊抗兔IgG(1：5 000)在室溫下孵育1 h。隨后，將PVDF膜用TBST洗滌3次，通過(guò)電化學(xué)發(fā)光(ECL)發(fā)光劑檢測(cè)信號(hào)，并通過(guò)ChemiDoc XRS + Imaging System(Bio-Rad)捕獲結(jié)果。最后，通過(guò)圖像實(shí)驗(yàn)室軟件分析目標(biāo)波段灰度值。

1.5免疫熒光 將嵌入OCT的組織冷凍，切成10 μm的厚度，并保存在-20℃下直至進(jìn)一步使用。將冷凍的載玻片在室溫下放置10 min，用磷酸鹽緩沖液(PBS)洗滌4次(每次洗滌5 min)，并在37℃下用5%(W/V)山羊血清封閉1 h。吸出過(guò)量的山羊血清，并將一抗在4℃下孵育過(guò)夜。一抗包括：α-平滑肌肌動(dòng)蛋白(SMA)、Pan-Keratin和CD146，所有抗體都用1%(W/V)山羊血清稀釋。第二天，將切片在室溫下加熱40 min，用PBS清洗4次(每次清洗5 min)，與特定的第二抗體在黑暗中于37℃放置1 h。將切片用PBS洗滌4次(每次洗滌5 min)，并在黑暗中用4′,6-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI)染色15 min。在PBS中進(jìn)行4次連續(xù)洗滌(5 min/次)后，將抗熒光淬滅劑PVP添加到組織中以密封玻片。使用Leica激光共聚焦顯微鏡以400倍放大率拍攝每個(gè)切片的3個(gè)隨機(jī)區(qū)域。通過(guò)Image Pro Plus V6.0分析每個(gè)圖像的平均熒光強(qiáng)度。

1.6MVD計(jì)數(shù) 以抗CD146抗體對(duì)標(biāo)本進(jìn)行免疫組織化學(xué)染色，操作步驟按SP(生物素-鏈霉親和素-辣根過(guò)氧化物酶)試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。根據(jù)CD146表達(dá)并參照Pareek等〔13〕的方法計(jì)算MVD，以此作為新生血管形成的量化指標(biāo)。

1.7統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS20.0軟件進(jìn)行單因素方差分析或重復(fù)測(cè)量的方差分析、LSD-t檢驗(yàn)、χ2檢驗(yàn)。

2 結(jié) 果

2.1四黃油可加速傷口閉合并促進(jìn)大鼠上皮再形成 與對(duì)照組同時(shí)間點(diǎn)相比，實(shí)驗(yàn)組燙傷皮膚的傷口愈合面積顯著增大(P<0.01)。圖1顯示了2種不同治療方式在第0、7、14、25、31天的燙傷創(chuàng)面。見(jiàn)表1、圖1。第31天，實(shí)驗(yàn)組的表皮厚度顯著大于對(duì)照組(P<0.05)。見(jiàn)圖2。

表1 兩組不同時(shí)間點(diǎn)燙傷皮膚的傷口愈合面積

圖1 兩組傷口閉合情況

圖2 兩組第31天上皮組織(HE染色，×100)

2.2四黃油通過(guò)增加α-SMA表達(dá)來(lái)增強(qiáng)肉芽形成 將第31天兩組的皮膚組織用于組織學(xué)分析。四黃油組的上皮完好無(wú)損，真皮層的膠原蛋白排列整齊，沒(méi)有明顯的水腫。同時(shí)，其外圍區(qū)域很好地整合到周?chē)奶烊黄つw組織中，并且觀察到許多皮膚附件和毛囊的形成(圖3A中的藍(lán)色箭頭)。而對(duì)照組中仍存在真皮水腫(圖3A中的黃色箭頭)，沒(méi)有明顯的皮膚附件再生。Western印跡顯示在第25天和第31天，實(shí)驗(yàn)組中α-SMA表達(dá)(357.25±49.82，571.19±62.26)明顯高于對(duì)照組(211.83±39.38，450.21±35.82，P<0.05)，見(jiàn)圖3B。免疫熒光顯示，與對(duì)照組相比，在第31天，實(shí)驗(yàn)組的真皮中α-SMA的表達(dá)增加(P<0.05)，見(jiàn)圖3C。

A：皮膚組織第31天免疫組化染色(×100);B:Western印跡檢測(cè)α-SMA表達(dá)；C:免疫熒光染色(×100)圖3 四黃油通過(guò)增加α-SMA表達(dá)來(lái)增強(qiáng)肉芽形成

2.3四黃油可提高膠原蛋白的合成能力 如圖4A所示，與對(duì)照組相比，第25天和第31天實(shí)驗(yàn)組中膠原Ⅲ蛋白表達(dá)明顯增加(P<0.05)。如圖4B所示，實(shí)驗(yàn)組第25天、第31天膠原Ⅲ蛋白表達(dá)(592.31±52.10，762.17±55.83)較對(duì)照組(319.22±40.10，482.19±35.62)明顯增加(P<0.05)。

