仝明薇，李承瑤，康 杰，楊 勇

（1.山西醫(yī)科大學基礎(chǔ)醫(yī)學院，太原 030000；2.吉林大學動物醫(yī)學院 人獸共患病研究所，長春 130062；3.山西醫(yī)科大學汾陽學院科技中心，汾陽 032200）

現(xiàn)代生活飲食習慣，尤其是長期的高脂飲食（high fat diet，HFD），常導致肥胖等代謝疾病的出現(xiàn)[1]。當今，肥胖發(fā)病率在全球仍持續(xù)上漲，且仍然是成人和兒童健康的重要危害之一[2]。2021年8月，衛(wèi)健委新聞發(fā)布會上，有專家表示，在我國成人肥胖率可超50%，而在17歲以下青少年，此數(shù)值可達30%。調(diào)整飲食結(jié)構(gòu)、運動[3]、藥物治療[4]及手術(shù)減肥[5]是目前干預(yù)治療肥胖的主要方法，但主觀因素較大，難以持之以恒或存在某些不確定性和風險。因此，探尋能夠有效防治肥胖的安全、長效且副作用小的生物制劑將為肥胖防治提供一種新的策略，具有重要意義。

眾多流行病學分析和實驗研究表明，蠕蟲感染率和代謝綜合征發(fā)病率負性相關(guān)[6]，表明蠕蟲可能具有防治代謝性疾病的潛能。2012 年，發(fā)表于Nature Medicine的研究表明，血吸蟲糖蛋白及隨后被相繼報道的鉤蟲、絲蟲和多形螺旋線蟲等寄生蟲及其蟲體抗原，都可以抑制高脂誘導的胰島素抵抗和肥胖等代謝紊亂[7-10]。以上研究也證明了，蠕蟲具有防治代謝疾病的潛能。

旋毛蟲（Trichinella.spp.）是一種寄生性蠕蟲，其感染所致的旋毛蟲病，人獸共患，危害嚴重[11-12]。那么旋毛蟲是否可以像上述蠕蟲一樣具有防治代謝性疾病的潛能，目前還未可知。因此，我們擬用HFD構(gòu)建肥胖小鼠模型，探查旋毛蟲感染對模型小鼠的干預(yù)作用，并初步分析其作用機制，為防治代謝性疾病提供新策略，并可望為后續(xù)開發(fā)寄生蟲免疫調(diào)節(jié)分子作為新型生物制劑奠定理論基礎(chǔ)，具有重要的基礎(chǔ)和應(yīng)用價值。

1 材料與方法

1.1 飼料及主要試劑 基礎(chǔ)及高脂飼料購于南通特洛菲飼料科技有限公司；油紅O染液購于北京solarbio科技有限公司；TransScript?One-Step gDNA Removal and cDNA Synthesis SuperMixgu購于北京TransGen Biotech股份有限公司。

1.2 動物飲食及分組 30只，4周齡雄性C57BL/6J小鼠購于長春生物制品所。環(huán)境適應(yīng)7 d后，分為兩組：ND組，10 只，飼喂基礎(chǔ)飼料；HFD組，20 只，飼喂高脂飼料。

1.3 旋毛蟲感染 旋毛蟲保種及肌幼蟲分離參考文獻[13]。小鼠飼喂4周后，HFD組小鼠口服感染250條肌肉蟲期旋毛蟲（HFD+inf 組，n=10），同時設(shè)立未感染對照，繼續(xù)飼喂8 周。實驗設(shè)計如圖1A所示。

1.4 體重、肝重及脂肪重量 小鼠每周稱重，飼喂末期，禁食12 h，眼球取血，同時分離肝臟及附睪脂肪組織。參考文獻[14]，稱量肝臟及附睪脂肪濕重并計算相應(yīng)器官組織指數(shù)。

1.5 血清中脂類生化指標檢測 將收集的血液于4℃、3500×g離心15 min，獲取血清，利用全自動生化儀檢測血清總膽固醇（Total Cholesterol，TC）和甘油三酯Triglyceride（TG）的含量。

1.6 HE染色 新鮮獲取的肝臟及附睪脂肪組織，經(jīng)4%多聚甲醛固定，隨后常規(guī)脫水及二甲苯透明，常規(guī)石蠟包埋、切片及HE染色鏡下觀察各組織的病理學表現(xiàn)。

1.7 油紅O染色 厚度約為15 μm的肝臟冰凍切片，經(jīng)60%異丙醇固定后，用油紅O染液染色10～15 min，再經(jīng)60%異丙醇分色，蘇木素復(fù)染2 min后，分色、封片，鏡下觀察肝細胞內(nèi)的脂滴沉積程度。

