何 靜，楊珊珊，黃明月，張 倩，洪 煬，林矯矯，柏 熊，謝建蕓，傅志強

（1.中國農(nóng)業(yè)科學院上海獸醫(yī)研究所 農(nóng)業(yè)農(nóng)村部動物寄生蟲學重點開放實驗室，上海 200241；2.上海實驗動物研究中心，上海 201203）

東方田鼠（Microtus fortis）屬倉鼠科，田鼠亞科，田鼠屬[1]，在我國主要分布在東北、西北、黃河流域、長江流域和浙江、福建等地，是分布地的重要鼠種。東方田鼠是我國迄今為止發(fā)現(xiàn)的唯一一種具有天然抗日本血吸蟲病特征的哺乳動物。上世紀五六十年代，我國在血吸蟲病流行地區(qū)調(diào)查的39種哺乳動物中，唯有東方田鼠體內(nèi)未找到日本血吸蟲成蟲或蟲卵，流行病學調(diào)查和人工感染試驗均證明其對日本血吸蟲具有天然抗性，且這種抗性能穩(wěn)定遺傳[2-3]。東方田鼠抗血吸蟲病機制研究可為血吸蟲病的防治技術(shù)研究提供線索。

巨噬細胞來源于骨髓，在機體各部分分布廣泛，是機體免疫系統(tǒng)的重要細胞成分，在抗感染、抗腫瘤和免疫調(diào)節(jié)中起著非常的重要作用。在固有免疫和適應(yīng)性免疫反應(yīng)中巨噬細胞起著關(guān)鍵性的作用，是炎性反應(yīng)的主要調(diào)節(jié)細胞。當宿主發(fā)生病原體感染后，巨噬細胞在有效清除病原體方面起了關(guān)鍵的作用[4]。Chung等[5]研究表明，在體外培養(yǎng)體系中小鼠腹腔巨噬細胞依賴于抗體對曼氏血吸蟲具有較大的殺傷作用。本文報告了一種東方田鼠腹腔巨噬細胞體外分離培養(yǎng)與鑒定的方法，為研究東方田鼠巨噬細胞對日本血吸蟲殺傷作用提供一種簡便可行的實驗方案。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 8周齡雄性東方田鼠來自由上海實驗動物研究中心維持的封閉群，8周齡雄性KM鼠購自購于上海斯萊克實驗動物有限責任公司；DMEM培養(yǎng)基購自Gibco公司；胎牛血清購自Hycolon公司；、HE染液、印度墨汁、酸性磷酸酶染液、α-醋酸奈酚酯酶染液等購自少辛生物有限公司。

1.2 巨噬細胞的分離與培養(yǎng) 8周齡東方田鼠麻醉后眼眶采血處死，用75%酒精浸泡消毒5 min，先去除東方田鼠胸腹部表皮以完全暴露腹部肌層，再用眼科鑷提起腹膜，用5 mL注射器向腹腔內(nèi)注射5 mL預(yù)冷的無血清DMEM培養(yǎng)液和1 mL空氣，注意進針勿過深，不要損傷內(nèi)臟及血管?？焖偎秸袷? min，靜置5 min，觀察腸管變扁且腹腔液為淡黃色時，然后用鑷子提起腹膜用注射器刺入腹腔，吸取腹腔灌洗液。無菌條件下在腹膜上剪一小口，用1 mL PBS重復(fù)灌洗2次。將回收的腹腔灌洗液置于離心管于1000 ×g、4℃離心5 min。用常規(guī)DMEM培養(yǎng)液（含10%胎牛血清、青霉素100 U/mL、鏈霉素100 μg/mL）調(diào)整細胞至所需濃度，接種于培養(yǎng)瓶或置有無菌蓋玻片的6孔板內(nèi)，置于37、5%CO2培養(yǎng)箱中，培養(yǎng)12 h后換液，去除未貼壁細胞。用KM鼠同樣進行腹腔巨噬細胞的分離培養(yǎng)，作為參考和比較。

