趙重博 王晶 祁春艷 武旭 張麗娟

(1.陜西中醫(yī)藥大學(xué)，陜西 咸陽(yáng) 712046；2.潼關(guān)縣人民醫(yī)院，陜西 渭南 714300)

南星為天南星科植物天南星Arisaemaerubescens(Wall.) Schott、異葉天南星ArisaemaheterophyllumBL.或東北天南星ArisaemaammrenseMaxim.的干燥塊莖，因其有毒，臨床用前常與生姜和白礬共同加工為制天南星，與生天南星相比除毒性降低，功效在消腫散結(jié)的基礎(chǔ)上還可內(nèi)服燥濕化痰，祛風(fēng)止痙[1]，這與制天南星炮制過(guò)程中化學(xué)成分的變化有關(guān)。目前關(guān)于天南星炮制報(bào)道主要集中在刺激性成分草酸鈣針晶類(lèi)及凝集素蛋白的含量降低，2020年版《中國(guó)藥典》規(guī)定天南星的含量檢測(cè)為黃酮類(lèi)，此外，文獻(xiàn)報(bào)道[2-5]天南星還有生物堿類(lèi)、核苷類(lèi)、氨基酸類(lèi)含氮化合物，多糖，針晶，凝集素等。本研究采用UPLC-UV法建立了天南星、制天南星提取物的紫外特征圖譜，根據(jù)主要特征峰紫外信息，進(jìn)一步采用UPLC-Q-TOF-MS/MS研究制天南星的化學(xué)成分，以期為天南星炮制及質(zhì)量控制提供科學(xué)依據(jù)。

1 儀器與試藥

1.1儀器 Agilent 6540超高解析度四級(jí)桿-飛行時(shí)間質(zhì)譜(安捷倫公司，美國(guó))；Waters ACQUITY H-Class超高效液相色譜儀(沃特斯公司，美國(guó))；超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司)。

1.2試藥 生天南星從安國(guó)藥材市場(chǎng)購(gòu)買(mǎi)，經(jīng)陜西中醫(yī)藥大學(xué)吳建華副教授鑒定為天南星科植物天南星Arisaemaerubescens(Wall.) Schott干燥塊莖。制天南星為生天南星按2020年版《中國(guó)藥典》規(guī)定方法，加白礬、生姜炮制而成。標(biāo)本存放于陜西中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院中藥炮制技術(shù)傳承基地中藥飲片標(biāo)本室。使用的甲醇、乙腈均為色譜純，甲酸、提取用甲醇、乙醇均為分析純，水為超純水。

2 方法與結(jié)果

2.1樣品制備

2.1.1醇提液的制備 分別取生天南星和制天南星粉末各約3 g，精密稱(chēng)定，置50 mL具塞錐形瓶中，精密加入60%乙醇30 mL，密塞，稱(chēng)定重量，超聲處理45 min，放冷，再稱(chēng)定重量，用60%乙醇補(bǔ)足減失重量，搖勻，離心，精密量取上清液18 mL，減壓濃縮至干，加60%乙醇使之溶解，轉(zhuǎn)移至5 mL量瓶中并定容，濾過(guò)，即得。生天南星醇提物和制天南星醇提物分別記做生醇和制醇。

2.1.2水提液的制備 分別取生天南星和制天南星粉末各約3 g，按“2.1.1醇提液制備”方法，將提取溶劑換為超純水，即制備得水提液。生天南星水提物和制天南星水提物分別記做生水和制水。

2.2天南星炮制前后的UPLC特征圖譜研究

2.2.1核苷、氨基酸等含氮類(lèi)成分的UPLC特征圖譜 色譜柱：Waters ACQUITY UPLC HSS T3，2.1×100 mm，1.8 μm；流動(dòng)相為乙腈(A)： 0.1%甲酸水(B)；梯度洗脫(0～3.5 min，1%A；3.5～10 min，5%A；10～15 min，8%A；15～28 min，8%A；28～33 min，90%A；33～36 min，90%A；36～37 min，1%A；37～42 min，1%A)；進(jìn)樣量：3 μL；流速：0.2 mL·min-1；柱溫度：35℃；檢測(cè)波長(zhǎng)：二極管陣列檢測(cè)器記錄190～600 nm紫外光譜。