1.8 脂肪組織中脂代謝相關(guān)基因檢測 參考說明書操作，采用Trizol法提取附睪脂肪組織總RNA。隨即參考TransScript?One-Step gDNA Removal and cDNA Synthesis SuperMix說明書操作步驟，對總RNA進行反轉(zhuǎn)錄。

利用表1中引物，參考相應(yīng)退火溫度，將上述所得的cDNA利用qRT-PCR方法，檢測相應(yīng)附睪脂肪組織中脂代謝基因的表達情況。

表 1 qRT-PCR檢測所需引物序列Table 1 Primer sequences of qRT-PCR detection

1.9 數(shù)據(jù)處理 利用GraphPad prism5.0軟件進行結(jié)果分析，*P＜0.05，**P＜0.01，***P＜ 0.001。體重數(shù)據(jù)分析中，ND與HFD組相比，#P＜0.05，##P＜0.01，###P＜ 0.001；HFD與HFD+inf組相比，*P＜0.05，**P＜0.01，***P＜ 0.001。

2 結(jié)果

2.1 旋毛蟲干預(yù)對小鼠體重和表觀肥胖的作用 感染旋毛蟲后，小鼠無運動障礙、呼吸困難、食欲減退、拉稀等臨床癥狀，與未感染組無明顯差別，與先前的報道一致[15]。解剖后發(fā)現(xiàn)，感染組小鼠腸道無明顯炎癥反應(yīng)。對小鼠膈肌壓片鏡檢查發(fā)現(xiàn)肌幼蟲卷曲成團，包囊完全形成，肌肉結(jié)構(gòu)與正常組相似，表明旋毛蟲在小鼠體內(nèi)發(fā)育完全，成功建立感染。在此基礎(chǔ)上，我們進一步分析旋毛蟲感染對高脂誘導的肥胖的干預(yù)效果。

在實驗周期內(nèi)相比于對照組，HFD和HFD+inf組小鼠體重增長速率較快（圖1B）。在高脂飼喂的第3周，ND與HFD兩組小鼠體重存在極顯著差異（P＜0.001），且差異性持續(xù)至實驗?zāi)┢?。旋毛蟲感染后2 周（即高脂飼喂第6周），與HFD組相比，HFD+inf組小鼠體重增長開始減緩，于感染后第5周（高脂飼喂9周），兩組小鼠體重增加存在極顯著差異（P＜0.01）（圖1C），直至感染后第7周（高脂飼喂11周），HFD+inf組比HFD組小鼠體重下降4.65%（P＜0.05）（圖1B），在實驗?zāi)┢谝部捎^察到各組小鼠外觀肥胖度上的明顯差異（圖1D）。說明，旋毛蟲干預(yù)能夠緩解高脂飲食肥胖小鼠的體重增加。

圖 1 旋毛蟲干預(yù)對小鼠體重的作用Fig.1 The effect of Trichinella spiralis on body weight in mice

2.2 旋毛蟲干預(yù)對小鼠肝指數(shù)和附睪脂肪指數(shù)的作用HFD組小鼠肝重較ND組升高了1.19倍（P＜0.05），但肝指數(shù)卻顯著降低（P＜0.01），（圖2A、2B），或許是由于高脂飲食所致體重增加顯著高于肝重增加引起的。而與高脂組比，HFD+inf組肝重及肝指數(shù)雖無顯著性變化，但均呈下降趨勢，表明旋毛蟲感染可以降低高脂飲食小鼠的肝臟脂肪堆積，具有減輕肥胖小鼠肝臟損傷的潛能。與ND組比，HFD組小鼠附睪脂肪的重量和脂肪指數(shù)都明顯增加（P＜0.001）（圖2C、2D），可能是因為高脂飲食造成的體內(nèi)白色脂肪堆積，而旋毛蟲感染可以明顯降低高脂誘導的小鼠附睪脂肪的重量和相應(yīng)指數(shù)。機體脂肪過度累積被認為是導致肥胖的關(guān)鍵元素之一[16]。因此，旋毛蟲感染可以通過降低機體白色脂肪蓄積，減輕肝臟損傷，進而緩解肥胖發(fā)生發(fā)展。

