權(quán)利娜 王露 王嘉雯 姚晗博 劉航

(1.陜西中醫(yī)藥大學(xué)，陜西 咸陽 712046;2.陜西中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院，陜西 咸陽 712000)

多花黃精PolygonatumcyrtonemaHua，是百合科黃精屬多年生草本植物，入藥部位為根莖，具有補(bǔ)氣養(yǎng)陰、健脾、潤肺、益腎的功效，是《中國藥典》2020版中黃精的來源之一[1]。多花黃精含有多糖、甾體皂苷、黃酮、生物堿類成分[2-3]，其中甾體皂苷具有增強(qiáng)免疫、降血糖、調(diào)血脂、抗腫瘤、抗抑郁等多種藥理作用[4-5]，而上述藥理活性均與抗氧化有關(guān)[6-12]，因此，本研究以總皂苷為評(píng)價(jià)指標(biāo)，采用響應(yīng)面法優(yōu)化多花黃精的提取工藝，并對(duì)總皂苷的進(jìn)行體外抗氧化活性評(píng)價(jià)，為多花黃精總皂苷的開發(fā)利用提供參考。

1 儀器與試藥

1.1儀器 CEL-S500旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(德國IKA公司)；CEL-HXF300萬分之一分析天平(上海佑科儀器儀表有限公司)；KQ-500DE超聲波清洗器(上海冠特超聲儀器有限公司)；UV-2100雙光束紫外-可見光分光光度計(jì)(北京瑞利分析儀器有限公司)；UV1102酶標(biāo)儀(賽默飛世爾科技有限公司)。

1.2試藥 多花黃精(經(jīng)陜西中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院顏永剛教授鑒定為百合科植物PolygonatumcyrtonemaHua的干燥根莖)；菝葜皂苷元對(duì)照品(批號(hào)：110744-201310，中國食品藥品檢定研究所)；薯蕷皂苷元對(duì)照品(批號(hào)：HR20320S1，純度≥98%，寶雞晨光生物有限公司)；DPPH(美國Sigma-Aldrich公司)；ABTS(上海麥克林生物有限公司)；維生素C(Vc)(純度≥98%，上海源葉生物科技有限公司)；其他試劑均為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1總皂苷含量測(cè)定

2.1.1工作曲線的制備[1]精密吸取菝葜皂苷元對(duì)照溶液(每mL含0.5 mg)溶液0.20，0.40，0.60，0.80和1.00 mL，分別置具塞試管中，每個(gè)濃度平行三份，加乙醇使成1 mL，依次加入5%香草醛-冰醋酸溶液1.0 mL(臨用前配制)，高氯酸3.0 mL，充分混勻，70℃的水浴15 min，取出冰水浴冷卻30 min，加入5 mL冰醋酸，充分混勻。以相應(yīng)溶劑為空白，在400～800 nm掃描，確定最大吸收波長為457 nm，在457 nm處測(cè)定吸光度。以濃度(mg·mL-1)作為橫坐標(biāo)，吸光度值為縱坐標(biāo)，進(jìn)行線性回歸，得回歸方程：A=15.6015C+0.0593(r=0.9996)，在0.01～0.05 mg·mL-1范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

2.1.2供試品溶液制備方法 將多花黃精藥材在60℃鼓風(fēng)干燥箱烘干，粉碎，過24目篩。取10 g的黃精藥粉，精密稱定，置250 mL的錐形瓶?jī)?nèi)，按照2.2項(xiàng)下的實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)，超聲提取(功率為500 W，頻率為40 KHZ)，每個(gè)實(shí)驗(yàn)平行3份，過濾，即得供試品溶液。

2.1.3樣品的測(cè)定 精密量取1.0 mL，置于具塞試管中，按2.1.1項(xiàng)下方法，從“加入5%香草醛-冰醋酸溶液1.0 mL”起進(jìn)行操作，測(cè)定其吸收度，在標(biāo)準(zhǔn)曲線中計(jì)算出濃度，根據(jù)公式(1)計(jì)算總皂苷的提取率(mg·g-1)。

總皂苷的提取率=C×V/M

(1)

其中，C：根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算溶液中皂苷的質(zhì)量濃度(mg·mL-1)；V：樣品溶液體積(mL)；M：稱取樣品質(zhì)量(g)。

2.2響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)

