胡 俊， 趙 熠， 楊國華， 趙 旻， 武軍駐

（武漢大學基礎(chǔ)醫(yī)學院，武漢 430072）

0 引 言

基礎(chǔ)醫(yī)學是醫(yī)學教育的理論基礎(chǔ)，基礎(chǔ)醫(yī)學實驗教學是理論知識和實踐操作的連接，是培養(yǎng)學生科研能力的重要途徑?！秶抑虚L期教育改革和發(fā)展規(guī)劃綱要（2010-2020年）》要求高等院?！搬槍Σ煌瑢哟?、不同類型人才培養(yǎng)的特點，改進專業(yè)培養(yǎng)方案，構(gòu)建科學的課程體系和學習支持體系”。傳統(tǒng)的基礎(chǔ)醫(yī)學實驗教學體系通常以形態(tài)學、機能學、病原生物學、解剖學、分子生物學等專業(yè)進行劃分，教學過程中強調(diào)本學科實驗知識技術(shù)的應用性和獨立性，使知識體系有所割裂。近些年來，國內(nèi)一些醫(yī)學院校在嘗試進行基礎(chǔ)醫(yī)學實驗教學改革，通過課程整合使之成為結(jié)構(gòu)性好、整體協(xié)調(diào)的新型課程［1-5］，使學生能在短時間內(nèi)系統(tǒng)掌握各基礎(chǔ)醫(yī)學實驗的原理和操作。實驗教學改革更重要的目的是培養(yǎng)學生的科研意識、科研思維和科研能力，激發(fā)學生的科研熱情和科研興趣，提高學生的綜合科研素質(zhì)［6-9］。

本研究以目前在生物醫(yī)學科研領(lǐng)域應用廣泛的熒光蛋白報告系統(tǒng)和慢病毒表達系統(tǒng)為切入點，一方面將兩項重要實驗技術(shù)融合為一個小型綜合實驗，培養(yǎng)本科生開展系統(tǒng)科研的能力，另一方面更著重于引導本科生了解生物醫(yī)學科研前沿，培養(yǎng)他們對科研的興趣和熱愛，為推進學生自主開展大學生創(chuàng)新訓練科研項目、提前進入PI（principle investigator）學術(shù)帶頭人實驗室從事科學研究等提供扎實的實驗基礎(chǔ)。

1 實驗設(shè)計

綠色熒光蛋白（Green fluorescent protein，GFP）及其演變來的突變體（紅色熒光蛋白RFP、黃色熒光蛋白YFP等）因具有良好的熒光激發(fā)特性、穩(wěn)定的真原核細胞表達、分子量較小易于進行基因融合表達等特性，被廣泛應用為蛋白質(zhì)定位的分子標記和報告基因，是當前生物及生物醫(yī)學研究中應用最為廣泛的一類熒光標記。

在生物醫(yī)學研究中，GFP作為熒光標記被廣泛應用于細胞和動物水平的研究［10-11］。在細胞水平上，利用基因融合技術(shù)，將目的基因與熒光蛋白序列融合表達，從而開展目標基因時空表達、細胞器及功能位點活細胞定位、亞細胞水平細胞器動態(tài)變化等研究。在動物水平上，熒光蛋白主要作為熒光標記用于小動物活體熒光成像。小動物活體成像技術(shù)采用高靈敏度制冷CCD相機配合特制的成像暗箱和圖像處理軟件，可以直接監(jiān)控活體動物體內(nèi)的細胞活動和基因行為。利用小動物活體成像技術(shù)，可以觀測活體動物體內(nèi)腫瘤的生長及轉(zhuǎn)移、感染性疾病發(fā)展過程、特定基因的表達等生物學過程［12-15］。

GFP在細胞水平的應用可通過瞬時轉(zhuǎn)染細胞或是構(gòu)建穩(wěn)定轉(zhuǎn)化細胞系實現(xiàn)，使用穩(wěn)定轉(zhuǎn)化的熒光標記細胞株開展細胞水平研究比瞬時轉(zhuǎn)染更為方便，且實驗結(jié)果也更為穩(wěn)定可靠。在動物水平上使用GFP作為熒光標記進行長期動態(tài)觀察，則以使用穩(wěn)定轉(zhuǎn)化的熒光標記細胞系為佳。因此，穩(wěn)定轉(zhuǎn)化的熒光標記細胞株在生物醫(yī)學科研中具有廣泛的應用，構(gòu)建穩(wěn)定轉(zhuǎn)化的熒光標記細胞株對于開展生物醫(yī)學科研具有非常重要的作用。

