陳嘉輝，吉責(zé)小平，殷中瓊，張 翅，鄒元鋒*

(1.四川農(nóng)業(yè)大學(xué)天然藥物研究中心，成都 611130；2.四川省平昌縣人民政府，四川 平昌 636400)

姜黃為姜科植物姜黃(Curcumalonga)的干燥根莖，分布于四川、云南及貴州等地[1]。有破血行氣，通經(jīng)止痛之功效[2]。姜黃素是中藥姜黃的重要有效成分，其化學(xué)結(jié)構(gòu)如圖1所示，具有特殊的二酮類(lèi)結(jié)構(gòu)，可以對(duì)活性氧具有抑制作用[3]。目前，姜黃素已被證實(shí)有抗炎、抗氧化、降血脂和抗腫瘤等多種藥理作用[4-5]，廣泛應(yīng)用于醫(yī)藥保健產(chǎn)業(yè)之中。

圖1 姜黃素的化學(xué)結(jié)構(gòu)式

四川省是姜黃的道地產(chǎn)區(qū)，其中犍為、沐川一帶氣候濕潤(rùn)，種植姜黃已有千年歷史，生產(chǎn)面積大，產(chǎn)量占全國(guó)姜黃的一半以上[6]。但是，由于疫情沖擊，姜黃種植面積萎縮，川產(chǎn)姜黃由于有效成分含量更高[6]，具有更好的藥用價(jià)值，價(jià)格高于云南產(chǎn)姜黃和進(jìn)口姜黃，存在一定的供需缺口。此外，四川每年生產(chǎn)大量的姜黃須根，大多被棄用，造成極大的資源浪費(fèi)及環(huán)境問(wèn)題，但是姜黃的非藥用部位也含有相似的化學(xué)活性成分[7]。因此，加強(qiáng)對(duì)姜黃須根的研究和利用是很有必要的。從姜黃中提取有效成分的方法很多，包括溶劑提取法、酸堿提取法、酶提取法和超聲波輔助提取法等[8]。溶劑提取法由于其工藝簡(jiǎn)單，提取成本低，所以本次試驗(yàn)采用溶劑法提取姜黃須根的相應(yīng)成分。故本試驗(yàn)擬在分析其大類(lèi)成分組成情況下，采用Box-Behnken設(shè)計(jì)-響應(yīng)面分析法優(yōu)化須根姜黃素的提取工藝，為進(jìn)一步開(kāi)發(fā)利用姜黃須根以及后期研究奠定基礎(chǔ)。

1 材料

1.1 原料

本實(shí)驗(yàn)的主要材料為姜黃須根，從樂(lè)山犍為縣姜黃產(chǎn)區(qū)采集，經(jīng)鑒定為姜科植物姜黃Curcumalonga的須根。

1.2 藥品

葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)品(分析純，成都科隆化學(xué)品有限公司)；蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品(純度≥98%，北京索萊寶科技有限公司)；姜黃素標(biāo)準(zhǔn)品(純度≥95%，北京索萊寶科技有限公司)；乙醇(分析純，成都科隆化學(xué)品有限公司)；苯酚(分析純，成都科隆化學(xué)品有限公司)；亞硝酸鈉(分析純，成都科隆化學(xué)品有限公司)；硝酸鋁(分析純，成都科隆化學(xué)品有限公司)。

1.3 儀器

紫外-可見(jiàn)光分光光度計(jì)(上海尤君儀器公司)；電熱恒溫水浴鍋(天津市泰斯特儀器有限公司)；恒溫干燥箱(成都一科儀器設(shè)備有限公司)。

2 方法

2.1 姜黃須根大類(lèi)成分分析

根據(jù)文獻(xiàn)[9-11]所示方法，制作葡萄糖、蘆丁和姜黃素的標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)。

根據(jù)文獻(xiàn)[8,11-12]所示條件分別提取須根多糖、黃酮和姜黃素。按式(1)中方法計(jì)算姜黃須根中大類(lèi)成分的提取率。

Y=(M0/M)×100%

(1)

式中：

Y——姜黃大類(lèi)成分提取率，%；

M0——姜黃大類(lèi)成分的質(zhì)量，g；

M——姜黃須根的質(zhì)量，mg。

2.2 姜黃須根姜黃素提取工藝優(yōu)化

2.2.1 單因素實(shí)驗(yàn) 以須根姜黃素的提取率為指標(biāo)，考察溫度、溶劑體積倍數(shù)、乙醇濃度、提取時(shí)間四個(gè)因素對(duì)姜黃素得率的影響。

2.2.2 Box-Behnken響應(yīng)面實(shí)驗(yàn) 利用Design Expert 10.0.1軟件進(jìn)行優(yōu)化設(shè)計(jì)，根據(jù)單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果，選取其中三個(gè)因素為主要考察因素，以須根姜黃素提取率為響應(yīng)值，設(shè)計(jì)響應(yīng)面優(yōu)化實(shí)驗(yàn)。

根據(jù)回歸模型預(yù)測(cè)條件進(jìn)行驗(yàn)證，將該條件重復(fù)進(jìn)行試驗(yàn)三次，判斷最終姜黃須根中姜黃素提取率與預(yù)測(cè)值是否接近，從而得到最佳提取條件。

