洪亮，王福云，盧敏，盧啟寰

（1.臺州市藥品檢驗研究院 浙江臺州 318000；2.浙江豐安生物制藥有限公司 浙江臺州 318000）

隨著養(yǎng)殖技術(shù)的進步以及國內(nèi)對豬肉需求量的不斷增加，我國的豬養(yǎng)殖業(yè)越來越向規(guī)模化的方向發(fā)展，甚至在部分地區(qū)，豬養(yǎng)殖業(yè)已經(jīng)成為當?shù)刂匾慕?jīng)濟來源。豬疾病問題在豬養(yǎng)殖過程中給養(yǎng)殖帶來的不利影響較大，疫苗免疫接種不恰當、引種不合理、圈舍衛(wèi)生環(huán)境較差、養(yǎng)殖密度過大、豬群之間接觸頻繁、缺乏有效的防疫手段等因素都會導致豬相關(guān)疫病的傳播，從而影響?zhàn)B殖效益。豬疾病根據(jù)感染源的區(qū)別，可以分為寄生蟲疾病、細菌性疾病以及病毒性疾病。雖然寄生蟲感染一般不會直接致病，但寄生蟲在體內(nèi)或體表繁殖生長過程中會與豬爭奪營養(yǎng)，從而導致豬群抵抗力下降，進而繼發(fā)感染多種細菌性或病毒性疾病。豬細菌性疾病目前有抗生素相關(guān)藥物可以進行治療，但病毒性疾病尚無特效藥。盡管針對某些豬病毒性疾病，已研發(fā)出相應的疫苗，但由于病毒的變異性較強，即使有疫苗也無法100%起到保障作用，況且部分疫病還暫無相應疫苗。因此，對各種豬病毒性疾病的及早診斷尤為重要。其中常見的診斷方法包括傳統(tǒng)病原學檢測、免疫學檢測及分子生物學檢測。本文詳細介紹了常見豬病毒性疾病的特點，進而對現(xiàn)有豬病毒性疾病檢測方法的技術(shù)特征進行了比較，以期為檢測方法的研發(fā)和應用提供參考。

1 豬病毒性疾病

豬病毒性疾病通常是由一、二、三類動物疫病組成，由多種病毒感染引發(fā)的一類病毒性傳染性疾病的總稱，是生豬養(yǎng)殖中威脅較為嚴重的一類。目前我國的生豬養(yǎng)殖規(guī)模不斷增長，新型病毒性傳染疾病的發(fā)生率逐年升高。2018 年下半年，以非洲豬瘟為首的病毒性疾病席卷全國，對生豬養(yǎng)殖業(yè)造成毀滅性打擊。常見的豬病毒性疾病主要包括豬口蹄疫、豬瘟和豬流行性腹瀉等。

1.1 豬口蹄疫

口蹄疫為農(nóng)業(yè)農(nóng)村部《一、二、三類動物疫病病種名錄》中的一類動物疫病，是世界范圍內(nèi)危害和造成經(jīng)濟損失最大的病原體之一。世界動物衛(wèi)生組織（WOAH）把口蹄疫列為A 類傳染病之首，它是由口蹄疫病毒（FMDV）引起的一種急烈性傳染疾病，主要感染偶蹄類動物，如豬、羊、牛等?？谔阋卟《痉诸惿鲜菍儆谖NA 病毒科口蹄疫病毒屬。病毒球形，直徑約為23nm 左右，單股RNA，沒有囊膜，有較強的對外界環(huán)境抵抗力，在組織和污染物中甚至能存活數(shù)月時間，對紫外線、高溫、酸堿敏感，但酚、酒精、氯仿等消毒劑對口蹄疫病毒無效。動物感染口蹄疫后主要表現(xiàn)為發(fā)熱以及跛行，并且在其口腔、蹄、乳房等部位的黏膜或皮膚會出現(xiàn)水泡、潰爛等現(xiàn)象。而患病的幼畜則會出現(xiàn)出血性腸炎和壞死性心肌炎，從而導致急性死亡。

