余水蘭，趙其平，朱順海，黃 兵，韓紅玉，于 鈺,2，梁珊珊,2，王青杰，王海霞，董 輝

（1.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院上海獸醫(yī)研究所 農(nóng)業(yè)農(nóng)村部動物寄生蟲學(xué)重點實驗室，上海 200241；2.上海師范大學(xué)生命與環(huán)境科學(xué)學(xué)院，上海 200234）

球蟲病是一種由艾美耳球蟲（Eimeriaspp.）寄生在腸道所引起的傳染性疾病，嚴(yán)重?fù)p害全球養(yǎng)雞業(yè)的經(jīng)濟(jì)利益[1-2]。抗球蟲藥物的使用是當(dāng)前球蟲病的防治主要途徑之一[3-4]。但由于球蟲耐藥性的產(chǎn)生以及人們對藥物殘留和環(huán)境保護(hù)等公共衛(wèi)生安全問題的日益關(guān)注，迫切需要免疫預(yù)防替代藥物成為球蟲病控制的主導(dǎo)途徑[5]。實踐證明，球蟲卵囊具有良好的免疫原性，能夠刺激機(jī)體產(chǎn)生細(xì)胞免疫反應(yīng)和體液免疫反應(yīng)[6]，可制成活疫苗免疫預(yù)防球蟲病，減少死亡率[7]。目前，由早熟株卵囊組成的減毒活疫苗是應(yīng)用最廣泛的球蟲病疫苗[8]。但球蟲病活疫苗也存在明顯的不足：活疫苗通常接種3～7日齡雛雞，依靠產(chǎn)生的卵囊后代經(jīng)2～3次重復(fù)感染而獲得良好的免疫力，在此過程中雞可能會出現(xiàn)生長減緩、增重減少等不良反應(yīng)，影響生產(chǎn)性能[9]。而已有研究發(fā)現(xiàn)免疫增強(qiáng)劑與球蟲活疫苗聯(lián)用不但可以增強(qiáng)雛雞的免疫效果，同時也可以降低接種疫苗帶來的不良影響[10-11]。據(jù)文獻(xiàn)報道，通過口服或腹腔注射左旋咪唑均可明顯增強(qiáng)雞球蟲疫苗的免疫效果[10-12]。然而已有的研究中左旋咪唑的使用方法較為復(fù)雜或使用周期長，成本較高。本文擬研究單次口服化學(xué)合成小分子免疫增強(qiáng)劑——左旋咪唑（Levamisole）對柔嫩艾美耳球蟲（E.tenella）免疫增強(qiáng)效果和免疫雞增重的影響，為評估左旋咪唑作為球蟲病活疫苗的免疫增強(qiáng)劑提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗試劑和蟲株 鹽酸左旋咪唑（Levamisole hydrochloride）由南京鯨輪制藥有限公司惠贈，規(guī)格：25 kg/桶，產(chǎn)品批號：LV19007。分別按照每公斤體重1、2、4 mg鹽酸左旋咪唑來設(shè)置低、中、高三個劑量組，按3日齡雛雞體重約為50 g計算，低、中、高劑量分別為每只雞0.05、0.1 mg和0.2 mg。稱取適量鹽酸左旋咪唑樣品溶于水中，制成濃度分別0.1、0.20、0.40 mg/mL，每只雞經(jīng)口灌服0.5 mL。

免疫用蟲株為柔嫩艾美耳球蟲上海株早熟系，攻蟲用蟲株為柔嫩艾美耳球蟲上海株，均由中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院上海獸醫(yī)研究動物原蟲創(chuàng)新團(tuán)隊保存。所用卵囊的保存期不長于3個月。

1.2 籠養(yǎng)試驗評價左旋咪唑的效果

1.2.1 試驗方法 選取60只體重相近的3日齡三黃雞，隨機(jī)均分為6組，飼養(yǎng)于單獨的籠子內(nèi)，其中第1、2、3組每只雞分別先經(jīng)口灌服0.05、0.10、0.20 mg的鹽酸左旋咪唑，再接種1000個柔嫩艾美耳球蟲早熟株卵囊；第4組每只雞接種1000個柔嫩艾美耳球蟲早熟株卵囊（無佐劑免疫組）；第5、6組為不免疫組。10日齡第1～4組進(jìn)行第二次免疫，每只雞接種1000個柔嫩艾美耳球蟲早熟株卵囊。二免后7 d，除了第6組（健康組）之外，其余各組每只雞灌服5×104個柔嫩艾美耳球蟲上海株（強(qiáng)毒株）卵囊。攻蟲后7 d，稱重、剖殺。

