陸晨陽，張 婷，任超超，包旦奇，馬天馨，牛世奇，李雪松，楊建美，滕巧泱，李澤君，劉芹防

（中國農業(yè)科學院上海獸醫(yī)研究所，上海 200241）

鴨坦布蘇病毒（Duck Tembusu virus,DTMUV），屬于黃病毒科黃病毒屬，遺傳物質由單股正鏈RNA組成。該病毒最早是在中國的東南地區(qū)發(fā)現(xiàn)并分離到毒株，之后此病毒在南亞地區(qū)快速傳播[1]。臨床上DTMUV感染后的主要癥狀有高熱、食欲下、生長遲緩、產(chǎn)蛋下降，甚至造成鴨只死亡，給我國的養(yǎng)鴨業(yè)造成了嚴重的經(jīng)濟損失[2]。坦布蘇病毒與其他黃病毒屬病毒，如登革熱病毒（Dengue virus, DENV）[3]、日本乙型腦炎病毒（Japanese encephalitis virus, JEV）、寨卡病毒（Zika virus, ZIKV）[4]的傳播途徑類似，都是以節(jié)肢動物為傳播媒介，通過叮咬的方式來感染宿主[5]。這些以昆蟲為傳播媒介的病毒在防控方面存在很大的難度，一方面隨著季節(jié)變化，溫度的上升，導致攜帶病毒的吸血昆蟲大量繁殖[6]，導致傳播途徑無法得到有效的控制。另一方面，自然界中存在大量的潛在宿主或攜帶宿主，導致傳染源也無法得到有效確定并控制[7]。因此目前對于這類疾病的防控主要途徑是疫苗免疫[8]。

目前對坦布蘇病毒的疫苗研究進展較快，從滅活苗、弱毒苗等基本疫苗再到亞單位疫苗、重組疫苗，各個種類的疫苗均有不同程度的研究進展[9]。滅活苗作為最常用的防治病毒病的常規(guī)疫苗，具有安全有效、制造簡單、成本低廉等優(yōu)勢，但是也存在著一些方面的不足，例如接種劑量較大，并且對病毒滅活要求較高，免疫周期短，到達保護效價時間長等[10]。相對的弱毒苗在兼具滅活苗的所有優(yōu)點的前體下能夠達到更長的免疫周期，更快的達到保護效價，病毒的擴增也更加方便，是目前預防鴨坦布蘇病常用的手段[11]。而亞單位疫苗、重組疫苗目前的研究進展還未能夠完全投入臨床應用[12]。

疫苗佐劑，一種用于提高疫苗中抗原免疫原性的輔助物質，在疫苗中添加能夠增強疫苗免疫原性以達到增強疫苗保護性的做法已被證實非常的高效且安全。隨著科學的進步，新的分析方法和工具的問世，大大的加快了免疫佐劑發(fā)展的進程。我們現(xiàn)在添加在疫苗中的物質，從無機的化合物到有機化合物，再到現(xiàn)在的生物蛋白質、多肽、甚至是核酸，極大的豐富了疫苗佐劑方面的選擇[13]。目前，疫苗佐劑通常使用于亞單位疫苗和滅活疫苗中，而適用于活疫苗的佐劑較少。CpG寡核苷酸（oligodeoxynucleotides containing CpG motifs, CpG ODN）作為一種人工合成寡聚脫氧核苷酸，常被應用于滅活疫苗佐劑，其是否具有增強弱毒活疫苗的免疫效果方面研究較少。本研究將CpG ODN作為免疫佐劑添加至鴨坦布蘇弱毒疫苗（FX2010-180P株）中，研究其對弱毒活疫苗的免疫效果的影響。

1 材料與方法

1.1 細胞和毒種 DF-1細胞由本團隊保存，用于病毒滴度的測定。鴨坦布蘇病毒病活疫苗（FX2010-180P）由本實驗室制備與保存；DTMUV病毒FX2010原始毒株由本實驗室分離與保存。

1.2 主要試劑 DMEM培養(yǎng)基購自hyclone公司；南美胎牛血清購自PAN公司；抗TMUV E蛋白單克隆抗體1F5由本實驗室制備與保存；山羊抗鼠IgG-HRP購自Sigma公司；TMB顯色液購自武漢博士德科技有限公司。

1.3 pUC18-CpG Xiao等[14]的研究表明，將20拷貝的CpG ODN 2006（序列為：5'-TCGTCGTTTTGTCG TTTTGTCGTT-3'）串聯(lián)插入至pUC-18的多克隆位點上，所構建的pUC18-CpG質粒按40 μg/只的劑量能夠有效提升坦布蘇病毒HB株滅活疫苗性能。本次實驗所用pUC18-CpG來自北京農林科學院畜牧獸醫(yī)研究所Shaohua Hou課題組，保存在滅菌PBS中，濃度為2 mg/mL。