1.2 豬瘟

由經(jīng)典豬瘟病毒（CSFV）引起的高度接觸性傳染疾病一般稱為豬瘟，特點是具有高傳染性和高致病性。經(jīng)典豬瘟病毒屬黃病毒科瘟病毒屬，為單股正鏈RNA，其中間部分具有編碼多聚蛋白的開放閱讀框。豬瘟被WOAH 列為必須通報的疫病，也是我國的一類動物傳染病。豬瘟的出現(xiàn)距今已有200 多年歷史，雖然目前不少國家鮮有豬瘟發(fā)病的報道，但在近期日本又出現(xiàn)豬瘟的暴發(fā)流行，所以仍應重視其對養(yǎng)豬業(yè)發(fā)展的危害。

1.3 非洲豬瘟

由非洲豬瘟病毒（ASFV）感染家豬及各種野豬引起的一種具有急性、出血性、以及烈性傳染性的疾病被稱為非洲豬瘟。非洲豬瘟病毒屬于非洲豬瘟科非洲豬瘟病毒屬，為雙股線狀DNA，大小一般為170～190kb。該病被WOAH 列為法定通報的動物疫病，也是我國的一類動物疫病。自2018 年8 月傳入我國遼寧省以來，我國共發(fā)生非洲豬瘟疫情近150 起，撲殺生豬110 多萬頭，給我國生豬養(yǎng)殖業(yè)造成了巨大的損失。非洲豬瘟發(fā)病過程短，急性感染死亡率較高，患畜的臨床表現(xiàn)為心跳加快，呼吸困難以及超過40℃的高熱，還會出現(xiàn)咳嗽，皮膚發(fā)紺，眼或鼻有漿液性、黏液性的膿性分泌物，淋巴結(jié)、腎及胃腸黏膜伴有明顯的出血等癥狀。因為非洲豬瘟和經(jīng)典豬瘟在癥狀上極為相似，除了通過專業(yè)實驗室檢測外，一般很難準確區(qū)分二者。

1.4 豬繁殖與呼吸障礙綜合征

由豬繁殖與呼吸障礙綜合征病毒（PRRSV）引起的豬傳染性疾病一般稱為豬繁殖和呼吸障礙綜合征，民間又稱其為“豬藍耳病”。豬繁殖與呼吸障礙綜合征病毒屬于尼多病毒目動脈炎病毒科動脈炎病毒屬，單股正鏈RNA，具有囊膜。豬繁殖與呼吸障礙綜合征以妊娠母豬流產(chǎn)、產(chǎn)死胎、產(chǎn)木乃伊胎等繁殖障礙和以仔豬為代表的各年齡段豬的呼吸道疾病為特征。該病曾經(jīng)在世界各地上演過空前的“流產(chǎn)風暴”，造成巨大的經(jīng)濟損失。豬繁殖與呼吸障礙綜合征不僅會造成母豬大量的流產(chǎn)，同時會使豬群發(fā)生嚴重免疫抑制，導致豬其它細菌性或病毒性疫病的產(chǎn)生，從而產(chǎn)生巨大的防控壓力，已成為困擾我國規(guī)模化養(yǎng)豬的主要疫病之一。

1.5 豬偽狂犬病

由偽狂犬病毒（PRV）引起的多種動物均能感染的高度接觸性、急性傳染性疾病一般稱為偽狂犬病。偽狂犬病毒屬于皰疹病毒科水痘病毒屬，雙鏈線性DNA，具有圓形或橢圓形的外觀，對外界抵抗力較強，病料腐敗11d 后才會逐漸失去感染能力。豬是偽狂犬病毒唯一的自然宿主，因此該病嚴重危害到我國的生豬養(yǎng)殖業(yè)。

1.6 豬乙型腦炎

豬乙腦在農(nóng)業(yè)農(nóng)村部《一、二、三類動物疫病病種名錄》中被列為二類動物疫病，屬于嚴重危害中樞神經(jīng)系統(tǒng)的自然源性的人豬共患急性傳染病。乙腦病毒（JEV）屬黃病毒科黃病毒屬。病毒顆粒呈球型，直徑約為50nm，基因組為單股正鏈RNA，有傳染性。20面體對稱，有衣殼。作為自然疫源性的疫病，乙型腦炎在感染各類動物后都可能使其成為本病的傳染源，而其中豬的感染最為普遍，豬感染后主要產(chǎn)生高熱、流產(chǎn)、死胎和公豬睪丸炎等癥狀。乙型腦炎的重癥病死率高，且易造成不同程度的神經(jīng)系統(tǒng)后遺癥，故世界衛(wèi)生組織（WHO）將其列為重點控制的傳染病。