3 結(jié)果

3.1 姜黃須根大類(lèi)成分分析結(jié)果

3.1.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn) 得到的葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)吸光度(y)與濃度(x)的線(xiàn)性回歸方程為y=5.7314x-0.0198(R2=0.9956)，在0.01～0.10 mg/mL之間線(xiàn)性關(guān)系良好。

得到的蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)吸光度(y)與濃度(x)的線(xiàn)性回歸方程為y=3.1x-0.0008(R2=0.9988)，在0.004～0.040 mg/mL之間線(xiàn)性關(guān)系良好。

得到的姜黃素標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)吸光度(y)與濃度(x)的線(xiàn)性回歸方程為y=71.867x+0.0096(R2=0.9976)，在0.001～0.010 mg/mL之間線(xiàn)性關(guān)系良好。

3.1.2 大類(lèi)成分提取率的結(jié)果及分析 所得各類(lèi)成分的提取率如表1所示。可見(jiàn)，通過(guò)溶劑回流法，姜黃須根中多糖的平均得率為三者最多，姜黃素的平均得率為三者最低。值得注意的是，朱姍薇[8]等人發(fā)現(xiàn)姜黃各個(gè)部位姜黃素的含量對(duì)進(jìn)行姜黃屬植物的分類(lèi)學(xué)研究具有重要意義，姜黃植物的不同部位姜黃素的含量具有顯著差異。所以，對(duì)姜黃須根的姜黃素進(jìn)行提取工藝優(yōu)化不僅能減少姜黃素的浪費(fèi)，加強(qiáng)對(duì)姜黃資源的保護(hù)，還對(duì)姜黃屬植物的分類(lèi)學(xué)研究具有重要意義。

表1 姜黃須根大類(lèi)成分提取率匯總

3.2 姜黃須根姜黃素提取工藝優(yōu)化結(jié)果

3.2.1 單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果

(1)提取溫度對(duì)姜黃素提取率的影響

結(jié)果如圖2所示?？梢?jiàn)隨著溫度的升高，姜黃素的溶解率增大，須根姜黃素的提取率增大。當(dāng)溫度達(dá)到90℃之后，須根姜黃素的提取率下降。其原因可能是與姜黃素特殊的二酮結(jié)構(gòu)受熱分解有關(guān)。故本次實(shí)驗(yàn)選擇溫度70～90℃來(lái)作為提取工藝優(yōu)化的響應(yīng)條件。

圖2 提取溫度對(duì)姜黃素提取率影響圖

(2)乙醇濃度對(duì)姜黃素提取率的影響

結(jié)果如圖3所示?？梢?jiàn)隨著乙醇濃度的升高，須根姜黃素的提取率逐漸增大。當(dāng)乙醇濃度達(dá)到70%之后，姜黃素的提取率逐漸下降。其原因可能是與在不同濃度的乙醇中姜黃素的溶解度不同有關(guān)。故本次實(shí)驗(yàn)選擇乙醇濃度50%～70%來(lái)作為提取工藝優(yōu)化的響應(yīng)條件。

圖3 乙醇濃度對(duì)姜黃素提取率影響圖

(3)溶劑用量對(duì)姜黃素提取率的影響

結(jié)果如圖4所示，可見(jiàn)隨著溶劑用量的增大，須根姜黃素的提取率增大，但當(dāng)料液比達(dá)到1:20之后，增加幅度不大。其原因可能是隨著溶劑用量的增大，姜黃素的溶出速率逐漸達(dá)到平衡?？紤]到節(jié)省溶劑，故本次實(shí)驗(yàn)選擇溶劑用量15～25倍來(lái)作為提取工藝優(yōu)化的響應(yīng)條件。

圖4 溶劑用量對(duì)姜黃素提取率影響圖

(4)提取時(shí)間對(duì)姜黃素提取率的影響

結(jié)果如圖5所示，可見(jiàn)隨著提取時(shí)間的增大，須根姜黃素溶出到溶劑的含量增多，姜黃素的提取率增大。當(dāng)提取時(shí)間達(dá)到60min后，須根姜黃素提取率有所增大，但是幅度不高，可能是因?yàn)榧?xì)胞內(nèi)外姜黃素滲出滲入逐漸達(dá)到了動(dòng)態(tài)平衡。為了提高提取效率，故本次實(shí)驗(yàn)選擇的提取時(shí)間為60min，且不對(duì)提取時(shí)間進(jìn)行工藝優(yōu)化。

圖5 時(shí)間對(duì)姜黃素提取率影響

3.2.2 Box-Behnken響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)結(jié)果

(1)Box-Behnken實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)結(jié)果

在單因素的實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)上，利用Design Expert 10.0.1軟件進(jìn)行優(yōu)化設(shè)計(jì)，根據(jù) Box-Behnken 的中心組合實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)原理，選取提取溫度(A)、溶劑用量(B)和乙醇濃度(C)三個(gè)因素為主要考察因素，以須根姜黃素提取率為響應(yīng)值，設(shè)計(jì)三因素三水平的響應(yīng)面優(yōu)化實(shí)驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)因素與水平和中心組合設(shè)計(jì)結(jié)果如表2和表3所示。

