張韡

(南陽理工學(xué)院張仲景國醫(yī)國藥學(xué)院，河南 南陽 473004)

阿爾茨海默病(AD)俗稱老年性癡呆，是四大中樞神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾病之一。隨著我國社會人口老齡化，AD的發(fā)病率呈不斷上升趨勢，目前，AD已成為危及老年人生命的第四大病因(僅次于心臟病、腫瘤和腦卒中)〔1，2〕。因此尋找有效防治藥物是當(dāng)今AD研究領(lǐng)域的重要課題之一。橄欖苦苷(OP)，是一種無毒的裂環(huán)烯醚萜苷類化合物〔3〕。研究表明OP有抗炎，抗氧化及抗腫瘤和降血糖等多種作用〔4〕。已有研究發(fā)現(xiàn)，OP可改善D-半乳糖和氯化鋁(AlCl3)誘導(dǎo)的小鼠學(xué)習(xí)記憶障礙〔5〕。然而OP在AD轉(zhuǎn)基因小鼠模型中的記憶功能改善作用及機(jī)制卻未見報(bào)道。而淀粉樣前體蛋白(APP)/PS1雙轉(zhuǎn)基因小鼠是目前國內(nèi)外公認(rèn)的AD轉(zhuǎn)基因模型鼠之一〔6〕。因此，本研究觀察OP對APP/PS1雙轉(zhuǎn)基因小鼠記憶損傷的改善作用，并分析其機(jī)制。

1 材料和方法

1.1實(shí)驗(yàn)試劑 橄欖苦苷購自上海源葉生物科技有限公司；放射免疫沉淀試驗(yàn)(RIPA)裂解液購自Solarbio公司；二喹啉甲酸(BCA)試劑盒購自中國炎熙生物公司；β-actin 購自美國Abgent公司；膠質(zhì)纖維酸性蛋白(GFAP)抗體購自美國Sigma公司；CD11b抗體購自英國Abcam公司；β淀粉樣蛋白(Aβ)-6E10抗體購自美國Novus公司；APP抗體、β分泌酶(BACE)1抗體和糖基化末端終產(chǎn)物受體(RAGE)抗體購自美國Santa Cruz公司；硫黃素-S試劑購自武漢艾美捷生物公司；小鼠腫瘤壞死因子(TNF)-α酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)檢測試劑盒、白細(xì)胞介素(IL)-1β ELISA檢測試劑盒、IL-10 ELISA檢測試劑盒和轉(zhuǎn)化生長因子(TGF)-β ELISA檢測試劑盒均購自上海豐壽生物公司。

1.2儀器 冷凍切片機(jī)(VCM-2508Ⅲ型，新鄉(xiāng)市維克科教儀器有限公司)；熒光顯微鏡(BX53型，日本奧利巴斯公司)；Western印跡轉(zhuǎn)印系統(tǒng)〔elmp-cdc/elmpQ型，歐蒙醫(yī)學(xué)診斷(中國)有限公司〕；酶標(biāo)儀(SuPerMax 3000FA型，上海閃譜生物科技有限公司)。

1.3實(shí)驗(yàn)動物分組及給藥 20只12月齡雄性SPF級APP/PS1雙轉(zhuǎn)基因小鼠〔(29.3±3.4)g〕和10只12月齡雄性野生型C57BL/6J小鼠〔(30.1±4.3)g〕購自南京大學(xué)模式動物所，小鼠飼養(yǎng)在12 h晝夜循環(huán)的SPF級動物房中，且小鼠可自由進(jìn)食進(jìn)水。實(shí)驗(yàn)動物遵從動物福利，且通過醫(yī)院動物倫理委員會審查。小鼠在飼養(yǎng)環(huán)境下適應(yīng)3 d后進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。小鼠分為WT組、TG組和TG+OP組。WT組為10只C57BL/6J小鼠。APP/PS1雙轉(zhuǎn)基因小鼠隨機(jī)被分為TG組(10只)和TG+OP組(10只)。TG+OP組小鼠每天灌胃100 mg/kg OP，持續(xù)6 w。WT和TG組小鼠每天以相同體積生理鹽水灌胃。待上述條件飼養(yǎng)結(jié)束后，進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.4水迷宮實(shí)驗(yàn) 在直徑120 cm的水池中進(jìn)行水迷宮實(shí)驗(yàn)。水溫維持在25℃，且在實(shí)驗(yàn)進(jìn)程中保持無人和安靜的實(shí)驗(yàn)環(huán)境，使用攝像頭錄制小鼠運(yùn)動視頻。實(shí)驗(yàn)開始前1 d訓(xùn)練小鼠站臺，隨后5 d記錄小鼠找到平臺的時(shí)間及總游泳距離。在第6天拆除平臺，記錄小鼠穿過平臺的次數(shù)。

