陳勝男，胡柱祺，林金森，邵洋洋，鐘汝情，張杰，謝瑩，焦思思，歐陽(yáng)慧敏，盧嘉賢，許偉鋒，鄒育根，張建峰，翟少倫

（1.廣州中科基因檢測(cè)服務(wù)有限公司 廣州 510500；2.廣州市花都區(qū)動(dòng)物衛(wèi)生監(jiān)督所 廣州 510800；3.廣東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院動(dòng)物衛(wèi)生研究所豬病研究室/廣東省畜禽疫病防治研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/農(nóng)業(yè)農(nóng)村部獸用藥物與診斷技術(shù)廣東科學(xué)觀測(cè)實(shí)驗(yàn)站 廣州 510640）

1 背景

豬流行性腹瀉（porcine epidemic diarrhea，PED）是由豬流行性腹瀉病毒（porcine epidemic diarrhea virus，PEDV）引起豬的一種急性接觸性消化道傳染病，其主要特征為腹瀉、嘔吐和快速消瘦。各種年齡的豬都易感，哺乳仔豬、架子豬及育肥豬的感染率可達(dá)100%，以哺乳仔豬受害最嚴(yán)重，母豬發(fā)病率也較高。

1971 年在英國(guó)首次報(bào)道了PED。此后，許多國(guó)家均有本病的報(bào)道，如比利時(shí)、德國(guó)、加拿大、匈牙利、法國(guó)、日本、保加利亞等（圖1）。我國(guó)從80 年代初開(kāi)始陸續(xù)有PED 的發(fā)生，并分離到病毒，2010 年以來(lái)，在包括中國(guó)在內(nèi)的主要養(yǎng)豬國(guó)家暴發(fā)和流行，成為最重要的豬病毒性腹瀉病之一。

圖1 豬流行性腹瀉的流行與變異

廣東作為養(yǎng)豬大省、豬肉消費(fèi)大省，開(kāi)展豬流行性腹瀉病毒的分子流行病學(xué)調(diào)查具有重要意義和實(shí)用價(jià)值，主要體現(xiàn)在：①可以鑒定病原的血清型；②可以研究其分子特征；③可以分析其遺傳變異規(guī)律，根據(jù)流行毒株流行趨勢(shì)，制備或選用合適的疫苗進(jìn)行防控。因此，本研究對(duì)廣東省16 個(gè)地市的代表性大、中、小規(guī)模豬場(chǎng)進(jìn)行調(diào)查、采樣、病原測(cè)序分析研究，獲取科學(xué)數(shù)據(jù)，提出了腹瀉的防控措施建議，以供防控決策參考。

2 材料方法

2.1 監(jiān)測(cè)地區(qū)及對(duì)象

共采集廣東省16 個(gè)地市62 個(gè)規(guī)模豬場(chǎng)的379 份樣品（圖2），其中茂名地區(qū)9 個(gè)規(guī)模豬場(chǎng)共計(jì)56 份樣品，江門(mén)地區(qū)8 個(gè)規(guī)模豬場(chǎng)共計(jì)48 份，惠州地區(qū)6 個(gè)規(guī)模豬場(chǎng)共計(jì)45 份，湛江地區(qū)8個(gè)規(guī)模豬場(chǎng)共計(jì)42 份，廣州地區(qū)4 個(gè)規(guī)模豬場(chǎng)共計(jì)41 份，清遠(yuǎn)地區(qū)4 個(gè)規(guī)模豬場(chǎng)共計(jì)38 份，河源地區(qū)7 個(gè)規(guī)模豬場(chǎng)共計(jì)32 份，肇慶地區(qū)6 個(gè)規(guī)模豬場(chǎng)共計(jì)29 份，佛山地區(qū)5 個(gè)規(guī)模豬場(chǎng)共計(jì)25份，梅州地區(qū)5 個(gè)規(guī)模豬場(chǎng)共計(jì)23 份，潮州地區(qū)3 個(gè)規(guī)模豬場(chǎng)共計(jì)15 份，陽(yáng)江地區(qū)6 個(gè)規(guī)模豬場(chǎng)共計(jì)14 份，韶關(guān)地區(qū)2 個(gè)規(guī)模豬場(chǎng)共計(jì)11 份，揭陽(yáng)地區(qū)1 個(gè)規(guī)模豬場(chǎng)共計(jì)10 份，珠海地區(qū)1 個(gè)規(guī)模豬場(chǎng)共計(jì)6 份，中山地區(qū)1 個(gè)規(guī)模豬場(chǎng)共計(jì)5 份。

圖2 2021 年廣東省豬流行性腹瀉病毒抗原監(jiān)測(cè)區(qū)域

2.2 檢測(cè)方法

采用豬流行性腹瀉病毒、豬傳染性胃腸炎病毒、豬輪狀病毒三重PCR 檢測(cè)方法對(duì)臨床樣品進(jìn)行檢測(cè)，具體引物序列見(jiàn)表1，具體反應(yīng)條件為：42℃反轉(zhuǎn)錄45min，94℃預(yù)變性5min；94℃變性50s，56℃退 火60s，72℃延 伸60s（35個(gè)循環(huán)）；72℃再延伸10min。