表2 響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)因素與水平

表3 響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)中心組合設(shè)計(jì)及結(jié)果

(2)回歸方程及方差分析結(jié)果

根據(jù)Design Expert 10.0.1軟件，對(duì)所得數(shù)據(jù)進(jìn)行回歸方程擬合分析，得到的二次回歸方程為：姜黃素提取率(%)=0.27+0.015A+0.052B+6.312×10-3C+8.650×10-3AB-2.250×10-3AC-1.325×10-3BC-0.029A2-0.058B2-0.013C2(R2=0.9835)。

F值的大小可體現(xiàn)各個(gè)工藝條件對(duì)須根姜黃素提取率的影響，因此實(shí)驗(yàn)因素對(duì)響應(yīng)值影響大小的順序如下：B(溶劑用量)>A(溫度)>C(乙醇濃度)。

表4 響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)方差分析

續(xù)表4

(3)響應(yīng)面曲線(xiàn)圖分析結(jié)果

本次實(shí)驗(yàn)所得到的等高線(xiàn)圖和3D曲線(xiàn)圖如圖6-8所示?？梢?jiàn)須根姜黃素的提取率隨著任意兩個(gè)工藝因素的增加而升高，達(dá)到最高值后，再隨之下降。曲面的最高點(diǎn)均位于等高線(xiàn)范圍之內(nèi)，響應(yīng)面3D圖為開(kāi)口向下的平滑的曲線(xiàn)，因此，可以選用此模型來(lái)預(yù)測(cè)須根姜黃素提取率的最優(yōu)條件。

圖6 溶劑用量和溫度對(duì)須根姜黃素提取率的影響

圖7 乙醇濃度和提取溫度對(duì)須根姜黃素提取率的影響

圖8 乙醇濃度和溶劑用量對(duì)須根姜黃素提取率的影響

(4)最優(yōu)條件驗(yàn)證

根據(jù)回歸模型所得到的最佳提取率為：提取溫度為83.224℃，料液比為1：22.331，乙醇濃度為61.921%，在此條件下，須根姜黃素提取率最高為0.280%?？紤]到實(shí)際提取條件，選擇提取溫度為83℃，料液比為1:22，乙醇濃度為60%的條件下進(jìn)行驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)，得到的須根姜黃素提取率為0.277%，相對(duì)誤差為1.64%，與預(yù)測(cè)值接近，表明此回歸模型有效、可靠，可用于須根姜黃素的提取。

4 討論與結(jié)論

姜黃素廣泛應(yīng)用于醫(yī)藥、食品和紡織行業(yè)，具有極高的經(jīng)濟(jì)價(jià)值，預(yù)計(jì)2022年全球姜黃素的市場(chǎng)將高達(dá)0.94億美元[13]。目前研究主要集中在對(duì)姜黃根莖的研究，對(duì)姜黃非藥用部位的研究較少。川產(chǎn)姜黃品質(zhì)較好，隨著對(duì)姜黃素需求的增大，加強(qiáng)對(duì)川產(chǎn)姜黃非藥用部位的研究，可以有效避免藥材的浪費(fèi)，提高全藥材的利用度。提取姜黃須根中的大類(lèi)成分，從而為姜黃的深入加工和藥材資源的合理應(yīng)用提供依據(jù)。采用溶劑法提取姜黃須根的大類(lèi)成分，工藝簡(jiǎn)單，并且可以在較低的提取成本下，達(dá)到較好的藥材利用效果。并輔以響應(yīng)面分析法，優(yōu)化須根中姜黃素的提取條件，達(dá)到對(duì)姜黃中姜黃素的更好利用。

實(shí)驗(yàn)選擇在合適條件下，對(duì)姜黃須根的多糖、黃酮和姜黃素成分進(jìn)行提取，三者的平均得率分別為2.33±0.05%，1.00±0.02%和0.24±0.01%。不僅姜黃素具有極好的抗氧化能力，侯敏娜等[14]通過(guò)體外抗氧化試驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)姜黃多糖和黃酮也具有良好的抗氧化效果，使得對(duì)DPPH自由基的清除率顯著下降。因此，加強(qiáng)對(duì)姜黃非藥用部位的研究是有重要價(jià)值的。通過(guò)響應(yīng)面優(yōu)化實(shí)驗(yàn)，各提取因素對(duì)須根姜黃素提取率的影響為：B(溶劑用量)>A(溫度)>C(乙醇濃度)，與單后松[15]等人研究的各因素對(duì)姜黃素提取率影響相同。對(duì)最佳條件進(jìn)行修正后，在提取溫度為83℃，料液比為1:22，乙醇濃度為60%的條件下得到須根姜黃素的最佳提取率為0.277%，與預(yù)測(cè)值0.280%相近。說(shuō)明本次實(shí)驗(yàn)所得到的模型可靠，可以依據(jù)此模型來(lái)選擇須根姜黃素的最優(yōu)提取條件。