1.4 免疫實驗 將24只10周齡鴨坦布蘇抗體陰性麻鴨隨機分成四組，每組6只。第一組接種無佐劑添加的FX2010-180P弱毒疫苗。第二組接種以40 μg/只CpG ODN作為佐劑添加入FX2010-180P中的混合疫苗。接種方式均采用腿部肌肉注射方式。每只鴨按照103.5TCID50劑量接種0.2 mL FX2010-180P弱毒株疫苗。第三組同樣以腿部肌肉注射方式接種0.2 mL PBS作為未免疫對照組。第四組不做免疫處理以與3組免疫鴨子同樣的飼養(yǎng)方式養(yǎng)殖，作為MOCK對照組。從免疫后第3 d開始，對進行免疫的3組鴨連續(xù)7 d采血并分離血清，通過阻斷ELISA試驗檢測不同組合疫苗免疫后鴨只體內的抗體效價變化與轉陽率的情況。

1.5 疫苗保護力實驗 免疫后18 d，對接種FX2010-180P組、FX2010-180P+CpG ODN組、無免疫對照組進行攻毒，按照103.5TCID50滴度接種FX2010株病毒，肌肉注射接種0.2 mL/只。未進行疫苗免疫的第四組健康鴨以0.2 mL/只的量肌肉接種的滅菌PBS，作為MOCK對照。連續(xù)3 d觀察各組鴨的感染情況。

1.6 剖檢各組鴨子病理變化 攻毒3 d后，將所有4組實驗鴨放血剖殺，檢查各臟器主要病理變化，取卵巢、腦、脾臟、腎臟、肺臟制作病理切片。

1.7 臟器滴定 滴定前1 d將DF-1細胞以1.0×105個/mL鋪至96孔細胞培養(yǎng)板中，37℃、5%CO2細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)至細胞飽滿度在80%左右。各組織臟器分別取1 g，加入1 mL添加10×青霉素鏈霉素的PBS進行研磨，8000 ×g、4℃離心15 min取上層清澈液體為臟器研磨液。將各組鴨子的各器官臟器研磨液進行10倍倍比稀釋至10-6，將不同濃度的各臟器研磨液按濃度加入鋪至96孔板中的DF-1細胞中，每孔100 μL，作用2.5 h后將臟器研磨液吸棄，用200 μL滅菌PBS清洗2次后，加入100 μL的細胞維持液，37℃、5%CO2細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。培養(yǎng)4 d后，以Reed-Muench法計算病毒的TCID50。

2 結果

2.1 不同疫苗的轉陽率差異 使用阻斷ELISA對采集到的免疫鴨血清進行DTMUV抗體檢測，根據(jù)結果我們發(fā)現(xiàn)免疫FX2010-180P的鴨子最早于免疫后3 d即出現(xiàn)了抗體轉陽，免疫后第6 d所有的免疫鴨轉陽。而添加CpG ODN佐劑組的鴨子則在免疫后5 d出現(xiàn)抗體轉陽，在第6 d全部免疫鴨呈現(xiàn)抗體陽性，抗體轉陽效率低于未添加免疫佐劑的FX2010-180P組。未免疫組的鴨抗體都是陰性。

圖1 不同免疫組鴨只血清轉陽率變化結果Fig.1 Seroconversion rate of immunized ducks at different time points

2.2 不同疫苗阻斷率差異 對各組鴨血清抗體阻斷ELISA所得數(shù)據(jù)進行two-ways ANOVA分析，ttest檢測，兩組免疫不同疫苗鴨子血清中抗體阻斷率無明顯差異（P＞0.05）（圖2），不具有統(tǒng)計學意義。

圖2 不同免疫組鴨子血清抗體效價水平變化結果Fig.2 Antibody titers of immunized ducks at different time points

2.3 各組攻毒后臨床表現(xiàn) 攻毒后24 h觀察各組鴨子，發(fā)現(xiàn)無免疫組鴨子出現(xiàn)食欲下降、帶血稀糞、精神萎靡等癥狀。陰性對照組與兩種免疫組鴨子均未表現(xiàn)出明顯的臨床癥狀，精神狀況、飲食情況、排便情況均無異常。

2.4 各組鴨臟器病理變化 攻毒后3 d剖檢不同免疫組以及空白對照組的鴨子，空白對照組和兩個疫苗免疫組鴨只的卵巢、腦、脾臟、肺臟、腎臟外形正常，無典型DTMUV病變；無免疫對照攻毒組的鴨只均出現(xiàn)脾臟腫大，卵巢出現(xiàn)膿腫卵泡，腦組織粘膜輕微出血充血。