1.7 豬圓環(huán)病毒病

生豬感染豬圓環(huán)病毒（PCV）而引發(fā)的一類病毒性傳染病被稱為豬圓環(huán)病毒病。豬圓環(huán)病毒是目前世界上發(fā)現(xiàn)的最小的一種病毒，其直徑僅為17nm。豬圓環(huán)病毒目前分為三型，其中PCV1 為非致病性類型；PCV2 為致病性類型，會引起斷奶仔豬的多系統(tǒng)衰竭綜合征，感染嚴重時其造成的病死率甚至可高達40%；PCV3 是近些年才發(fā)現(xiàn)的一種新類型。豬圓環(huán)病毒病具有一定的潛伏期，所以在前期不容易被發(fā)現(xiàn)，感染后期斷奶仔豬引發(fā)的多系統(tǒng)衰竭綜合征不僅會造成高致死率，同時會引起仔豬機體抵抗力降低，導致繼發(fā)或混合感染，進一步提高了診治的難度，該病嚴重影響我國生豬養(yǎng)殖業(yè)的發(fā)展。

1.8 豬流行性腹瀉

由豬流行性腹瀉病毒（PEDV）引起的豬急性高度接觸性腸道傳染性疾病被稱為豬流行性腹瀉，其癥狀主要為水樣腹瀉、嘔吐、脫水等。豬流行性腹瀉病毒為冠狀病毒科冠狀病毒屬，為單股正鏈RNA，具有囊膜。該病近些年來在世界各國都出現(xiàn)過大規(guī)模暴發(fā)流行的情況，使生豬養(yǎng)殖業(yè)遭受巨大的經(jīng)濟損失。

2 常見豬病毒性疾病檢測方法

2.1 傳統(tǒng)病原學檢測

傳統(tǒng)病原學檢測包括電鏡檢測（EM）、病毒分離培養(yǎng)鑒定等方法。鏡檢是快速檢測病毒的方法之一，是指在電鏡下對病毒進行檢測，常用磷鎢酸進行負染色，不僅能直接觀察及檢測病毒的形態(tài)與結(jié)構(gòu)，也能鑒定病毒。病毒分離培養(yǎng)鑒定則依據(jù)病毒只能在活細胞內(nèi)復制增殖，選擇敏感動物、雞胚或離體組織與細胞，分別進行動物接種、雞胚接種、組織培養(yǎng)或細胞培養(yǎng)來分離培養(yǎng)病毒。培養(yǎng)后的純病毒可用于鑒定、分型、感染特性和致病特性等研究。傳統(tǒng)方法雖具有技術(shù)成熟的優(yōu)勢，但也有其固有的局限性，比如檢測時間長、操作繁瑣、很依賴檢驗人員的經(jīng)驗、往往需要培養(yǎng)活病毒才能檢測等缺點。

2.2 免疫學檢測

常見免疫學檢測技術(shù)包括酶聯(lián)免疫吸附法（ELISA）和膠體金免疫技術(shù)。

1）酶聯(lián)免疫吸附法（ELISA）。酶聯(lián)免疫吸附法的基礎(chǔ)是抗體（抗原）的固相化及抗體（抗原）的酶標記，基本原理是將一定濃度的抗體（抗原）吸附在固相載體（最常見的為聚苯乙烯）的外表面，且要維持抗體（抗原）的免疫活性，并通過共價鍵形成酶標抗體（抗原）；樣本（抗原或抗體）加入后，與固定板上的酶標抗體（抗原）結(jié)合形成酶標復合物，可依據(jù)酶標復合物顯色的深淺來判斷是否發(fā)生了免疫反應以及相應抗體（抗原）的量的多少，以此來進行定性或定量的分析。文獻采用抗豬繁殖與呼吸障礙綜合征病毒的N 蛋白單克隆抗體來建立檢測PRRSV 抗體競爭性的酶聯(lián)免疫吸附法，該方法具有高敏感性和高特異性，與IDEXX 的PRRSV ELISA 的檢測結(jié)果符合率>90%；文獻以口蹄疫病毒VP1 重組結(jié)構(gòu)蛋白為抗原建立豬口蹄疫病毒抗體的間接酶聯(lián)免疫吸附檢測法，與液相阻斷ELISA 的檢測結(jié)果符合率為96.25%，與HA 的檢測結(jié)果符合率為96.2%，與上海優(yōu)耐特FMDV VP1 ELISA 檢測結(jié)果符合率為87.27%；文獻以乙型腦炎病毒弱毒疫苗株作為診斷抗原來建立豬乙腦病毒血清抗體間接酶聯(lián)免疫吸附檢測法，研究者將其對相關(guān)地區(qū)的豬乙型腦炎血清抗體進行檢測，和市售的試劑盒比較，結(jié)果符合率為95.6%，與以NS1 蛋白包被建立的酶聯(lián)免疫吸附檢測法比較，結(jié)果符合率為97.7%。

