張慧心，于 麗

（山東中再生環(huán)境檢測有限公司，山東 濟(jì)南 250014）

1 丙酰蕓苔素內(nèi)酯及檢測方法

1.1 丙酰蕓苔素內(nèi)酯

20 世紀(jì)90 年代中期，日本科學(xué)家高津戶秀針對蕓苔素內(nèi)酯持效性進(jìn)行了研究并取得了一系列成果[1]。并通過對不同蕓苔素內(nèi)酯類似物的合成，于1996 年篩選出2 種具有持效特性的BRs 品種：化合物Ⅰ和TS303，結(jié)構(gòu)如圖1 所示。從新型蕓苔素內(nèi)酯的結(jié)構(gòu)看，2，3 羥基轉(zhuǎn)化為丙?；?，這一特性在植物體內(nèi)起到了延緩被酶降解的作用，因此達(dá)到使這兩類新蕓苔素內(nèi)酯持效期延長的目的。目前使用最為廣泛的持效蕓苔素內(nèi)酯為TS303，其由2，3 羥基?；?2，23 位的羥基氧化而成，具有活性高、持效期長、藥效釋放穩(wěn)定，提高植物抗逆、抗寒和抗旱，對作物增產(chǎn)效果顯著等特點(diǎn)[2]。

圖1 化合物I 和TS303 化學(xué)結(jié)構(gòu)

1.2 水樣中丙酰蕓苔素內(nèi)酯檢測方法研究

我國是植物生長調(diào)節(jié)劑的生產(chǎn)大國和使用大國，由于前期對植物生長調(diào)節(jié)劑監(jiān)管相對寬松，農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中所用到的含有植物生長調(diào)節(jié)劑類的農(nóng)藥，已經(jīng)開始逐漸富集到人類賴以生存的水環(huán)境中，植物生長激素通過雨水的沖刷匯集到河流，通過灌水的下滲匯集到地下河中，現(xiàn)已嚴(yán)重威脅到水環(huán)境的安全[3]。由于水環(huán)境中一般情況下所含有的化合物物質(zhì)種類較多且雜，而且不同性質(zhì)的水基質(zhì)效應(yīng)差異非常大，所以，通常情況下對水樣檢測不僅要求穩(wěn)定性要強(qiáng)，更重要的是靈敏度要高，從而對于水體檢測的前處理過程，不僅要有較好的富集效果，還要有較好的凈化效果。

2 實(shí)驗(yàn)部分

2.1 實(shí)驗(yàn)儀器

實(shí)驗(yàn)所涉及的儀器如表1 所示。

2.2 實(shí)驗(yàn)試劑及標(biāo)準(zhǔn)品

實(shí)驗(yàn)所涉及的試劑如表2 所示。

表2 實(shí)驗(yàn)試劑

標(biāo)準(zhǔn)儲備溶液的配制：準(zhǔn)確稱取約10 mg（精確至0.01 mg）的丙酰蕓苔素內(nèi)酯標(biāo)準(zhǔn)品于100 mL 容量瓶中，用二氯甲烷溶解、定容至刻度后搖勻備用。內(nèi)標(biāo)儲備溶液的配制：準(zhǔn)確稱取約10 mg 內(nèi)標(biāo)物于100mL 容量瓶，用二氯甲烷溶解，定容至刻度后搖勻備用。曲線標(biāo)準(zhǔn)溶液配制：將標(biāo)準(zhǔn)儲備溶液和內(nèi)標(biāo)儲備溶液1∶1 混合后以基質(zhì)空白逐級稀釋配制成一系列的曲線標(biāo)準(zhǔn)溶液。曲線標(biāo)準(zhǔn)溶液的質(zhì)量濃度水平為1、2、5、20、50 μg/mL，所有的標(biāo)準(zhǔn)溶液均儲存于4 ℃冰箱中，有效期為30 d。

2.3 樣品前處理

準(zhǔn)確量取100 mL 水樣，加入10 mL 甲醇及1 mL內(nèi)標(biāo)溶液，充分混勻。依次以10 mL 甲醇和10 mL 水活化C18 固相萃取小柱，活化速度為5 mL/min?；罨戤吅螅畼右?0 mL/min 流速通過C18 固相萃取小柱，上揚(yáng)完畢后再以10 mL 水淋洗。最后用10 mL 二氯甲烷將固相萃取小柱中的丙烯蕓苔素內(nèi)酯洗脫至50 mL 茄形瓶中進(jìn)行旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮。提取液在旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀器上以60 r/min 轉(zhuǎn)速，真空度200 hPa，40 ℃水浴中旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至近干，待SPE 凈化。濃縮后的提取液采用炭氨基小柱凈化，在小柱上裝填約2 g 無水硫酸鈉以去除可能的水分，以10 mL 二氯甲烷活化小柱，在液面消失前將平底燒瓶中的濃縮提取液以25 mL 二氯甲烷分3 次完全轉(zhuǎn)移至小柱上，收集所有凈化后的樣品溶液于50 mL 的茄型燒瓶中，以上述相同的旋蒸條件濃縮至近干后以1 mL 二氯甲烷稀釋，準(zhǔn)備進(jìn)行氣相定量測定。