圖2 旋毛蟲干預(yù)對小鼠肝臟指數(shù)和附睪脂肪指數(shù)的作用Fig.2 The effect of Trichinella spiralis on liver index and epididymal fat index in mice

2.3 旋毛蟲干預(yù)對小鼠血脂水平的作用 HFD組血清TC和TG含量顯著升高（P＜0.01或P＜0.05），而旋毛蟲干預(yù)后TC水平顯著降低（P＜0.05），TG水平也有減少趨勢，表明旋毛蟲感染對高脂肥胖小鼠的血脂代謝紊亂具有某種程度的拮抗作用，見圖3。

圖3 旋毛蟲干預(yù)對血清脂質(zhì)水平的作用Fig.3 The effect of Trichinella spiralis on the level of serum lipids in mice

2.4 附睪脂肪組織HE染色分析 慢性營養(yǎng)過量常引起脂肪細胞不健康的擴張。在我們的研究中也可見，HFD導致附睪脂肪細胞體積變大，而旋毛蟲感染后HFD+inf組小鼠的附睪脂肪細胞體積有所下降（圖4），表明旋毛蟲感染能夠拮抗HFD引起的脂肪組織中脂質(zhì)堆積，進而調(diào)控肥胖。

圖4 附睪脂肪組織HE染色（200 x）Fig.4 Hematoxylin-eosin staining of epididymal fat (200 x)

2.5 肝臟組織油紅O染色分析 相比于ND組，HFD組肝組織中有大量紅色脂滴聚集，表明長期高脂飲食會誘導肝臟損傷，出現(xiàn)脂肪變性病變特征。而HFD+inf組相比于HFD組，其肝臟組織中脂滴數(shù)量減少，大小有所下降，表明旋毛蟲感染能夠緩解高脂誘導的肝臟脂質(zhì)聚集，降低肝臟脂質(zhì)變性的風險（圖5）。

圖5 肝臟油紅O染色（200 x）Fig.5 Oil-red staining of liver (200 x)

2.6 旋毛蟲干預(yù)對附睪脂肪代謝相關(guān)基因表達的作用 機體脂肪過度累積導致肥胖，為了探查旋毛蟲感染對肥胖小鼠脂肪代謝的干預(yù)作用，我們對旋毛蟲干預(yù)末期，附睪脂肪中脂代謝基因表達變化情況進行了調(diào)查。由圖6可見，相比于ND組，HFD組中參與脂質(zhì)合成的相關(guān)基因，脂肪酸合成酶（Fatty Acid Synthase, FAS）和過氧化物酶激活物受體γ（Peroxisome Proliferators-Activated Receptors-γ,PPAR-γ）mRNA的表達顯著升高（P＜0.01或P＜0.001），而在旋毛蟲感染后又顯著降低（P＜0.01或P＜0.001）。

圖6 旋毛蟲干預(yù)對附睪脂肪組織脂代謝相關(guān)基因表達水平的作用Fig.6 The effect of Trichinella spiralis infection on the expression levels of genes associated with lipid metabolism in mice

相反，相比于ND組，HFD組附睪脂肪組織中參與脂質(zhì)分解的相關(guān)基因，脂蛋白脂肪酶（Lipoprotein Lipase, LPL）、激素敏感性脂肪酶（Hormonesensitive Lipase, HSL）和過氧化物酶激活物受體α（Peroxisome Proliferators-Activated Receptors-α，PPAR-α）的表達顯著下降（P＜0.01），而在旋毛蟲感染后LPL和HSL的表達明顯下降（P＜0.05），PPAR-α的表達也有增多趨勢，表明旋毛蟲干預(yù)能夠促進高脂肥胖小鼠的脂質(zhì)分解。

3 討論

肥胖及其并發(fā)癥是全球性社會公共健康的重要威脅，然而防治肥胖的方法非常有限。我們以HFD小鼠為模型，探查了旋毛蟲感染對肥胖小鼠的干預(yù)作用。實驗結(jié)果表明，旋毛蟲感染可以降低肥胖小鼠的體重增加，抑制小鼠血清中脂質(zhì)的升高和附睪脂肪的脂質(zhì)累積，并改善肝臟脂質(zhì)變性的癥狀。此外，旋毛蟲感染可有效降低肥胖小鼠的肝臟質(zhì)量增加，改善肝臟脂質(zhì)變性的癥狀。