2）膠體金免疫技術(shù)。膠體金是氯金酸在還原劑的作用下，聚合成帶負電的穩(wěn)定的疏水金顆粒膠溶液，金顆粒表面的負電荷，能夠和多種生物高分子物質(zhì)的正電荷基團因靜電吸附作用而牢固結(jié)合，這種結(jié)合不會影響其生物特性，因此被視為免疫反應的理想標記物。膠體金標記技術(shù)以膠體金作為示蹤標志物，用于抗原抗體反應的一種新型免疫標記技術(shù)，主要包括斑點免疫金滲濾法（dot immunogold filtration assay，DIGFA）和膠體金免疫層析法（immunochromatographic test strip，ICST）。文獻選擇致病性豬圓環(huán)病毒的Cap 蛋白，建立了致病性豬圓環(huán)病毒的膠體金免疫層析檢測法，與市售ELISA 試劑盒比較，對相關(guān)血樣的檢測結(jié)果符合率達到94%。文獻建立了O 型口蹄疫病毒的膠體金免疫層析檢測法，可在5min 內(nèi)完成檢測，并與其它病毒抗體無交叉反應，靈敏度為95%，與市售ELISA 試劑盒的檢測效率相當。文獻則建立了基于N 蛋白的PRRSV 膠體金免疫層析檢測法，靈敏度為97.5%，特異性為91.1%，與市售ELISA 試劑盒的檢測效率相當。文獻建立了基于CnC2 蛋白的CSFV 膠體金免疫層析檢測法，靈敏度為97%，特異性為100%，與市售試劑盒的檢測效率相當。文獻研發(fā)了一種PRV 熒光免疫層析檢測試紙條（F-ICS），最低檢測限度為0.13ng/mL，檢測線范圍（DLR）為0.13～2.132 ng/mL，最低檢測限比普通的試紙條還低10 倍，與PCR 的檢測結(jié)果一致。

免疫學檢測技術(shù)在豬疫病檢測中應用廣泛，其具有快捷簡便，結(jié)果直觀，安全無污染，經(jīng)濟實惠等優(yōu)點；但每次僅能檢測單樣本，通量低，且無法進行定量檢測，其靈敏度、特異性亟待加強以滿足市場的高要求。

2.3 分子生物學檢測

常見分子生物學檢測方法有熒光定量PCR（qPCR）技術(shù)、多重PCR 技術(shù)、恒溫擴增技術(shù)、基因芯片技術(shù)等。

1）熒光定量PCR（qPCR）技術(shù)。熒光定量PCR 是通過熒光染料或者熒光標記的探針，在整個PCR 過程中標記跟蹤PCR 產(chǎn)物，最終實現(xiàn)定量分析模板的方法。由于其定量準確、靈敏度及特異性高等優(yōu)點，被廣泛應用于多種豬病毒的鑒別診斷，是目前最常用的診斷方式。

2）多重PCR 技術(shù)。多重PCR 是將多對引物加入到同一個PCR體系中，同時擴增出多個核酸片段的方法，因而廣泛應用于多種病原微生物的同時檢測。文獻針對TGEV 的N 基因、PEDV 的M 基因、豬A 群輪狀病毒的VP7 基因設(shè)計了特異性引物，成功建立了可以同時檢測PEDV、TGEV 和豬A 群輪狀病毒的多重RT-PCR 方法；文獻建立的EvaGreen 多重實時熒光PCR 體系可同時檢測包含豬細小病毒（PPV）、豬圓環(huán)病毒II 型（PCV2）、豬繁殖與呼吸綜合癥病毒（PRRSV）、豬瘟病毒（CSFV）、日本腦炎病毒（JEV）、偽狂犬病病毒（PRV）在內(nèi)的6 種常見豬病毒，結(jié)果顯示6 種豬病毒在EvaGreen 多重實時熒光PCR 中均無非特異性擴增且靈敏度可達100～500copies/μ L；且批內(nèi)和批間重復的Tm 變異系數(shù)均在5%以內(nèi)。