目前，構(gòu)建穩(wěn)定轉(zhuǎn)化細胞系效率最高的技術(shù)途徑是慢病毒技術(shù)［16-17］。慢病毒載體是基于人類免疫缺陷I型病毒（HIV-1）為基礎(chǔ)發(fā)展起來的載體系統(tǒng)，由包裝載體和表達載體兩部分組成。慢病毒載體系統(tǒng)刪除了全部HIV-1的編碼基因，在介導目標基因表達時不會表達HIV-1蛋白，其安全性已在國內(nèi)外長期科研實踐中得到了充分證實。

小型綜合科研實驗的內(nèi)容和技術(shù)路線如圖1所示。通過構(gòu)建一個基于慢病毒系統(tǒng)的GFP表達載體，經(jīng)慢病毒包裝和感染后篩選獲得穩(wěn)定表達GFP的A549細胞系，再使用該穩(wěn)轉(zhuǎn)細胞系進行裸鼠成瘤實驗，最后活體觀察裸鼠體內(nèi)腫瘤的綠色熒光。

圖1 實驗技術(shù)路線

這個實驗項目融合了基因克隆、載體構(gòu)建、細胞培養(yǎng)、瞬時轉(zhuǎn)染、病毒收集、病毒感染、裸鼠成瘤等分子生物學實驗、細胞學實驗、病毒學實驗和動物實驗，又涉及激光共聚焦顯微鏡、流式細胞儀、小動物活體成像系統(tǒng)等常用大型實驗設(shè)備的使用，具有很強的綜合性。這個實驗項目旨在帶領(lǐng)醫(yī)學本科生從實驗目的、實驗設(shè)計、實驗安排、實驗實施等多個方面了解生物醫(yī)學科研如何由淺顯到深入的開展，對醫(yī)學本科生進行系統(tǒng)科研啟蒙。

2 實驗材料

2.1 質(zhì)粒和細胞株

真核熒光表達質(zhì)粒pEGFP-C1、慢病毒表達質(zhì)粒PLVX-PURO、慢病毒包裝質(zhì)粒psPAX2和pMD2.G、人腎上皮細胞系HEK293T和人非小細胞肺癌細胞系A(chǔ)549均來自武漢大學基礎(chǔ)醫(yī)學院基礎(chǔ)醫(yī)學實驗教學中心。

2.2 主要試劑

分子克隆所用超強高保真PCR試劑盒、DNA分子量標準品D2000 DNA marker和1 kb plus ladder、DNA產(chǎn)物純化試劑盒購自天根生化科技（北京）有限公司；內(nèi)切酶XmaI、XbalI和T4 DNA連接酶購自NEB。

細胞實驗所用的DMEM培養(yǎng)基、MEM培養(yǎng)基、胎牛血清、PBS、胰酶消化液購自Hyclone；脂質(zhì)體核酸轉(zhuǎn)染試劑購自翌圣生物科技（上海）股份有限公司。

2.3 主要儀器

二氧化碳培養(yǎng)箱（德國賓得）、倒置熒光顯微鏡（奧林巴斯）、激光共聚焦顯微鏡（奧林巴斯）、流式細胞儀（貝克曼Cytoflex）、小動物活體成像儀（美國BRUKER）。

3 實驗方法和結(jié)果

3.1 慢病毒GFP熒光載體構(gòu)建

慢病毒GFP熒光載體PLVX-Puro-GFP的質(zhì)粒結(jié)構(gòu)如圖2（a）所示。以pEGFP-C1質(zhì)粒為模板，使用引物GFP-FULL-XmaI-F和GFP-FULL-XbaI-R（見表1）擴增獲得GFP片段［見圖2（b）］；使用XmaI和XbaI雙酶切PCR擴增的GFP片段和PLVX-Puro質(zhì)粒，回收片段和質(zhì)粒后進行連接和轉(zhuǎn)化［見圖2（c）］。從轉(zhuǎn)化平板上隨機挑選3個單菌落小搖培養(yǎng)過夜后，以菌液為模板，使用引物GFP-F和GFP-R（見表1）進行PCR檢測，發(fā)現(xiàn)3個克隆中有2個能擴增出目標條帶，為GFP陽性克?。垡妶D2（d）］；將2個GFP陽性克隆提取質(zhì)粒，使用XmaI和XbaI雙酶切進行酶切鑒定，電泳檢測能觀察到載體片段和GFP插入片段［見圖2（e）］，進一步確認這2個克隆為陽性克隆。測序顯示插入的GFP片段序列完全正確，陽性克隆可用于后續(xù)實驗。