對(duì)生天南星與制天南星不同溶劑提取物核苷、氨基酸等含氮類(lèi)成分進(jìn)行分析(圖1)，首先以生天南星水提物4個(gè)特征峰為研究對(duì)象，研究了生天南星類(lèi)成分的紫外吸收特征，發(fā)現(xiàn)其紫外最大吸收波長(zhǎng)有2個(gè)，分別為195.2～211.7 nm，248.4～261.4 nm(圖2)。因此選擇254 nm對(duì)生天南星與制天南星不同溶劑提取物核苷、氨基酸等含氮類(lèi)成分的UPLC特征圖譜進(jìn)行研究。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，以水作為提取溶劑提取生天南星與制天南星中的核苷、氨基酸等含氮類(lèi)成分提取效率比以60%的乙醇更高，同時(shí)也發(fā)現(xiàn)，生天南星與其炮制品制天南星的特征圖譜有所差異，因此后續(xù)在研究天南星炮制前后核苷、氨基酸等含氮類(lèi)成分時(shí)，以水提物作為研究對(duì)象。

A.生水;B.制水;C.生醇;D.制醇

圖2 生天南星水提物峰1～4紫外最大吸收?qǐng)D

2.2.2黃酮類(lèi)成分的UPLC特征圖譜 色譜柱:Waters ACQUITY UPLC HSS T3，2.1×100 mm，1.8 μm；流動(dòng)相為乙腈(A)： 0.1%甲酸水(B)；梯度洗脫(0～3.5 min，5%A；3.5～4 min，11.2%A；4～26 min，11.2%A；26～27 min，18%A；27～32 min，18%A；32～33 min，90%A；33～35 min，90%A；35～36 min，5%A；36～42 min，5%A)；進(jìn)樣量：3 μL；流速：0.3 mL·min-1；柱溫度：35 ℃；檢測(cè)波長(zhǎng)：二極管陣列檢測(cè)器記錄190～600 nm紫外光譜。

對(duì)生天南星與制天南星不同溶劑提取物黃酮類(lèi)成分進(jìn)行分析(圖3)，首先以生天南星水提物10個(gè)特征峰為研究對(duì)象，研究了生天南星黃酮類(lèi)成分的紫外吸收特征，發(fā)現(xiàn)峰1～10共有的紫外最大吸收波長(zhǎng)有2個(gè)，分別為268.5～270.9 nm，334.2～349.2 nm(圖4)。選擇335 nm對(duì)生天南星與制天南星不同溶劑提取物黃酮類(lèi)成分的UPLC特征圖譜進(jìn)行研究。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，生天南星與制天南星的紫外色譜行為基本一致，但水提物樣品顯示更多的信息峰，因此后續(xù)在研究天南星中黃酮類(lèi)成分時(shí)，以生天南星水提物作為研究對(duì)象(圖4)。

A.生水;B.制水;C.生醇;D.制醇

圖4 天南星水提物峰1～10紫外最大吸收?qǐng)D

2.3天南星炮制前后的UPLC-Q-TOF-MS特征圖譜研究 帶鞘流氣的電噴霧離子源(AJS-ESI)，電離模式(ESI+、ESI-)，掃描方式采用target msms，霧化氣溫度325℃，氣體流量8 L·min-1，噴霧壓力40 psi，鞘流氣溫度350℃，鞘流氣流量11 L·min-1，毛細(xì)管電壓4000 V。二級(jí)質(zhì)譜分析條件：碰撞能量為：0～50 V；全掃描質(zhì)譜范圍：100～1200 m/z。

2.3.1生天南星水提物含氮類(lèi)成分UPLC-Q-TOF-MS分析 運(yùn)用正離子分析模式對(duì)生天南星水提物進(jìn)行UPLC-Q-TOF-MS檢測(cè)(總離子流圖見(jiàn)圖5)，從一級(jí)質(zhì)譜中共檢索到8個(gè)化合物，并根據(jù)其分子質(zhì)量及分子式推測(cè)了其對(duì)應(yīng)的化合物，具體結(jié)果見(jiàn)表1。