2.2.1單因素實(shí)驗(yàn) 稱取10 g多花黃精粉末若干份，在500 W，40 KHz下超聲提取，單因素考察不同濃度乙醇(40%、50%、60%、70%、80%)、乙醇倍數(shù)(8，10，15，20，25倍)、不同提取時(shí)間(50、60、70、80、90 min)對(duì)提取效率的影響。按照2.1項(xiàng)下方法得總皂苷提取率，結(jié)果，乙醇濃度為60%時(shí)提取率最高，超聲時(shí)間在70 min后提取率趨于穩(wěn)定，提取率隨乙醇倍數(shù)增大而增加，在15∶1～20∶1范圍內(nèi)時(shí)提取率變化不明顯。

2.2.2響應(yīng)面設(shè)計(jì)及結(jié)果 在2.2.1項(xiàng)實(shí)驗(yàn)結(jié)果基礎(chǔ)上，以總皂苷提取率為評(píng)價(jià)指標(biāo)，將上述三個(gè)影響因素各設(shè)定為3個(gè)水平。實(shí)驗(yàn)的水平與因素如表1所示。通過Design-Expert 12.0軟件對(duì)本實(shí)驗(yàn)進(jìn)行設(shè)計(jì)，實(shí)驗(yàn)結(jié)果如表2所示。

表1 響應(yīng)面設(shè)計(jì)水平與因素

表2 實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果

2.2.3回歸模型的建立及顯著性分析 使用Design Expert 12.0.3.0軟件對(duì)表2中的數(shù)據(jù)進(jìn)行多元回歸擬合。A(乙醇濃度)、B(液料比)、C(提取時(shí)間)和Y(多花黃精總皂苷提取率)之間的二次多項(xiàng)回歸方程為

Y=-53.55692+1.13214A+0.543705B+

0.492410C-0.001005AB

=+0.001925AC+0.000720BC-0.010250A2-

0.017381B2-0.004228C2

如表3所示，各因素對(duì)總皂苷提取率的影響順序依次為提取時(shí)間，乙醇濃度和料液比。對(duì)此模型行方差分析，結(jié)果如表3所示，二項(xiàng)式擬合復(fù)相關(guān)系r=0.9967，響應(yīng)因子與響應(yīng)值之間的線性關(guān)系較為顯著，說明實(shí)驗(yàn)結(jié)果與模型擬合性較好。整體模型的P值為0.0006<0.001，模型差異極顯著，能較好對(duì)響應(yīng)面值進(jìn)行預(yù)測(cè)。失擬誤差項(xiàng)P值為0.4025>0.05，失擬誤差不顯著，表明模型選擇合適,可以使用此模型對(duì)多花黃精總皂苷提取工藝進(jìn)行分析和預(yù)測(cè)。

表3 回歸方程各項(xiàng)方差分析

2.2.4因素交互作用分析 三個(gè)因素交互作用的響應(yīng)面曲面圖見圖1，反映出提取過程中每?jī)蓚€(gè)因素相互作用對(duì)提取率的影響，從而確定總皂苷提取的最佳條件。

圖1 響應(yīng)面曲線圖

2.2.5提取條件優(yōu)化及模型驗(yàn)證 根據(jù)回歸模型預(yù)測(cè)，乙醇的濃度為61.37%、料液之比為1∶15.385(g·mL-1)、提取時(shí)間為73.520 min，總皂苷類提取率的最大預(yù)測(cè)值3.4694 mg·g-1。考慮到實(shí)際操作問題，將該工藝修改為：15倍的61%乙醇溶液超聲提取74 min。按修訂工藝進(jìn)行三次驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)，得多花黃精總皂苷平均提取含量為3.50 mg·g-1，與模型預(yù)測(cè)結(jié)果接近，說明該提取工藝合理可靠，重現(xiàn)性較好，也驗(yàn)證了響應(yīng)面設(shè)計(jì)優(yōu)化多花黃精提取工藝穩(wěn)定可行。

2.3多花黃精總皂苷體外抗氧化活性研究

2.3.1多花黃精總皂苷的制備 取多花黃精粉末5 g，精密稱定，按2.2.5最佳提取工藝制得提取液，濃縮后加乙醇靜置10 h除去多糖，抽濾，用75%乙醇定容至100 mL，即得多花黃精總皂苷提取液，按2.1.1項(xiàng)下方法進(jìn)行含量測(cè)定。

2.3.2黃精總皂苷對(duì)DPPH自由基的清除[13-14]精密稱取7.88 mg DPPH粉末，無水乙醇溶解并定容至100 mL得0.2 mmol·L-1DPPH溶液，-4 ℃保存。將2.3.1制備的黃精總皂苷提取液用75%乙醇配制成不同濃度的樣品溶液。分別精密吸取不同濃度的樣品溶液100 μL，與100 μL DPPH溶液于96孔板混勻，室溫下避光反應(yīng)30 min，于517 nm處測(cè)定，平行操作3次。Vc為陽性對(duì)照，按公式(2)計(jì)算DPPH清除率，并通過SPSS Statistics 23處理結(jié)合Probit模型計(jì)算半數(shù)抑制濃度(IC50)，結(jié)果如圖2所示。