圖2 慢病毒GFP表達載體PLVX-Puro-GFP的構(gòu)建

表1 載體構(gòu)建所用引物

3.2 慢病毒穩(wěn)定轉(zhuǎn)化的A549-GFP熒光細胞系構(gòu)建

（1）細胞培養(yǎng)。HEK293T細胞培養(yǎng)于含有10%FBS的DMEM完全培養(yǎng)基中；A549培養(yǎng)于含有10%FBS的MEM完全培養(yǎng)基中。細胞培養(yǎng)于37℃、5%CO2的飽和濕度培養(yǎng)箱中，細胞融合度達到90%時使用胰酶消化液常規(guī)消化傳代。

（2）慢病毒包裝。使用慢病毒包裝質(zhì)粒psPAX2、pMD2.G和表達質(zhì)粒PLVX-Puro-GFP共同轉(zhuǎn)染293T細胞，轉(zhuǎn)染48 h后熒光顯微鏡下觀察GFP綠色熒光，發(fā)現(xiàn)大多數(shù)293T細胞中都能觀察到綠色GFP熒光信號，說明轉(zhuǎn)染效率較好，慢病毒包裝成功［見圖3（a）］。收集培養(yǎng)基，0.45 μm濾器過濾后即得慢病毒毒液。

圖3 穩(wěn)定轉(zhuǎn)化A549-GFP熒光細胞系的建立

（3）慢病毒感染A549細胞及藥物篩選。提前1

天將A549細胞轉(zhuǎn)入6孔板中培養(yǎng)，每孔加入0.5 mL

慢病毒毒液，感染24 h后更換含有嘌呤霉素的完全培養(yǎng)基進行藥物篩選和持續(xù)培養(yǎng)。傳代2次后進行檢測，激光共聚焦顯微鏡拍攝觀察發(fā)現(xiàn)絕大多數(shù)細胞都有GFP熒光［見圖3（b）］，流式細胞術(shù)檢測結(jié)果顯示97.5%的細胞為GPF陽性細胞［見圖3（c）］，說明篩選獲得的A549-GFP熒光細胞系純度很高，可以用于后續(xù)成瘤實驗。

3.3 A549-GFP細胞成瘤及活體熒光檢測

將A549-GFP細胞擴大培養(yǎng)后制成107／0.1 mL細胞懸液（PBS重懸），注射于4周齡裸鼠皮下。注射后7天左右即可觀察到皮下有腫瘤形成，培養(yǎng)3周后腫瘤明顯增大［見圖4（a）］。將麻醉后的成瘤裸鼠放置于小動物活體成像儀中進行檢測，在488 nm左右的激發(fā)光下，能觀察到強烈的熒光信號［見圖4（b）］。

圖4 活體檢測腫瘤熒光

4 結(jié) 語

本項目將熒光蛋白報告系統(tǒng)和慢病毒表達系統(tǒng)這兩項重要科研技術(shù)融合建立了一個小型綜合實驗，帶領(lǐng)醫(yī)學本科生從實驗目的、實驗設(shè)計、實驗安排、實驗實施等多個方面，真真切切了解生物醫(yī)學科研如何由淺顯到深入地開展，如何合理地設(shè)計和開展科研實驗，真切體會一個綜合實驗的完整實施歷程，培養(yǎng)本科生的科研素質(zhì)。

本綜合實驗中既有基因克隆、載體構(gòu)建等分子生物學實驗，又有細胞培養(yǎng)、瞬時轉(zhuǎn)染等細胞學實驗，還有慢病毒包裝、慢病毒收集、慢病毒感染等病毒學實驗，同時還設(shè)計了裸鼠成瘤及小動物活體觀察腫瘤熒光信號等動物學實驗，涉及激光共聚焦顯微鏡、流式細胞儀、小動物活體成像系統(tǒng)等大型儀器的操作使用，是一個融合了多種專業(yè)實驗技術(shù)和檢測手段的綜合實驗項目，既能面向醫(yī)學本科生作為系統(tǒng)科研的啟蒙，也能面向研究生作為科研技術(shù)培訓項目。