1.2.2 主要觀測指標(biāo) 包括：①臨床癥狀：記錄試驗期間各組雞的血便、死亡情況。②體重：一免疫后7 d、二免后7 d以及攻蟲后7 d分別對所有的雞進(jìn)行稱重，算出各組免疫期間的體重和攻蟲期間增重。③卵囊產(chǎn)量：攻蟲后第6～7 d，收集各組糞便，進(jìn)行卵囊OPG計數(shù)，算出各組平均每只雞的卵囊產(chǎn)量。④腸道病變記分：攻蟲后7 d，取各組盲腸，參照J(rèn)ohnson等[13]的方法進(jìn)行病變記分。⑤抗球蟲指數(shù)（Anticoccidial index, ACI）：根據(jù)公式ACI=（相對存活率+相對增重率）-（病變值+卵囊值）計算各組的ACI，評判標(biāo)準(zhǔn)參考文獻(xiàn)[14]，即ACI＞160、160≤ ACI ≥ 120、ACI＜120分別表示高效、部分、無抗球蟲效果。⑥血清抗體效價：一免疫后7 d、二免后7 d以及攻蟲后7 d，分別從每組中隨機(jī)挑選3只雞采血，利用ELISA方法檢血清抗體效價。方法為：將5 μg/mL的柔嫩艾美耳球蟲孢子化卵囊抗原包被于96孔板上，與雞血清孵育（1∶200）后，以Anti-Chicken IgY（IgG）（whole molecule）-Peroxidase antibody produced in rabbit（Sigma）作為二抗進(jìn)行孵育，以TMB為底物進(jìn)行顯色，在450 nm處讀取OD值。

1.3 平養(yǎng)試驗評價左旋咪唑的效果 根據(jù)籠養(yǎng)試驗的結(jié)果，選取具有較好免疫增強(qiáng)和促生長作用的2個左旋咪唑劑量（0.05 mg和0.10 mg）進(jìn)行平養(yǎng)試驗，以進(jìn)一步確認(rèn)其效果。

1.3.1 試驗方法 150只剛出殼三黃雞，隨機(jī)分為5組，每組30只，平養(yǎng)于墊有木屑的房間里，飼喂無抗球蟲藥物的飼料，自由采食和飲水。3日齡時，第1、2組每只雞分別先經(jīng)口灌服0.05、0.10 mg的鹽酸左旋咪唑，再接種600個柔嫩艾美耳球蟲早熟株卵囊，即左旋咪唑處理組（分別記為LEV1、LEV2）；第3組每只雞接種600個柔嫩艾美耳球蟲早熟株卵囊，即無佐劑免疫組（VAC）；第4、5組為不免疫組，分別為不免疫感染組（INF）和健康組（CON）。免疫后第21 d，各組隨機(jī)選取12只雞，除了第5組之外，其余各組每只雞灌服5×104個柔嫩艾美耳球蟲上海株（強(qiáng)毒株）卵囊。攻蟲后7 d，稱重、剖殺。

1.3.2 主要觀測指標(biāo) 包括：①體重：免疫后第7、14、21 d以及攻蟲后7 d分別對所有的雞進(jìn)行稱重，計算出各組免疫期間的體重和攻蟲期間增重。②臨床癥狀、卵囊產(chǎn)量、腸道病變記分、抗球蟲指數(shù)等指標(biāo)的方法參照1.2.2。③血清細(xì)胞因子水平：免疫后第7、14、21 d以及攻蟲后7 d，分別從每組中隨機(jī)選取3只雞采血，利用ELISA檢測雞血清中的CD4、CD8分子及細(xì)胞因子TNF-α水平，所用試劑盒為Chicken Cluster of Differentiation 4（CD4）或8（CD8）ELISA Kit和 Chicken tumor Necrosis Factor α（TNF-α）ELISA Kit，均購自mlBio公司，檢測方法根據(jù)說明書進(jìn)行。數(shù)據(jù)結(jié)果以各試驗組平均OD值與同時段健康組平均OD值之間的比值來表示。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析 采用GraphPad Prism 5.0進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，并使用SPPS17.0統(tǒng)計軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行單因素方差分析（ANOVA）。當(dāng)方差分析發(fā)現(xiàn)顯著性差異（P＜0.05）時，采用Dunnettt檢驗分析處理組和對照組的均數(shù)差異。體重、OD值及腸道平均病變記分表示為“均值±標(biāo)準(zhǔn)誤”。