2.5 各組鴨臟器病毒含量滴定 對四個實驗組以及對照組各鴨只臟器進行臟器病毒滴度檢測，實驗結果在未免疫鴨子各臟器中均可以檢測到DTMUV，然而兩組FX2010-180P株免疫組與添加CpG ODN的免疫組鴨子，在FX2010野毒株感染后，各臟器中均檢測不到病毒（圖3）。說明兩種疫苗免疫后都可以保護鴨子不受野毒株的感染，保護率均達到100%。添加CpG ODN對疫苗免疫效果無明顯影響。

圖3 不同免疫佐劑組鴨子臟器病毒滴度Fig.3 Virus titers in different organs of fected ducks

2.6 各組鴨臟器臟器病理切片觀察 觀察經(jīng)HE染色制作的不同組鴨子的脾臟、卵巢、肺臟、腎臟切片，陰性對照組鴨子的脾臟可以清晰觀察到脾臟的被摸、實質以及形成的小梁結構，脾臟細胞無病變，組織間無出血充血（圖4A）；卵巢細胞無病變，組織間無出血充血，卵泡結構完整飽滿（圖4B）；肺臟肺泡邊界清晰，細胞無明顯病變，少量噬堿性粒細胞浸潤（圖4C）；腎臟細胞無明顯病變，腎小管、腎小球結構清晰，組織間無出血充血（圖4D）。FX2010-180P組和添加CpG組各臟器組織與無感染陰性對照組相似，未見明顯組織細胞病變。觀察未免疫攻毒組鴨子脾臟被膜結構破壞、細胞松散、不完整，實質組織間有充血出血，嗜酸性粒細胞增多，小梁結構消失（圖4M）；卵巢組織出現(xiàn)壞死，卵泡結構不完整有干酪樣滲出物（圖4N）；肺泡邊界消失，組織間有出血充血（圖4O）；腎臟嗜酸性粒細胞增多，部分腎小管細胞變性、小管結構破壞，與實質部分細胞間隙不清晰（圖4P）。

圖4 各實驗組鴨子臟器HE染色切片F(xiàn)ig.4 HE staining of sections of different organs of infected ducks

3 討論

CpG ODN對于免疫系統(tǒng)的主要作用機理是在進入哺乳動物體內后會作為一種病原相關分子模式與細菌DNA所產(chǎn)生的免疫刺激活性相似，主要誘導Th1型免疫應答。其主要作用模式為免疫細胞通過內吞的方式捕獲CpG ODN，與模式識別受體TLR-9結合，刺激機體的NF-κB、AP-1、IRF-7轉錄因子通路，促使細胞表達炎癥基因、趨化因子以及抗菌肽，分泌多種細胞因子，通過炎癥反應完成對入侵病原微生物的清除[15]。

同時CpG ODN刺激免疫信號通路對于其他各種免疫細胞也有著重要的影響，能夠在不依賴T淋巴細胞直接激活B淋巴細胞，上調B細胞表面MHC-Ⅱ類分子的表達，快速活化的B淋巴細胞迅速完成抗原的呈遞進而提高抗體的分泌[16]。另一方面通過活化DC細胞，上調MHC-Ⅱ類分子的表達促使其分泌多種細胞因子，IFN-α和TNF-α可以活化T淋巴細胞和NK細胞，進而提高IFN-γ的分泌，誘導Th1型免疫應答[17]。

目前CpG ODN作為免疫佐劑添加在人用乙型肝炎疫苗中的研究已經(jīng)通過了三期臨床階段，添加進入其他人用疫苗的研究也已經(jīng)在二期、三期臨床實驗階段[15]。作為人用疫苗佐劑具有提升免疫性能明顯，與疫苗中抗原物質不發(fā)生沖突的提升非特異性的適應性免疫應答的方式，能夠有效的提高機體對于病原物質的免疫作用以及抗腫瘤作用，生產(chǎn)成本低，貯存、緩釋等方面具有比目前市面上一些常用的佐劑更加優(yōu)秀。有研究顯示，CpG ODN在豬的抗細菌感染方面有著良好的免疫輔助效果[18]。在禽病防治方面，有實驗證實了CpG ODN可以增強ALV-J亞單位疫苗的免疫活性[19]，但目前大多數(shù)獸用疫苗佐劑的應用均還停留在實驗室數(shù)據(jù)階段，因此具有廣泛的市場前景。

本研究結果表明，CpG ODN作為免疫佐劑添加的FX2010-180P弱毒疫苗中與未添加的疫苗相比較都能產(chǎn)生足夠的免疫保護能力，使其免受鴨坦布蘇病毒的感染。但CpG ODN的添加與否并不影響疫苗的保護性能，兩組疫苗在保護性能上并無明顯差距。本研究認為疫苗本身是弱毒活疫苗，進入體內后刺激一套完整的免疫應答程序，而CpG ODN的加入在短時間內提高了Th1型細胞免疫，使部分活病毒在還沒有被B淋巴細胞識別便被天然免疫或粘膜免疫所殺死，所以并未出現(xiàn)提升抗體分泌水平的現(xiàn)象。