表1 生天南星水提物含氮類(lèi)成分MS分析檢索結(jié)果

2.3.2制天南星水提物含氮類(lèi)成分UPLC-Q-TOF-MS分析 運(yùn)用正離子分析模式對(duì)制天南星水提物進(jìn)行UPLC-Q-TOF-MS檢測(cè)(總離子流圖見(jiàn)圖6)，從一級(jí)質(zhì)譜中共檢索到4個(gè)化合物，并根據(jù)其分子質(zhì)量及分子式推測(cè)了其對(duì)應(yīng)的化合物，具體結(jié)果見(jiàn)表2。

圖5 生天南星水提物含氮類(lèi)成分總離子流圖

圖6 制天南星水提物含氮類(lèi)成分總離子流圖

表2 制天南星水提物含氮類(lèi)成分MS分析檢索結(jié)果

峰1：保留時(shí)間8.456 min，一級(jí)質(zhì)譜m/z268.1057 [M+H]+，二級(jí)質(zhì)譜圖分給出產(chǎn)物離子峰m/z136.0631，119.0353，一級(jí)質(zhì)譜信息和二級(jí)質(zhì)譜信息與腺苷基本一致，并且符合腺苷的裂解規(guī)律[6]。推斷峰1為腺苷。

峰2：保留時(shí)間9.252 min，一級(jí)質(zhì)譜m/z284.0992 [M+H]+，二級(jí)質(zhì)譜圖分給出產(chǎn)物離子峰m/z152.0575，一級(jí)質(zhì)譜信息和二級(jí)質(zhì)譜信息與鳥(niǎo)苷基本一致，并且符合鳥(niǎo)苷的裂解規(guī)律[7]。推斷峰2為鳥(niǎo)苷。

峰3：保留時(shí)間9.970 min，一級(jí)質(zhì)譜m/z166.0865 [M+H]+，二級(jí)質(zhì)譜圖分給出產(chǎn)物離子峰m/z120.0815，一級(jí)質(zhì)譜信息和二級(jí)質(zhì)譜信息與苯丙氨酸基本一致，并且符合苯丙氨酸的裂解規(guī)律[8]。推斷峰3為苯丙氨酸。

峰5：保留時(shí)間16.016 min，一級(jí)質(zhì)譜m/z205.0971 [M+H]+，二級(jí)質(zhì)譜圖分給出產(chǎn)物離子峰m/z188.0723、146.0606、118.0658，一級(jí)質(zhì)譜信息和二級(jí)質(zhì)譜信息與色氨酸基本一致，并且符合色氨酸的裂解規(guī)律[9]。推斷峰5為色氨酸。

峰8：保留時(shí)間24.873 min，一級(jí)質(zhì)譜m/z302.2080 [M+H]+，二級(jí)質(zhì)譜圖分別給出產(chǎn)物離子峰m/z171.1138，143.1189，72.0813。推斷峰8為L(zhǎng)-Leucine,L-alanyl-L-valyl-(CAS：93414-38-1)。

2.3.3制天南星水提物黃酮類(lèi)成分UPLC-Q-TOF-MS分析 運(yùn)用負(fù)離子分析模式對(duì)制天南星水提物進(jìn)行UPLC-Q-TOF-MS檢測(cè)(總離子流圖見(jiàn)圖7)，從一級(jí)質(zhì)譜中共檢索到12個(gè)化合物，具體結(jié)果見(jiàn)表3。