2 結(jié)果

2.1 籠養(yǎng)試驗結(jié)果

2.1.1 左旋咪唑?qū)γ庖咂陂g雞體重的影響 由結(jié)果可知，各免疫組在免疫期間的平均體重均與健康組無差異顯著。但在一免后7 d，第3組（0.20 mg左旋咪唑組）體重稍差，相對體重率僅為94.09%；而在二免后7 d，第4組（無佐劑免疫組）體重稍差，相對體重率僅為94.62%（表1）。

表1 籠養(yǎng)試驗中免疫期間體重（g）和相對體重率（%）結(jié)果Table 1 Body weights (g) and relative weight rate (%) during immunization in battery test

2.1.2 左旋咪唑?qū)ハx后雞免疫效果的影響 結(jié)果見表2。從表可知，各免疫組攻蟲期間的增重均與健康組的差異不顯著（P＞0.05），且0.05 mg（第1組）和0.10 mg（第2組）左旋咪唑組的增重明顯高于不免疫攻蟲組（第5組）（P＜0.05）。各免疫組的病變記分相當(dāng)，均明顯低于不免疫攻蟲組（P＜0.05）。除了0.20 mg左旋咪唑組（第3組）的卵囊產(chǎn)量與不免疫攻蟲組的相當(dāng)之外，其余免疫組的均明顯減少。從綜合指標(biāo)ACI來看，0.10 mg左旋咪唑組的ACI最高，達(dá)到192，具有極其高效效果，0.05 mg左旋咪唑組和無佐劑免疫組（第4組）具有高效效果，而0.20 mg左旋咪唑組的效果不佳。

表2 籠養(yǎng)試驗中攻蟲后的ACI結(jié)果Table 2 Result of ACI after challenge in battery test

2.1.3 左旋咪唑?qū)贵w水平的影響 結(jié)果見表3。從表可知，各免疫組的抗體水平均在二免后7天最高，但除了0.20 mg左旋咪唑組（第3組）明顯高于不免疫組之外（P＜0.05），其余組均差異不顯著（P＞0.05）。在試驗期間，三個左旋咪唑組的抗體水平均與無佐劑免疫組（第4組）的相當(dāng)（P＞0.05）。

表3 籠養(yǎng)試驗中的血清抗體效價結(jié)果Table 3 Result of serum antibody titer in battery test

2.2 平養(yǎng)試驗結(jié)果

2.2.1 左旋咪唑?qū)γ庖咂陂g雞體重的影響 結(jié)果見表4。由表可知，在免疫期間，各免疫組之間的體重相當(dāng)，均與健康組（CON）無顯著差異（P＞0.05），但左旋咪唑組（LEV1、LEV2）的體重稍高于無佐劑免疫組（VAC）。

表4 平養(yǎng)試驗中免疫期間的體重（g）和相對體重率（%）結(jié)果Table 4 Body weight (g) and relative weight rate (%) during immunization in floor-pen assay

2.2.2 左旋咪唑?qū)ハx后雞免疫效果的影響 結(jié)果見表5。由表可知，各免疫組沒有出現(xiàn)死亡，而不免疫感染組存活率為91%。各免疫組的增重均與健康組的相當(dāng)，腸道病變輕微或無病變，僅排出少量的卵囊。從綜合指標(biāo)ACI來看，各免疫組的ACI均大于160，具有高效的效果；但相對來講，0.10 mg左旋咪唑組（LEV2）的ACI達(dá)到212，優(yōu)于0.05 mg左旋咪唑組（LEV1）和無佐劑免疫組（VAC）。

表5 平養(yǎng)試驗中攻蟲后的ACI結(jié)果Table 5 Result of ACI after challenge in floor-pen assay

2.2.3 左旋咪唑?qū)?xì)胞因子的影響 對免疫期間和攻蟲后血清中的CD4、CD8分子及細(xì)胞因子TNF-α水平進(jìn)行檢測，以各試驗組平均OD值與同時段的健康組平均OD值之間比值來表示試驗結(jié)果。

CD8分子檢測結(jié)果見表6，從表可知，各免疫組的CD8分子水平在免疫后第14 d明顯高于不免疫組（CON）（P＜0.05），0.10 mg左旋咪唑組（LEV2）明顯高于無佐劑免疫組（VAC）（P＜0.05）；其余時間各組之間無顯著性差異（P＞0.05）。

表6 平養(yǎng)試驗中CD8分子檢測結(jié)果Table 6 Result of CD8 detection in floor-pen assay

CD4分子檢測結(jié)果見表7，從表可知，各免疫組的CD4分子水平在免疫后第7 d明顯高于不免疫組（CON）（P＜0.05），左旋咪唑組與無佐劑免疫組（VAC）之間相當(dāng)（P＞0.05）；其余時間各組之間無顯著性差異（P＞0.05）。