1.3 細胞形態(tài)觀察 細胞培養(yǎng)后每日用顯微鏡觀察細胞形態(tài)變化及生長狀況。并擇時將培養(yǎng)細胞經(jīng)PBS沖洗后，用甲醛固定，常規(guī)HE染色，中性樹膠封片。用顯微鏡觀察并記錄圖像。

1.4 細胞吞噬功能檢測 細胞培養(yǎng)3 d后用印度墨汁進行吞噬功能檢測。在培養(yǎng)孔中加入10%印度墨汁50 μL，放回培養(yǎng)箱中孵育3 h后取出蓋玻片，PBS沖洗，甲醛固定，甘油明膠封片。顯微觀察胞漿中吞有墨粒3個以上的為陽性細胞，鏡下計數(shù)200個細胞并計算吞噬細胞陽性率。

1.5 酸性磷酸酶染色 將培養(yǎng)5 d的細胞經(jīng)PBS沖洗后，甲醛固定，用Gomori酸性磷酸酶（Acid phosphatase, ACP）硫化鉛法染色，甘油明膠封片[6]。顯微觀察酶活性部位為棕黃色或棕黑色顆粒，定位于細胞胞漿中。光鏡下每張載片計數(shù)200個細胞并計算陽性率。

1.6 α-醋酸奈酚酯酶染色（α-ANE） 培養(yǎng)3 d的細胞經(jīng)PBS沖洗后，冷甲醛-丙酮緩沖液固定，α-醋酸奈酚酯酶染色法染色，甲綠復(fù)染，甘油明膠封片[6]。酶活性部位為彌漫性紅棕色產(chǎn)物，定位于細胞胞漿中，胞核為綠色。光鏡下每張載片計數(shù)200個細胞并計算陽性率。

2 結(jié)果

2.1 巨噬細胞形態(tài)觀察 東方田鼠腹腔巨噬細胞培養(yǎng)明場觀察可見細胞核明顯，胞質(zhì)較豐富，活躍時內(nèi)含有顆?；蚩张?。具有變形運動和吞噬能力，細胞形狀不一，外周多突起及偽足（圖1）。HE染色后可見細胞呈圓形、橢圓形、三角形或不規(guī)則形，有偽足和突起，界限清楚。核大為卵圓形、腎形、馬蹄型或不規(guī)則形，偏居于細胞的一端，著色較深（圖2）。東方田鼠腹腔巨噬細胞和KM鼠在外觀形態(tài)上相似。

圖1 巨噬細胞明場下觀察Fig.1 Macrophage observation under bright field

圖2 巨噬細胞的HE染色觀察Fig.2 HE staining of macrophages

2.2 巨噬細胞的吞噬功能 將分離培養(yǎng)腹腔巨噬細胞加印度墨汁培養(yǎng)3 h后可見其吞噬功能被激活，培養(yǎng)細胞的胞質(zhì)及偽足和突起均有密集的墨汁顆粒，吞噬率為98%，顯示東方田鼠具有較強的吞噬功能。同樣處理的KM小鼠腹腔巨噬細胞的吞噬也較強，兩者無明顯差異（圖3）。

圖3 巨噬細胞的墨汁吞噬試驗Fig.3 Ink Phagocytosis test of macrophages

2.3 巨噬細胞的酸性磷酸酶表達 將培養(yǎng)5 d的巨噬細胞制備細胞爬片，酸性磷酸酶染色后可見東方田鼠巨噬細胞的胞漿內(nèi)有大量的棕黑色顆粒，陽性率為98%；KM小鼠巨噬細胞胞漿的著色程度和東方田鼠類似（圖4）。

圖4 ACP染色觀察巨噬細胞的酸性磷酸酶表達Fig.4 ACP staining to observe the expression of acid phosphatase in macrophages