圖7 制天南星水提物黃酮類(lèi)成分總離子流圖

表3 制天南星水提物黃酮類(lèi)成分MS分析檢索結(jié)果

黃酮類(lèi)化合物的共同特征：在負(fù)離子模式下，各種黃酮類(lèi)化合物的MS2數(shù)據(jù)顯示一系列的m/z503 [M-H-60]-、473 [M-H-90]-、443 [M-H-120]-碎片離子，這些離子為黃酮碳苷類(lèi)化合物的特征碎片離子，且該類(lèi)化合物應(yīng)為雙糖取代的黃酮碳苷，分子量為564的化合物可能為芹菜素-6-C-戊糖-8-C-葡萄糖苷或者芹菜素-6-C-葡萄糖-8-C戊糖苷，分子量為594的化合物可能為芹菜素-6,8-二葡萄糖苷或者芹菜素-6,8-二半乳糖苷。杜樹(shù)山等[10]從天南星中發(fā)現(xiàn)了以芹菜素為母核，分子量為564的黃酮碳苷類(lèi)化合物5個(gè)：夏佛托苷、異夏佛托苷、芹菜素-6-半乳糖-8-阿拉伯糖苷、芹菜素-6-阿拉伯糖-8-半乳糖苷、維采寧-3(芹菜素-6-C-β-D-吡喃葡萄糖-8-C-β-D-木糖苷)；以芹菜素為母核，分子量為594的黃酮碳苷類(lèi)化合物2個(gè)：維采寧-2(芹菜素6,8-C-二吡喃葡萄糖苷)、芹菜素6,8-C-二吡喃半乳糖苷。結(jié)合本研究一級(jí)、二級(jí)質(zhì)譜信息，推測(cè)天南星黃酮類(lèi)化合物的特征圖譜中可能含有以上化合物。本實(shí)驗(yàn)以夏佛托苷、異夏佛托苷和維采寧-2、維采寧-3為對(duì)照品，通過(guò)保留時(shí)間比對(duì)，發(fā)現(xiàn)峰1、4分別與維采寧-2、夏佛托苷保留時(shí)間一致，異夏佛托苷、維采寧-3保留時(shí)間相同，與峰12一致。

1號(hào)峰：保留時(shí)間12.200 min，一級(jí)質(zhì)譜m/z為581.1490 [M+H]+，二級(jí)質(zhì)譜顯示特征碎片離子519.0987 [M-H-60]-、489 [M-H-90]-、459.0856 [M-H-120]-、441.0728[M-H-120-18]、399.0662 [M-H-120-60]-、369.0568 [M-H-120-90]-、327.0436 [M-H-120-90-42]-，特征碎片離子與木犀草素-6-C-葡萄糖-8-C-木糖極度相似[11]。另外，根據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，489 [M-H-90]-由化合物中木糖0-2鍵斷裂(0,2[XP]-)，相對(duì)豐度為27.41%，459.0856 [M-H-120]-由化合物中葡萄糖0-2鍵的斷裂(0,2[XG]-)，相對(duì)豐度為75.08%。根據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，C-6的糖基更容易碎裂，因此證明了化合物6位連接葡萄糖，而8位連接木糖的結(jié)構(gòu)。綜上所述，1號(hào)峰推測(cè)為木犀草素-6-C-葡萄糖-8-C-木糖。

4號(hào)、12號(hào)峰：保留時(shí)間分別為19.634、28.544 min，一級(jí)質(zhì)譜m/z分別為565.1541 [M+H]+、565.1538 [M+H]+，4號(hào)峰根據(jù)保留時(shí)間初步判斷為夏佛托苷(芹菜素-6-C-β-D-葡萄糖-8-C-α-L-阿拉伯糖苷)，二級(jí)特征碎片離子457 [M+H-90-18)]+、427 [M+H-120-18)]+，其中[M+H-90-18)]+來(lái)源于化合物失去一分子水后，C-8阿拉伯糖0-2鍵的斷裂(0,2[XP]-)；[M+H-120-18)]+來(lái)源于化合物失去一分子水后，C-6葡萄糖0-2鍵的斷裂(0,2[XG]-)。MS2顯示[M+H-120-18)]+豐度遠(yuǎn)高于[M+H-90-18)]+，文獻(xiàn)報(bào)道，C-6的糖基更容易碎裂[12]，因此MS2特征碎片證實(shí)了4號(hào)峰為異夏佛托苷。而在12號(hào)峰中，[M+H-120-18)]+豐度遠(yuǎn)低于[M+H-90-18)]+，說(shuō)明該化合物C-6位為阿拉伯糖，是一個(gè)戊糖，而維采寧-3的C-6位應(yīng)為一個(gè)己糖，因此證明12號(hào)峰為異夏佛托苷而不是維采寧-3。