表7 平養(yǎng)試驗中CD4分子檢測結(jié)果Table 7 Result of CD4 detection in floor-pen assay

TNF-α分子檢測結(jié)果見表8，從表可知，各免疫組的TNF-α分子水平在免疫后（第7、14、21 d和攻蟲后7 d均明顯高于不免疫組CON）（P＜0.05），2個左旋咪唑組在免疫后第21 d和攻蟲后7 d均明顯高于無佐劑免疫組（VAC）（P＜0.05），而免疫后7、14 d時差異不顯著（P＞0.05）。

表8 平養(yǎng)試驗中TNF-α分子檢測結(jié)果Table 8 Result of TNF-α detection in floor-pen assay

3 討論

左旋咪唑為咪唑衍生物，對寄生于消化道和呼吸道的線蟲均有高效的驅(qū)除效果，且毒副作用低，是被廣泛應(yīng)用的獸用抗蠕蟲藥物[15-16]。1971年，Renoux等[17]發(fā)現(xiàn)左旋咪唑能增強(qiáng)小鼠布氏桿菌菌苗免疫效果，進(jìn)一步研究表明，左旋咪唑具有免疫刺激作用，可以通過促進(jìn)免疫細(xì)胞的增殖和成熟，或通過增強(qiáng)巨噬細(xì)胞的功能來刺激產(chǎn)生免疫[18-19]。同時，左旋咪唑?qū)ζ⑴K、法氏囊等免疫器官的發(fā)育具有促進(jìn)作用，對雞具有顯著的增重效果[15]，可減輕疫苗對免疫雞生長的不良影響。由于具有免疫增強(qiáng)和促生長的雙重作用，左旋咪唑是一種良好的免疫增強(qiáng)劑，被應(yīng)用于新城疫[20-24]、禽流感[25]、雞傳染性法氏囊[26]等疫苗研制中。本文研究左旋咪唑?qū)θ崮郯蓝蛳x免疫增強(qiáng)效果，首先在籠養(yǎng)試驗中對左旋咪唑的劑量進(jìn)行篩選，再通過平養(yǎng)試驗對篩選獲得的有效劑量進(jìn)行驗證。

本研究首先在籠養(yǎng)試驗中對左旋咪唑的劑量進(jìn)行篩選，首次免疫所用雞為3日齡，是為了與球蟲病活疫苗推薦使用的日齡一致，由于免疫雞一般需要2～3次重復(fù)感染后才可獲得較好的免疫保護(hù)力，而籠養(yǎng)雞無法進(jìn)行二次感染，所以首免后7 d進(jìn)行了二次免疫以增強(qiáng)免疫力?，F(xiàn)有商品化球蟲病活疫苗都僅需免疫一次，所以本研究中僅是在首次免疫時將左旋咪唑與柔嫩艾美耳球蟲聯(lián)合使用，是為了盡可能與疫苗臨床使用方法相符合。最小劑量主要參考喬彥良等[24]、楊晶晶等[25]人的報道，按每公斤體重免疫1 mg左旋咪唑來計算，3日齡雞的體重約為50 g，所以每只雞的劑量為1 mg/kg×0.05 kg=0.05 mg，在此基礎(chǔ)上設(shè)置了0.1 mg和0.2 mg劑量組，即分別是按每公斤體重免疫2 mg和4 mg左旋咪唑來計算。在試驗中，我們觀測了雞的免疫期間體重、ACI以及血清抗體水平等指標(biāo)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)0.1 mg和0.05 mg組雞在免疫期間的增重均稍好于無佐劑免疫組，免疫保護(hù)力分別高于或相當(dāng)于無佐劑免疫組，而0.2 mg組在免疫初期對雞有不良影響，抗球蟲效果明顯低于無佐劑免疫組。結(jié)果表明左旋咪唑?qū)θ崮郯蓝蛳x感染雞具有免疫增強(qiáng)和促生長雙重作用，但其發(fā)揮作用的強(qiáng)度與劑量有關(guān)，這與王書全等[27]研究結(jié)果一致。基于籠養(yǎng)試驗的結(jié)果，我們選擇劑量為0.05 mg和0.10 mg左旋咪唑進(jìn)行散養(yǎng)試驗以進(jìn)一步驗證其效果。結(jié)果也發(fā)現(xiàn)這兩個劑量組免疫期間的增重均稍好于無佐劑免疫組，0.10 mg組的ACI明顯高于0.05 mg組，而后者與無佐劑免疫組相當(dāng)。兩次試驗結(jié)果均表明0.1 mg左旋咪唑?qū)θ崮郯蓝蛳x感染雞的免疫增強(qiáng)和促生長的效果最好。