(2)

式(2)中：A0表示不含樣品的DPPH混合溶液的吸光度；A′0為溶劑對(duì)照；Ai表示含樣品的DPPH混合溶液的吸光度值；Aj表示樣品與無水乙醇混合溶液的吸光度。

圖2 黃精總皂苷與VC對(duì)DPPH的清除效果

由圖2的數(shù)據(jù)可以得出，黃精總皂苷對(duì)DPPH清除率與其樣品濃度呈劑量依賴性，其清除能力弱于Vc，其中，當(dāng)黃精總皂苷濃度達(dá)到110 μg·mL-1時(shí)，對(duì)DPPH自由基的清除率為56.15 %，其IC50值為91.90 μg·mL-1。表明，黃精總皂苷對(duì)DPPH自由基具有一定清除效果。

2.3.3黃精總皂苷對(duì)ABTS自由基的清除[15]用純水制得7.0 mmol·L-1ABTS溶液，2.45 mmol·L-1K2S2O8溶液，并按1∶1比例混合，避光室溫保存12～16 h，制得ABTS母液。用純水稀釋母液至吸光度為0.7±0.02，得ABTS待測(cè)液。將2.3.1制備的黃精總皂苷提取液用75%乙醇配制成不同濃度的供試品溶液。將180 μL稀釋的ABTS自由基溶液與20 μL供試品溶液于室溫下在96孔板中避光反應(yīng)10 min，于734 nm處測(cè)定其吸光度。Vc作為陽性對(duì)照，按公式(3)計(jì)算清除率。平行操作3次，結(jié)果如圖3所示。

(3)

式(3)中：A0表示不含樣品的ABTS混合溶液的吸光度；A′0為溶劑對(duì)照；Ai表示含樣品的ABTS混合溶液的吸光度值；Aj表示樣品與無水乙醇混合溶液的吸光度。

圖3 黃精總皂苷與VC對(duì)ABTS的清除效果

由圖3可知，黃精總皂苷對(duì)ABTS的清除率與其樣品濃度呈劑量依賴性，清除能力弱于Vc。其中，當(dāng)黃精總皂苷濃度達(dá)到110 μg·mL-1時(shí)，對(duì)ABTS自由基的清除率達(dá)到66.87%，接近Vc，其IC50值為60.42 μg·mL-1。表明，黃精總皂苷對(duì)ABTS自由基具有一定清除能力。

3 討論

本研究用紫外分光光度法對(duì)多花黃精總皂苷進(jìn)行含量測(cè)定，用香草醛-冰醋酸法進(jìn)行顯色，對(duì)顯色后的黃精樣品溶液、菝葜皂苷元對(duì)照品溶液和薯蕷皂苷元對(duì)照品溶液在可見光400～800 nm掃描，比較最大吸收波長，黃精樣品最大吸收波長457 nm，菝葜皂苷元最大吸收波長460 nm，薯蕷皂苷元最大吸收波長542 nm，最終確定以菝葜皂苷元作為多花黃精總皂苷含量測(cè)定的對(duì)照品，測(cè)定波長為460 nm。

目前黃精總皂苷的提取方法研究主要有回流提取法、超聲波法，微波法、酶法等[16-19]。對(duì)于多花黃精總皂苷提取工藝研究報(bào)道較少，尤新軍等[20]用正交設(shè)計(jì)優(yōu)化多花黃精總皂苷提取條件，結(jié)果表明超聲法提取法最佳，具有高效、安全、成本低等優(yōu)點(diǎn)。本研究采用響應(yīng)面法優(yōu)化超聲提取多花黃精總皂苷的條件，以總皂苷含量為評(píng)價(jià)指標(biāo)，考核不同濃度乙醇、液料比、提取時(shí)間對(duì)提取效率的影響。多花黃精中的多糖和總黃酮抗氧化活性研究較多，對(duì)具有多種活性的甾體皂苷類成分抗氧化活性方面的研究，筆者未見報(bào)道。本研究并對(duì)黃精總皂苷初步純化后，考察其對(duì)ABTS自由基陽離子和DPPH自由基的清除效果，結(jié)果表現(xiàn)出較好體外抗氧化活性。本研究為多花黃精總皂苷的提取及開發(fā)利用提供參考。