2.4 氣相色譜分析

本方法采用氣相色譜內(nèi)標(biāo)法進(jìn)行定量分析，具體的儀器條件如表3 所示。

表3 色譜條件

3 結(jié)果與討論

3.1 萃取方式的選擇

目前水樣分析常用的提取方式有液液萃取和固相萃取法，本研究選取制備的加標(biāo)水樣，通過實(shí)驗(yàn)對上述兩種方法進(jìn)行了萃取對比實(shí)驗(yàn)，并在同一氣相條件下進(jìn)行檢測。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，固相萃取的提取效率高于液液萃取法，這可能是基于C18 固相萃取小柱對丙酰蕓苔素內(nèi)酯的吸附能力較強(qiáng)，使水樣在通過小柱丙酰蕓苔素內(nèi)酯能被很好的吸附，同時又在二氯甲烷洗脫下脫附。液液萃取的過程需要利用兩種物質(zhì)在不同溶劑中的分配系數(shù)差異，使丙酰蕓苔素內(nèi)酯從水相到萃取劑中，丙酰蕓苔素內(nèi)酯從結(jié)構(gòu)看有一定的水溶性也易溶解在有機(jī)溶劑中，因此液液萃取的過程有所損失。因此，本研究選用提取效率更高的固相萃取法對水樣中丙酰蕓苔素內(nèi)酯進(jìn)行提取。

3.2 洗脫溶劑的選擇及用量確定

丙酰蕓苔素內(nèi)酯易溶于大多數(shù)有機(jī)溶劑，實(shí)驗(yàn)過程中考察了甲醇、丙酮、二氯甲烷、正己烷對丙酰蕓苔素內(nèi)酯的洗脫效果，結(jié)果表明，二氯甲烷的洗脫能力最強(qiáng)。除了洗脫液的種類會對實(shí)驗(yàn)結(jié)果產(chǎn)生影響，洗脫液使用的體積不同也會影響洗脫能力。

3.3 固相萃取小柱的選擇及萃取方法確定

固相萃取包括液相和固相的物流萃取過程，固相對待測物的吸附力比溶解待測物的溶劑更大。當(dāng)樣品通過固相萃取小柱填料時，待測物會被吸附并濃縮在填料表面，其他組分則隨著流動相排出。由于丙酰蕓苔素內(nèi)酯結(jié)構(gòu)并非離子型，因此排除了離子交換性的固相萃取小柱。實(shí)驗(yàn)最后使用C18 小柱進(jìn)行研究，目標(biāo)物物在排出液中幾乎無法檢出，洗脫后的回收率90%以上，因此C18 固相萃取小柱被使用來萃取目標(biāo)物。

4 方法驗(yàn)證

4.1 方法的線性相關(guān)性

本研究采用氣相色譜內(nèi)標(biāo)法進(jìn)行定量，通過對不含丙酰蕓苔素內(nèi)酯的水空白樣品進(jìn)行前處理凈化后濃縮至近干的空白溶液中，加入丙酰蕓苔素內(nèi)酯及4.9041 μg內(nèi)標(biāo)，配置成1、2、5、20、50 μg/mL 的一系列基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行線性實(shí)驗(yàn)。進(jìn)行定量分析，以標(biāo)準(zhǔn)品與內(nèi)標(biāo)質(zhì)量比為橫坐標(biāo)，以標(biāo)準(zhǔn)品與內(nèi)標(biāo)峰面積比為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，見圖2。在水中丙酰蕓苔素內(nèi)酯質(zhì)量濃度為0.01 μg/mL～0.5 μg/mL 范圍內(nèi)，標(biāo)準(zhǔn)曲線的線性回歸良好，相關(guān)系數(shù)為0.999 5，回歸方程為y=0.889 9x-0.038 5。該方線性相關(guān)性實(shí)驗(yàn)結(jié)果見表4。

圖2 水樣中丙酰蕓苔素內(nèi)酯方法線性標(biāo)準(zhǔn)曲線圖

表4 水樣中丙酰蕓苔素內(nèi)酯方法線性相關(guān)性實(shí)驗(yàn)結(jié)果

4.2 方法的檢出限及定量限實(shí)驗(yàn)

方法檢出限的定義為方法檢出目標(biāo)物的最低濃度，方法的檢出限按照3 倍的噪音確定，以線性實(shí)驗(yàn)室每種農(nóng)產(chǎn)品空白加標(biāo)最低點(diǎn)0.1 μg/g 所對應(yīng)的響應(yīng)值進(jìn)行計(jì)算，最終檢出限折算至100 mL 樣品中，結(jié)果為0.005 μg/mL。

4.3 方法的精密度和準(zhǔn)確度

準(zhǔn)確稱取21 份不含丙酰蕓苔素內(nèi)酯的水空白樣品，將空白樣品分成3 組不同濃度水平，每個濃度水平7 個平行樣品的加標(biāo)回收率實(shí)驗(yàn)，添加水平分別為0.1、0.25、1 μg/g 來評估本方法的精密度和準(zhǔn)確度，結(jié)果如表5。

表5 葉面肥中丙酰蕓苔素內(nèi)酯精密度和準(zhǔn)確度實(shí)驗(yàn)結(jié)果

5 結(jié)論

本文開發(fā)并驗(yàn)證了一種對水樣中丙酰蕓苔素內(nèi)酯的前處理方法。該方法簡單、準(zhǔn)確且有效地提取、凈化后供后續(xù)氣相色譜內(nèi)標(biāo)法進(jìn)行定量分析。100 mL水樣加入10 mL 甲醇及1 mL 內(nèi)標(biāo)溶液后以C18 固相萃取小柱進(jìn)行萃取，再以二氯甲烷進(jìn)行洗脫，洗脫液通過濃縮凈化再濃縮后最終進(jìn)行定量分析。本方法的檢出限為0.005 μg/mL，定量限為0.01 μg/mL，精密度相對標(biāo)準(zhǔn)偏差為1.9%～2.7%之間，準(zhǔn)確度平均回收率為91.1%～93.2%。在水中丙酰蕓苔素內(nèi)酯含量在0.01 μg/g～0.5 μg/g 范圍內(nèi)，標(biāo)準(zhǔn)曲線的線性回歸良好，相關(guān)系數(shù)為0.999 5，回歸方程為y=0.889 9x-0.038 5。