球蟲感染后可誘發(fā)宿主產(chǎn)生保護(hù)性免疫反應(yīng)，其中體液免疫在抗球蟲免疫中發(fā)揮著不可忽視的作用，尤其特異性抗體 IgG在抵抗球蟲感染時具有重要的作用[28-29]。在籠養(yǎng)試驗中，我們發(fā)現(xiàn)各免疫組的IgG抗體水平在二免后7 d（即一免后14 d）明顯高于不免疫組，其余時間均與不免疫組的相當(dāng)，這與已有研究一致。田文霞等[29]發(fā)現(xiàn)雞特異性IgG可在初次感染柔嫩艾美耳球蟲后第6 d的血清中檢測出，隨后抗體水平逐漸升高于第18 d達(dá)到峰值，持續(xù)一段時間后下降。但本試驗中，各左旋咪唑組與無佐劑免疫組之間的抗體水平無顯著性差異，不同于已有研究。已有研究發(fā)現(xiàn)左旋咪唑與新城疫疫苗聯(lián)用[20-24]、與雞傳染性法氏囊疫苗聯(lián)用[26]均可明顯升高血清特異性抗體滴度。

在雞球蟲保護(hù)性免疫機(jī)制中，細(xì)胞免疫居于主導(dǎo)地位，而T細(xì)胞免疫反應(yīng)在抵抗球蟲病過程起重要作用。雞CD4和CD8分子是T細(xì)胞表面重要的表面標(biāo)志。在平養(yǎng)試驗中，我們發(fā)現(xiàn)免疫組的CD4和CD8分子水平分別在免疫后第7 d和14 d明顯升高，這與已有研究一致。當(dāng)感染球蟲后，雞CD4+和CD8+T淋巴細(xì)胞都參與細(xì)胞免疫過程，CD4+T淋巴細(xì)胞作為調(diào)節(jié)細(xì)胞，主要是啟動免疫應(yīng)答和抵抗初次感染；而CD8+T淋巴細(xì)胞作為一種效應(yīng)細(xì)胞，是抵抗再感染的主力[30-32]。但左旋咪唑處理組的CD4與無佐劑免疫組之間無顯著性差異，而0.1 mg組CD8分子水平免疫后第14 d明顯高于無佐劑免疫組，而0.05 mg組與無佐劑免疫組相當(dāng)，均明顯高于不免疫組，說明左旋咪唑無促進(jìn)CD4增殖作用，而0.1 mg左旋咪唑可以明顯促進(jìn)CD8分子的增殖。

雞感染球蟲后，在細(xì)胞介導(dǎo)的免疫應(yīng)答中，激活的CD4+和CD8+T細(xì)胞釋放的多種細(xì)胞因子在抗球蟲中發(fā)揮重要作用，主要包括5種細(xì)胞因子：IFN-γ、IL-2、IL-5、TGF和腫瘤壞死因子（tumor necrosis factor, TNF）[33]。其中腫瘤壞死因子-α（TNF-α）是由自然殺傷細(xì)胞和巨噬細(xì)胞分泌，對球蟲感染可產(chǎn)生保護(hù)作用。在本試驗中，我們發(fā)現(xiàn)各免疫組的TNF-α水平明顯高于不免疫組，這與已有研究一致。王彩霞等[34]研究結(jié)果表明，首免柔嫩艾美球蟲后第9 d雞TNF-α水平明顯升高。同時也發(fā)現(xiàn)，左旋咪唑處理組在免疫后第21 d和攻蟲后第7 d均明顯高于無佐劑免疫組，說明左旋咪唑可明顯刺激機(jī)體產(chǎn)生TNF-α，利于抵抗球蟲的感染，這與Zhang等[35]發(fā)現(xiàn)脂多糖或柔嫩艾美球蟲子孢子、裂殖子可刺激雞巨噬細(xì)胞產(chǎn)生TNF的結(jié)果一致。

綜上，本研究發(fā)現(xiàn)0.1 mg左旋咪唑處理組可明顯促進(jìn)雞CD8因子的增殖和TNF-α的分泌，明顯提高柔嫩艾美耳球蟲的免疫效果，且有促生長的作用，可以消除球蟲免疫對生長的不良影響，即左旋咪唑與柔嫩艾美耳球蟲聯(lián)合使用的最佳劑量為：按每公斤體重免疫2 mg左旋咪唑來使用。本研究結(jié)果為進(jìn)一步評估左旋咪唑作為球蟲病活疫苗的免疫增強(qiáng)劑提供理論基礎(chǔ)。