表4 制天南星水提物黃酮類(lèi)成分MS2分析結(jié)果

7號(hào)、11號(hào)峰：保留時(shí)間分別為19.634、28.544 min，正離子模式下一級(jí)質(zhì)譜m/z分別為595.1638[M+H]+、595.1642 [M+H]+，負(fù)離子模式下進(jìn)行MS2分析，母離子分別為593.1436 [M-H]-、593.1420 [M-H]-，說(shuō)明2個(gè)化合物的分子量均為594，符合芹菜素(270)+葡萄糖基(162)或半乳糖基(162)+葡萄糖基(162)或半乳糖基(162)的分子量。說(shuō)明7、11號(hào)峰可能為芹菜素-6,8-二葡萄糖苷或者芹菜素-6,8-二半乳糖苷。7號(hào)峰的特征碎片離子575[M-H-18]-、473.1018[M-H-120]-、383.0734[M-H-210]-(芹菜素[M:270]+糖殘基[M:113])、354.0695[M-H-239](芹菜素[M:270]+糖殘基[M:84])與文獻(xiàn)報(bào)道中的芹菜素-6,8-二葡萄糖苷特征碎片一致[13].，而11號(hào)峰的特征碎片為503.1107、473.0968、383.073，未出現(xiàn)575[M-H-18]-、354[M-H-239]特征碎片，因此推測(cè)7號(hào)峰為芹菜素-6,8-二葡萄糖苷、11號(hào)峰為芹菜素-6,8-二半乳糖苷。

2、3、5、6、8、9、10號(hào)峰：保留時(shí)間分別為16.404、19.221、20.226、22.177、23.175、24.045 min，正離子模式下一級(jí)質(zhì)譜分子量為565.1539、565.1541、565.1541、595.1638、565.1545負(fù)離子模式下進(jìn)行MS2分析，母離子分別為563.1320 [M-H]-、563.1329 [M-H]-、563.1324 [M-H]-、563.0300 [M-H]-、563.1341 [M-H]-、563.1333 [M-H]-。說(shuō)明3、5、6、8、9、10號(hào)峰的分子量均為564。符合芹菜素(270)+戊糖基(162)+己糖基(132)的分子量。根據(jù)前期文獻(xiàn)研究，推測(cè)6個(gè)峰對(duì)應(yīng)的化合物結(jié)構(gòu)為芹菜素-6-己糖-8-戊糖或者芹菜素-6-戊糖-8-己糖苷，戊糖為木糖、阿拉伯糖可能性更高，己糖為半乳糖、葡萄糖的可能性更高。MS2分析時(shí)，發(fā)現(xiàn)6個(gè)峰共有5個(gè)特征碎片離子，503 [M-H-60]-、473 [M-H-90]-、443 [M-H-120]-、383 [M-H-90-90]-、353 [M-H-120-90]-，503、473均為戊糖基碎裂的結(jié)果[12,14]，文獻(xiàn)報(bào)道C-6位糖基更容易碎裂，峰5、8、9、10的特征碎片503 [M-H-60]-相對(duì)豐度均小于10%，相反的，峰2、3、6的特征碎片503 [M-H-60]-均大于10%，因此推測(cè)峰5、8、9、10可能為芹菜素-6-葡萄糖(半乳糖)-8-阿拉伯糖(木糖)苷，而峰2、3、6可能為芹菜素-6-阿拉伯糖(木糖)-8-葡萄糖(半乳糖)苷。

3 討論

本研究發(fā)現(xiàn)，天南星中的主要化學(xué)成分以核苷、氨基酸等含氮類(lèi)和黃酮類(lèi)為主，這與文獻(xiàn)報(bào)道基本一致[2,15]，其中苯丙氨酸、色氨酸等氨基酸和腺苷、鳥(niǎo)苷等腺苷類(lèi)成分及黃酮類(lèi)成分易溶于熱水，因此制備樣品的提取方法選擇為水提法。與天南星生品相比，制天南星其特征圖譜顯示化學(xué)成分在種類(lèi)及含量上均不如生品豐富；黃酮類(lèi)成分種類(lèi)與生品幾乎一致，但相應(yīng)成分的含量比生品更少?！吨袊?guó)藥典》2020年版規(guī)定：制天南星在炮制加工過(guò)程中需加水和白礬反復(fù)浸泡，待浸泡至口嘗微有麻舌感時(shí)，再加生姜、白礬與天南星共同煮沸至無(wú)干心。結(jié)合本研究關(guān)于生天南星和制天南星的水提物以及醇提物的UPLC特征圖譜研究結(jié)果，可以推測(cè)長(zhǎng)時(shí)間的水處理導(dǎo)致天南星中的水溶性化學(xué)成分在炮制過(guò)后發(fā)生了損失，至于是否轉(zhuǎn)化生成了新成分還需進(jìn)一步研究。