1.5小鼠腦組織分離及切片 小鼠在行為學(xué)實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，迅速用乙醚過量麻醉小鼠，快速取出完整腦組織，在冰上快速分離出雙側(cè)海馬及皮層并儲存在-80℃下?；蛉〕鐾暾∈竽X組織后，在4%多聚甲醛中固定過夜。第2天在4℃下在20%和30%蔗糖溶液中依次脫水。使用冷凍切片機(jī)連續(xù)切割獲得小鼠海馬及皮層腦組織切片，保存在-80℃下。

1.6免疫熒光實(shí)驗(yàn) 將皮層或海馬腦片浸入磷酸鹽緩沖液(PBS)中洗滌3次，0.3% Triton透膜30 min，山羊血清37℃下封閉1 h。隨后孵育一抗4℃過夜(GFAP 1∶1 500；CD11b 1∶1 000；6E10 1∶1 000)。第2天洗除一抗后滴加熒光二抗(1：500)并室溫孵育1 h。熒光顯微鏡隨機(jī)選取6個(gè)視野，通過Image J軟件分析。

1.7硫黃素-S染色 將皮層腦片浸入PBS中洗滌3次后，滴加0.5%硫黃素-S溶液孵育20 min。熒光顯微鏡隨機(jī)選取6個(gè)視野，通過Image J軟件分析。

1.8Western印跡 用RIPA裂解液裂解皮層組織，取全蛋白并用BCA法進(jìn)行蛋白定量。取相同體積蛋白樣品電泳。電泳后隨即電轉(zhuǎn)移至甲醇浸泡的聚偏氟乙烯(PVDF)膜。5%脫脂牛奶室溫下封閉1 h，隨后加一抗4 ℃孵育過夜(β-actin 1∶1 500；RAGE 1∶1 000；BACE1 1∶1 500；APP 1∶1 000)。TBST洗膜后，室溫孵育辣根過氧化物酶(HRP)標(biāo)記的二抗1 h，TBST洗膜后成像顯影。膠片掃描后通過Imag J軟件分析條帶灰度值。

1.9ELISA 分別取海馬和皮層組織，經(jīng)勻漿后，通過ELISA分析TNF-α、IL-1β、IL-10和TGF-β的含量。根據(jù)試劑盒說明書配制標(biāo)準(zhǔn)品和工作液，樣品稀釋液與標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液制作過程一致。將標(biāo)準(zhǔn)品和樣品按照每孔50 μl依次加入已包被的ELISA板中，加入一抗，室溫孵育3 h。洗板5次后，加入100 μl HRP耦聯(lián)二抗，室溫孵育30 min。隨后避光加入100 μl TMB溶液室溫反應(yīng)5 min，最后加入終止液。在酶標(biāo)儀中檢測450 nm波長處吸光度值并制作標(biāo)準(zhǔn)曲線。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算待測樣品濃度，乘以稀釋倍數(shù)后得到原始濃度。

1.10統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用Prism7.0軟件進(jìn)行單因素方差分析、t檢驗(yàn)。