A：第25天和第31天免疫組化染色(×100)；B：Western印跡檢測(cè)膠原Ⅲ蛋白表達(dá)圖4 四黃油可提高膠原蛋白的合成能力

2.4兩組肉芽組織微血管密度 免疫組織化學(xué)染色顯示，兩組創(chuàng)面均于燙傷后第3天開(kāi)始出現(xiàn)新生血管；自第7天起，實(shí)驗(yàn)組各時(shí)相點(diǎn)創(chuàng)面肉芽組織微血管密度較對(duì)照組明顯增加(P<0.01)。見(jiàn)表2。

表2 兩組燙傷皮膚的肉芽組織微血管密度根/mm2，n=12)

2.5四黃油通過(guò)增加VEGF和CD146的水平來(lái)增加血管生成 圖5A、5B顯示，在第14天，實(shí)驗(yàn)組VEGF表達(dá)(338.15±40.92)較對(duì)照組(213.59±33.62)明顯增加(P<0.05)。圖5C顯示，在實(shí)驗(yàn)組中觀察到大量新形成的血管(白色箭頭)。在對(duì)照組中，僅發(fā)現(xiàn)了少數(shù)具有CD146表達(dá)的內(nèi)皮細(xì)胞。Western印跡結(jié)果(圖5D)顯示，與對(duì)照組相比，實(shí)驗(yàn)組(526.19±59.26，827.16±71.58)在第14天和第31天的CD146表達(dá)水平較對(duì)照組(356.57±42.79，518.23±62.55)更高(P<0.05)。

A：免疫組化染色(×100);B：Western印跡檢測(cè)VEGF表達(dá)；C：免疫熒光(×100)；D：Western印跡檢測(cè)CD146表達(dá)圖5 四黃油通過(guò)增加VEGF和CD146的水平來(lái)增加血管生成

3 討 論

新生血管化障礙或延遲是糖尿病創(chuàng)面難愈重要原因之一〔14〕。微血管內(nèi)皮細(xì)胞功能異常在糖尿病早期就已經(jīng)存在，隨著血糖升高，多元醇通路、二脂酰甘油(DAG)-蛋白激酶(PK)C通路、蛋白質(zhì)非酶糖基化、氧化應(yīng)激及胰島素抵抗等多種因素相互影響和累加，使微血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷逐漸加重，并最終導(dǎo)致糖尿病微血管病變發(fā)生。創(chuàng)面愈合的主要決定性因素是創(chuàng)面新生血管化，四黃油促進(jìn)創(chuàng)面新生血管化的過(guò)程對(duì)于創(chuàng)面愈合有著重要的影響〔15〕。四黃油具有較好的促進(jìn)傷口愈合的作用。本研究結(jié)果證實(shí)四黃油在促進(jìn)上皮再生和肉芽形成方面的優(yōu)勢(shì)。四黃油還通過(guò)促進(jìn)CD146和VEGF的表達(dá)來(lái)促進(jìn)血管生成。在糖尿病性潰瘍組織中，促炎性細(xì)胞因子的表達(dá)增加，同時(shí)抗炎性細(xì)胞因子的表達(dá)減少，通常會(huì)導(dǎo)致局部潰瘍組織中炎癥信號(hào)的丟失或延遲〔16～18〕。該現(xiàn)象被認(rèn)為代表了糖尿病潰瘍非愈合特性的主要原因之一。新生血管是肉芽組織的重要組成部分，向創(chuàng)傷區(qū)域提供營(yíng)養(yǎng)和運(yùn)輸代謝產(chǎn)物，在創(chuàng)面愈合過(guò)程中扮演重要的角色。在正常創(chuàng)面組織愈合過(guò)程中，新生的血管可以為炎癥反應(yīng)提供氧和養(yǎng)料，并促進(jìn)巨噬細(xì)胞、角質(zhì)細(xì)胞、血管內(nèi)皮細(xì)胞分泌促血管生長(zhǎng)因子以加速創(chuàng)面愈合〔19〕。糖尿病性潰瘍是慢性傷口，感染和周?chē)芗膊〉拇嬖谑沟脤?duì)這些傷口的治療要求很高，并且需要多學(xué)科的方法〔20〕。本研究表明，四黃油在大鼠燙傷模型中減少了過(guò)度的炎癥反應(yīng)。CD146主要表達(dá)于新生血管中，可作為檢測(cè)新生血管的有效指標(biāo)。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)四黃油具有促進(jìn)糖尿病創(chuàng)面新生血管再生的作用，通過(guò)改善創(chuàng)面的血液供應(yīng)，促進(jìn)創(chuàng)面愈合，其機(jī)制可能為：①增強(qiáng)創(chuàng)面血管內(nèi)皮細(xì)胞的增殖和遷移能力；②通過(guò)趨化浸潤(rùn)創(chuàng)面的炎癥細(xì)胞分泌促血管生長(zhǎng)因子，作用于血管內(nèi)皮細(xì)胞，促進(jìn)創(chuàng)面新生血管的形成。