Kang等[17]發(fā)表了相似研究成果，但研究設(shè)計有所不同，他們在小鼠感染旋毛蟲數(shù)周后再進行高脂飼喂，進而探究旋毛蟲感染對肥胖小鼠的預(yù)防作用，并發(fā)現(xiàn)了與本研究一致的研究結(jié)果，進一步說明了旋毛蟲感染對高脂飼喂誘導的小鼠體重增加具有一定的改善作用，對防治肥胖具有積極作用。

FAS和PPAR-γ是介導脂質(zhì)合成的重要酶或轉(zhuǎn)錄調(diào)控基因。與先前的研究一致[17]，我們也發(fā)現(xiàn)，在高脂誘導的小鼠中，F(xiàn)AS和PPAR-γ mRNA的轉(zhuǎn)錄水平明顯下降，說明旋毛蟲感染可以降低高脂肥胖小鼠的脂肪酸合成速率，抑制脂肪合成。PPAR-γ除了調(diào)節(jié)脂質(zhì)代謝外，在免疫應(yīng)答調(diào)控中也占據(jù)重要地位。研究已表明，其可以通過抑制脂肪組織中的T淋巴細胞浸潤或誘導巨噬細胞可替代極化從而改善高脂誘導小鼠的葡萄糖代謝平衡[18]。旋毛蟲感染可以調(diào)節(jié)肥胖小鼠的葡糖代謝紊亂[17]，那么是否其可以以PPAR-γ為靶標，調(diào)節(jié)機體免疫應(yīng)答來執(zhí)行這一功能需要更深入的調(diào)查。LPL、HSL和PPAR-α是調(diào)控脂肪酸分解代謝的關(guān)鍵酶或轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子[19-20]，在調(diào)節(jié)TG水解及脂肪酸氧化中占據(jù)著關(guān)鍵地位。我們研究發(fā)現(xiàn)，旋毛蟲感染可以下調(diào)這些基因的表達，表明旋毛蟲感染可以促進白色脂肪組織的脂解。以上結(jié)果表明，旋毛蟲可以通調(diào)節(jié)脂質(zhì)代謝有效干預(yù)肥胖，但具體的機制尚未闡明。

腸道蠕蟲及其免疫調(diào)節(jié)分子可誘導Th2免疫反應(yīng)和調(diào)節(jié)性T細胞的表達，反向調(diào)節(jié)Th1/Th17免疫，這一典型特點可以有效的干預(yù)各種自身免疫性疾病，如IBD、關(guān)節(jié)炎、糖尿病等[21]。肥胖是一個促炎細胞因子表達明顯升高的慢性低度性炎癥，肥胖性炎癥反應(yīng)與代謝穩(wěn)態(tài)的破壞密切相關(guān)，因此被認為是有效干預(yù)肥胖的重要靶點。研究表明IL-4能增加小鼠的能量消耗和脂肪分解，而阻斷TNF受體介導的信號傳導可預(yù)防大鼠肥胖[22]。最近的研究發(fā)現(xiàn)，重組IL-27干預(yù)可明顯緩解肥胖小鼠體重增加[23]，表明其具有治療肥胖的潛力。在研究線蟲感染對肥胖的干預(yù)作用時也發(fā)現(xiàn)，IL-13/stat6信號通路在巴西鉤蟲抑制高脂誘導的體重增加中發(fā)揮著重要的作用[24]。那么，旋毛蟲是否可以通過調(diào)節(jié)免疫反應(yīng)影響宿主代謝平衡，從而改善高脂誘導的肥胖需要進一步的研究。綜合以上結(jié)果表明，旋毛蟲感染可以有效改善高脂飲食誘導的肥胖，其可能是通過抑制機體脂質(zhì)累積和加速脂質(zhì)分解發(fā)揮作用，因此旋毛蟲及其免疫調(diào)節(jié)分子可為防治肥胖及其它代謝紊亂相關(guān)疾病提供一種潛在途徑。需要指出的是，寄生蟲治療方式也存在一些弊端，如患者對該對治療方案的心理負擔及出現(xiàn)胃腸不良反應(yīng)等。近年來蠕蟲的免疫調(diào)節(jié)分子對免疫相關(guān)疾病的干預(yù)顯示出了良好的效果，其安全性與可控性方面均顯現(xiàn)優(yōu)勢。因此，蠕蟲免疫調(diào)節(jié)分子的篩選與開發(fā)利用是今后發(fā)展蠕蟲有效干預(yù)代謝性疾病的核心方向。