2 結(jié) 果

2.1OP對APP/PS1雙轉(zhuǎn)基因小鼠記憶行為的影響 水迷宮實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，與WT組比較，TG組第2天以后小鼠逃避潛伏期和找到平臺前的游泳距離均明顯延長(均P<0.05)，穿越隱藏平臺次數(shù)明顯降低(P<0.05)；與TG組比較，TG+OP組第2天以后小鼠逃避潛伏期和找到平臺前的游泳距離均明顯縮短(均P<0.05)，穿越隱藏平臺次數(shù)明顯增加(P<0.05)。3組平均游泳速度無明顯差異(P>0.05)。見表1～3。表明OP可改善APP/PS1雙轉(zhuǎn)基因小鼠記憶行為受損。

表1 各組逃避潛伏期比較

2.2OP對APP/PS1雙轉(zhuǎn)基因小鼠皮層淀粉樣斑塊沉積的影響 通過免疫熒光染色實(shí)驗(yàn)檢測OP對APP/PS1雙轉(zhuǎn)基因小鼠皮層Aβ斑塊沉積的影響，結(jié)果顯示，與WT組比較，TG組皮層Aβ斑塊沉積明顯增加(P<0.05)；與TG組比較，TG+OP組皮層Aβ斑塊沉積明顯降低(P<0.05)。硫磺素-S染色進(jìn)一步驗(yàn)證小鼠皮層Aβ斑塊沉積情況，實(shí)驗(yàn)結(jié)果同樣證明了OP可顯著減少APP/PS1雙轉(zhuǎn)基因小鼠皮層Aβ斑塊沉積(P<0.05)。見圖1、表4。表明OP可明顯減少APP/PS1雙轉(zhuǎn)基因小鼠皮層中Aβ斑塊沉積。

表2 各組平均游泳速度和穿越隱藏平臺次數(shù)比較

表3 各組找到平臺前的游泳距離比較

圖1 各組皮層淀粉樣斑塊沉積情況

表4 各組皮層中Aβ斑塊和硫磺素-S斑塊比較

2.3OP對APP/PS1雙轉(zhuǎn)基因小鼠皮層Aβ代謝相關(guān)蛋白表達(dá)的影響 與WT組比較，TG組皮層RAGE、BACE1和APP表達(dá)量均明顯升高(P<0.05)；與TG組比較，TG+OP組皮層這些Aβ代謝相關(guān)蛋白均明顯降低(P<0.05)。見圖2、表5。表明OP可降低APP/PS1雙轉(zhuǎn)基因小鼠皮層Aβ的沉積。

圖2 Western印跡檢測各組皮層中RAGE、BACE1和APP蛋白

表5 各組皮層中RAGE、BACE1和APP蛋白相對表達(dá)水平比較

2.4OP對APP/PS1雙轉(zhuǎn)基因小鼠皮層及海馬小膠質(zhì)細(xì)胞和星形膠質(zhì)細(xì)胞活化的影響 通過GFAP免疫熒光染色實(shí)驗(yàn)觀察OP對APP/PS1雙轉(zhuǎn)基因小鼠皮層和海馬中星形膠質(zhì)細(xì)胞活化的影響，實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，與WT組比較，TG組皮層和海馬中GFAP表達(dá)均明顯增高(均P<0.05)；與TG組比較，TG+OP組皮層和海馬中GFAP表達(dá)均明顯降低(P<0.05)，表明OP抑制了APP/PS1雙轉(zhuǎn)基因小鼠皮層和海馬中星形膠質(zhì)細(xì)胞活化。通過CD11b免疫熒光染色實(shí)驗(yàn)觀察OP對APP/PS1雙轉(zhuǎn)基因小鼠皮層和海馬中小膠質(zhì)細(xì)胞活化的影響，實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，與WT組比較，TG組皮層和海馬中CD11b表達(dá)均明顯增高(均P<0.05)；與TG組比較，TG+OP組皮層和海馬中CD11b表達(dá)均明顯降低(P<0.05)，表明OP抑制了APP/PS1雙轉(zhuǎn)基因小鼠皮層和海馬中膠質(zhì)細(xì)胞活化。見表6、圖3、圖4。