2.4 巨噬細胞的非特異性酯酶表達 細胞培養(yǎng)3 d后經(jīng)α-醋酸奈酚酯酶染色顯示，大部分細胞的胞質(zhì)呈藍色，為強陽性細胞，少部分細胞的胞質(zhì)呈略淺的紅棕色，東方田鼠巨噬細胞陽性率為98%，染色后KM鼠的巨噬細胞非特異性酯酶的表達和東方田鼠相似（圖5）。

圖5 α-ANE染色觀察巨噬細胞的非特異性酯酶表達Fig.5 α-ANE staining to observe non-specific esterase expression in macrophages

3 討論

東方田鼠是我國唯一對日本血吸蟲病具有天然抗性的哺乳動物。東方田鼠體中的日本血吸蟲先后移行經(jīng)過皮膚、肺臟和肝臟等器官，最終在肝臟中消亡[7]。東方田鼠抗日本血吸蟲病機制可能涉及多種因素，但無疑免疫機制是令人關(guān)注的。一些研究結(jié)果表明東方田鼠的抗性可能與其補體活性相關(guān)[7-9]，也有報告觀察了東方田鼠血細胞在其感染過程中的表現(xiàn)[10-11]。孫軍等[12]應(yīng)用基因表達譜研究的結(jié)果表明，感染后東方田鼠肺肝組織中非特異性免疫和特異性免疫相關(guān)基因表達活躍。Jiang等[13]進一步研究表明東方田鼠感染后與免疫相關(guān)的基因表達上調(diào)，其中包括補體和Fc受體等。Hu等[14]應(yīng)用RNAseq分析顯示大量與免疫相關(guān)的基因差異表達與感染相關(guān)，推測固有免疫與適應(yīng)性免疫反應(yīng)在殺傷血吸蟲過程中起重要作用。Han等[15]研究結(jié)果表明東方田鼠感染后表達差異的miRNAs主要與免疫調(diào)節(jié)和營養(yǎng)代謝相關(guān)。

天然免疫細胞在先天免疫反應(yīng)中起到重要作用并且還可以通過分泌細胞因子來調(diào)節(jié)適應(yīng)性免疫反應(yīng)[16]。巨噬細胞是重要的天然免疫細胞，對血吸蟲具有殺傷作用[5]。王慶林等[11]觀察到感染日本血吸蟲后3～16 d，東方田鼠血液嗜酸性粒細胞具有趨化性和粗大的嗜酸性顆粒，其中含有過氧化物酶和酸性磷酸酶，可以有效殺死寄生蟲。劉金明等[17]在體外培養(yǎng)中觀察到東方田鼠巨噬細胞能黏附在日本血吸蟲童蟲表面，但所用的巨噬細胞是經(jīng)石蠟油刺激后獲得，獲得量大但功能特性上可能與原始巨噬細胞差異較大。本文在此基礎(chǔ)上進行改進應(yīng)用快速振蕩法分離腹腔巨噬細胞，簡單易行，數(shù)量足夠后續(xù)實驗用，在形態(tài)上與其它物種并無差異。HE染色和墨汁吞噬試驗結(jié)果表明，細胞純度和均一性較好，細胞的吞噬活性很高。酸性磷酸酶和特異性酯酶是溶酶體酶，是巨噬細胞執(zhí)行其生物學功能的重要分子，也是巨噬細胞的標志酶。本研究結(jié)果顯示，東方田鼠腹腔巨噬細胞的酸性磷酸酶和非特異性酯酶的表達和KM鼠類似，但其對血吸蟲是否有殺傷效應(yīng)和在抗性機制中的作用有待于進一步研究。

本文應(yīng)用振蕩法分離培養(yǎng)東方田鼠腹腔巨噬細胞，操作簡便，細胞形態(tài)、吞噬活性和酶活性等較好，為研究巨噬細胞在東方田鼠抗性機制中的作用提供了基礎(chǔ)。