3）恒溫擴增技術(shù)。環(huán)介導恒溫擴增技術(shù)（LAMP）是一種本世紀興起的新型核酸擴增方法，被廣泛應用于多種病毒的檢測。該法具有快速簡便、高靈敏度、高特異性等特點，被基層單位大量使用。文獻建立了PEDV 的LAMP 檢測法，該法在62℃水浴40min 即可完成實驗，結(jié)果顯示該法可檢測的RNA 量可低至10pg，且不會發(fā)生其它常見豬病毒核酸的擴增反應，特異性較好。文獻利用LAMP 原理建立了一個快速且能定量的Real-time RT-LAMP 法，通過擴增JEV 的包膜E 蛋白基因來定量檢測JEV，將檢測時間縮短至1h，檢測下限為1PFU，其敏感性與常規(guī)RT-PCR 相似。文獻建立了PRRSV 的環(huán)介導逆轉(zhuǎn)錄等溫檢測方法，該方法靈敏度比熒光定量PCR 高100 倍，全部反應可在1h 內(nèi)完成，且PCV、CSFV、PRV 的擴增結(jié)果均為陰性。

重組酶介導等溫擴增技術(shù)（recombinase aided amplification，RAA）是新興的已申請我國專利的一種等溫檢測方法，其利用重組酶、單鏈結(jié)合蛋白、DNA 聚合酶在37℃等溫條件下（最適溫度）進行核酸擴增的一種技術(shù)。文獻基于非洲豬瘟病毒保守基因B646L（P72）序列，設(shè)計特異性引物、探針，建立ASFV RAA-重組酶介導等溫核酸擴增檢測法，檢測時間僅需10min，且與口蹄疫病毒（FMDV）、偽狂犬病病毒（PRV）、豬細小病毒（PPV）等均無交叉反應，與WOAH 推薦的熒光定量PCR 檢測結(jié)果一致。

4）基因芯片技術(shù)?；蛐酒夹g(shù)是利用核酸分子雜交配對的特性建立起來的一種高效、特異、靈敏、快速的基因分析技術(shù)，可在一個芯片中實現(xiàn)數(shù)個樣品、多種病原體的同時檢測。把PCR 擴增技術(shù)和基因芯片檢測技術(shù)相結(jié)合，通過PCR 的擴增作用及基因芯片的雜交技術(shù)，實現(xiàn)兩者的優(yōu)勢互補，從而達到較高的靈敏度。文獻利用基因芯片技術(shù)和多重PCR 技術(shù)建立了同時檢測豬瘟病毒、豬繁殖與呼吸綜合征病毒、豬細小病毒、乙腦病毒及豬圓環(huán)病毒2 型這5 種病毒，該方法特異性強、穩(wěn)定性好，靈敏度可達10copies/μL。文獻建立了可同步檢測10 種豬常見疫病病毒（PRRSV、PRV、CSFV、PCV2、SIV、PEDV、TGEV、PPV、FMDV 和PCMV）的基因芯片檢測技術(shù)，應用其對1,006 份樣品進行符合檢測，結(jié)果顯示，該方法快速便捷、靈敏度高、特異性好，最低檢測限可達105copies/μL，與普通PCR/RT-PCR 的檢測符合率達到96.76%以上。

3 展望

雖然目前我國在控制豬疾病方面有了很大的發(fā)展，但仍不斷有新的病毒性疾病出現(xiàn)，從而嚴重危害生豬養(yǎng)殖業(yè)。針對豬病毒性疾病的快速、準確診斷就顯得尤為重要，其中分子生物學檢測以其快速、準確、簡便等優(yōu)勢越來越成為最常見的檢測手段。而多重檢測則可同時檢測多種病毒從而可更好地防控病毒性疾病，降低豬發(fā)病率，保障養(yǎng)豬業(yè)從業(yè)者的利益，降低因病毒的傳播導致的損失。

隨著生物檢測技術(shù)的不斷革新，筆者推測，未來豬病毒性疾病的診斷技術(shù)會逐步往微型化、集成化及大數(shù)據(jù)分析的方向發(fā)展，可為我國豬養(yǎng)殖行業(yè)提供更好的技術(shù)支撐，促進該行業(yè)又好又快的發(fā)展，進一步夯實全社會食品安全基礎(chǔ)。