本研究在對(duì)天南星中的黃酮類(lèi)成分進(jìn)行MS和MS2分析時(shí)，發(fā)現(xiàn)天南星中的黃酮類(lèi)成分均有明顯的特征，其母核以芹菜素為主，大部分黃酮類(lèi)成分均為以芹菜素為母核的二糖苷，取代位置可能以C-6位和C-8位為主。取代糖的種類(lèi)以戊糖和己糖為主，并且其裂解規(guī)律符合文獻(xiàn)報(bào)道[16]，在正離子模式下，其裂解時(shí)易脫水，因此碎片[M+H-H2O]-、[M+H-2H2O]-、[M+H-3H2O]-為該類(lèi)化合物在正離子模式下的共同特征峰。另外根據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，負(fù)離子模式下，黃酮碳苷MS2模式下以糖基的碎裂為主，本研究黃酮碳苷化合物的碎裂符合其特征[12]，其特征碎片以[M-H-60]-m/z503、[M-H-90]-m/z473、[M-H-120]-m/z443為主，[M-H-60]-來(lái)源于分子中五碳糖的碎裂，[M-H-120]-來(lái)源于分子中六碳糖的碎裂，[M-H-90]-為五碳糖或六碳糖碎裂的結(jié)果。由于二糖取代的黃酮碳苷其C-6的糖基比C-8位的糖基更容易碎裂，因此，當(dāng)C-6位為六碳糖取代時(shí)，[M-H-60]-m/z503的相對(duì)豐度應(yīng)該比當(dāng)C-6位為五碳糖取代時(shí)的相對(duì)豐度低。本研究發(fā)現(xiàn)天南星中存在大量的同分異構(gòu)體，僅分子式為C26H28O14，未知結(jié)構(gòu)的同分異構(gòu)體就有7個(gè)，雖然該類(lèi)化合物在MS2分析時(shí)有豐度差異，可以判斷C-6位連接五碳糖還是六碳糖，但無(wú)法進(jìn)一步確定糖的種類(lèi)，因此后續(xù)可能需要借助核磁共振等波譜解析手段對(duì)該類(lèi)化合物進(jìn)行結(jié)構(gòu)鑒定。

其次在天南星藥材中檢測(cè)到了仲丁威和環(huán)草定，其中仲丁威是一種氨基甲酸酯類(lèi)殺蟲(chóng)劑，環(huán)草定是一種選擇性尿嘧啶取代的除草劑，這兩種成分應(yīng)為天南星種植時(shí)，為減少病蟲(chóng)草害等造成的損失，人為使用農(nóng)藥后的殘留。《中國(guó)藥典》2020年版在0212通則中收錄了藥材及飲片(植物類(lèi))33種禁用農(nóng)藥，規(guī)定不得檢出(不得超過(guò)定量限)。雖然這兩種農(nóng)藥不在規(guī)定的范圍內(nèi)，但仍提醒我們應(yīng)重視中藥材種植時(shí)農(nóng)藥的使用合理性問(wèn)題。

中藥炮制的核心目的是減毒增效，其中圍繞毒性藥的目的主要體現(xiàn)在降低毒性的前提下盡可能保留藥效。天南星為典型的毒性中藥，也是衛(wèi)生部規(guī)定的28種毒性中藥之一，其毒性成分較為統(tǒng)一認(rèn)識(shí)為草酸鈣針晶及其附著的毒蛋白和多糖形成的“毒針晶”，但此類(lèi)成分不溶于水，白礬溶液的處理就可以大量破壞此類(lèi)成分[17]，而2020年版《中國(guó)藥典》規(guī)定的有效成分黃酮類(lèi)及文獻(xiàn)報(bào)道的核苷、氨基酸等含氮類(lèi)和多糖類(lèi)在炮制過(guò)程中長(zhǎng)時(shí)間浸泡和煎煮會(huì)造成此類(lèi)成分的流失[18-19]，因此有必要通過(guò)研究其炮制過(guò)程成分變化規(guī)范炮制工藝，提高飲片質(zhì)量。