表1 豬流行性腹瀉病毒、豬傳染性胃腸炎病毒、豬輪狀病毒三重PCR檢測(cè)方法用引物

此外，對(duì)豬流行性腹瀉病毒陽(yáng)性的樣品開(kāi)展其部分S 基因擴(kuò)增，具體擴(kuò)增引物為：PEDV-919-F：5'-GAACTGCCATTCAGCGTATT-3'，PEDV-919-R：5'-CTGCCAGATTTACAGACACCTA-3'，擴(kuò)增條件為：42℃反轉(zhuǎn)錄30min，94℃預(yù)變性5min；94℃變性40s，56℃退火30s，72℃延伸30s（35個(gè)循環(huán)）；72℃再延伸10min。擴(kuò)增目的條帶大小為919bp。

3 結(jié)果與分析

3.1 廣東省各地市豬流行性腹瀉病毒抗原流行分布情況

對(duì)采集的379 份腹瀉樣品，使用豬流行性腹瀉病毒、豬傳染性胃腸炎病毒、豬輪狀病毒三重PCR 檢測(cè)方法，檢出豬輪狀病毒核酸陽(yáng)性樣品106 份，陽(yáng)性率27.96%；檢出豬流行性腹瀉病毒核酸陽(yáng)性樣品50 份，陽(yáng)性率13.19%（表2）；未檢出豬傳染性胃腸炎病毒核酸陽(yáng)性樣品。

表2 豬流行性腹瀉病毒檢測(cè)結(jié)果

3.2 PEDV 部分S 基因的序列分析

利用RT-PCR 方法對(duì)PEDV 陽(yáng)性樣品進(jìn)行了部分S 基因擴(kuò)增、測(cè)序，并使用DNASTAR 軟件與來(lái)自我國(guó)、比利時(shí)、韓國(guó)等國(guó)的9株參考毒株進(jìn)行比較分析，確定了各個(gè)毒株之間的親緣關(guān)系，并繪制了系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)。結(jié)果表明：8 個(gè)毒株（紅色框區(qū)域）的部分S 基因片段長(zhǎng)約900bp（圖3），與經(jīng)典疫苗株CV777 和DR13 的同源性分別為96.1%～97.1%和95.7%～96.8%，與疫苗株AJ1102、LW、ZJ08 的同源性分別為93.1%～98.1%，93.1%～98.1%和92.5%～96.8%，而與流行株SDFQ、SDSJ、SXZJ、JXTQ 的同源性為97.1%～99.9%（圖4）。遺傳進(jìn)化樹(shù)分為2 個(gè)進(jìn)化分支，即G1 基因型和G2基因型（圖5）。G1 主要為PEDV 疫苗株，G2 大多數(shù)為PEDV 流行毒株，這說(shuō)明G2 是廣東省PEDV 流行的主要基因型。

圖3 普通RT-PCR 擴(kuò)增部分S 基因電泳結(jié)果

圖4 PEDV S 基因的同源性分析

圖5 PEDV S 基因遺傳進(jìn)化分析

4 小結(jié)與展望

2010 年以來(lái)，豬流行性腹瀉在我國(guó)再次暴發(fā)，是造成我國(guó)各地養(yǎng)殖場(chǎng)仔豬死亡的主要疫病之一，嚴(yán)重地危害養(yǎng)殖業(yè)的發(fā)展和養(yǎng)殖戶的經(jīng)濟(jì)利益。因此，每年開(kāi)展對(duì)PED 的流行病學(xué)監(jiān)測(cè)和免疫預(yù)防，特別是通過(guò)分子生物學(xué)手段對(duì)PEDV 的分子流行病學(xué)特征進(jìn)行監(jiān)測(cè)，可使我們了解PEDV 毒株的來(lái)源和變異程度及毒株之間的親緣關(guān)系，從而為該病的防控提供理論依據(jù)。

由于PEDV 流行的毒株為G2 基因亞群。PEDV 流行毒株與疫苗毒株CV777 在S 基因有很大的變異。因此，豬場(chǎng)的流行性腹瀉防控難度加大，接種PEDV 弱毒疫苗與滅活疫苗的豬場(chǎng)防控效果不理想。但希望疫苗企業(yè)可以根據(jù)流行趨勢(shì)研制新流行毒株疫苗或養(yǎng)殖場(chǎng)選用合適的疫苗進(jìn)行防控。此外，豬場(chǎng)做好飼養(yǎng)管理、生物安全、對(duì)癥治療也很關(guān)鍵，可減少疫病的流行及減少經(jīng)濟(jì)損失。