表6 各組皮層和海馬中GFAP和CD11b負(fù)荷比較

圖3 各組皮層和海馬中星形膠質(zhì)細(xì)胞和小膠質(zhì)細(xì)胞活化(GFAP免疫熒光，×400)

圖4 各組皮層和海馬中星形膠質(zhì)細(xì)胞和小膠質(zhì)細(xì)胞活化情況(CD11b，免疫熒光，×400)

2.5OP對APP/PS1雙轉(zhuǎn)基因小鼠皮層及海馬中炎癥因子水平的影響 ELISA實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，與WT組比較，TG組皮層和海馬中促炎因子TNF-α和IL-1β含量均明顯升高(均P<0.05)，而抗炎癥因子IL-10和轉(zhuǎn)化生長因子TGF-β含量均明顯降低(均P<0.05)；與TG組比較，TG+OP組皮層和海馬中TNF-α和IL-1β含量均明顯降低(均P<0.05)，IL-10和TGF-β含量均明顯升高(均P<0.05)。見表7。

表7 各組皮層和海馬中炎癥因子水平比較

3 討 論

已有研究發(fā)現(xiàn)，OP有增加大腦抗氧化酶活性、降低脂質(zhì)過氧化水平和抗炎的作用〔5〕。而這些作用在一定程度上與AD進(jìn)程相關(guān)。APP/PS1雙轉(zhuǎn)基因小鼠是目前公認(rèn)的AD轉(zhuǎn)基因小鼠模型〔6〕。本研究結(jié)果表明OP具有抗AD的潛力。

Aβ斑塊沉積是AD發(fā)生的重要誘因，并且Aβ斑塊沉積可誘發(fā)氧化應(yīng)激、神經(jīng)炎癥、神經(jīng)元丟失及突觸變性等繼發(fā)性病理損害或癥狀〔7〕。Aβ是由APP水解而來，APP增高可加劇Aβ沉積〔8〕。BACE1是Aβ水解過程中的限速酶，而Aβ跨血腦屏障向腦組織的轉(zhuǎn)運(yùn)由RAGE介導(dǎo)〔9,10〕。本研究提示OP可降低APP/PS1雙轉(zhuǎn)基因小鼠皮層中Aβ斑塊沉積。

星形膠質(zhì)細(xì)胞和小膠質(zhì)細(xì)胞的活化是AD發(fā)生中的重要病理表現(xiàn)之一，且星形膠質(zhì)細(xì)胞和小膠質(zhì)細(xì)胞活化可加劇AD病理進(jìn)程〔11,12〕。Aβ斑塊沉積誘導(dǎo)的神經(jīng)炎癥是AD進(jìn)展的重要機(jī)制之一，Aβ斑塊沉積不僅能誘導(dǎo)星形膠質(zhì)細(xì)胞和小膠質(zhì)細(xì)胞活化導(dǎo)致的神經(jīng)炎癥，并且炎癥反應(yīng)能進(jìn)一步加劇星形膠質(zhì)細(xì)胞和小膠質(zhì)細(xì)胞活化、增生，這些反應(yīng)級聯(lián)放大加劇Aβ沉積，形成惡性循環(huán)〔13〕。流行病學(xué)顯示，長期服用非甾體抗炎藥可降低AD患病風(fēng)險(xiǎn)〔14〕。本研究結(jié)果提示OP在APP/PS1雙轉(zhuǎn)基因小鼠中有抗星形膠質(zhì)細(xì)胞和小膠質(zhì)細(xì)胞活化及神經(jīng)炎癥的作用。

綜上，OP可改善APP/PS1雙轉(zhuǎn)基因小鼠記憶功能受損并減少皮層中Aβ斑塊沉積及神經(jīng)炎癥。本研究還提示OP是AD治療中具有前景的中藥之一。