郭丹風，張銘，張笑丹，于瀟，李豪，郭文治（鄭州大學第一附屬醫(yī)院肝膽胰外科，河南省消化器官移植重點實驗室，河南 鄭州 450052）

肝癌是臨床上最常見的惡性腫瘤之一，嚴重危害人類生命健康［1］。最新公布的數(shù)據(jù)顯示：肝癌的全球發(fā)病率和病死率分別位居惡性腫瘤第6 位和第4 位［2］，83%的肝癌病例發(fā)生在處于經(jīng)濟轉(zhuǎn)型期的國家，其中中國的肝癌病例占全球的50%以上［3］。因此，提高肝癌治愈率、降低肝癌發(fā)病率及病死率是亟待解決的臨床問題。免疫狀態(tài)改變參與肝癌發(fā)生發(fā)展的過程［4］。尋找能夠通過調(diào)節(jié)肝癌腫瘤微環(huán)境中免疫細胞的應(yīng)答狀態(tài)發(fā)揮抗腫瘤作用的藥物具有重要臨床應(yīng)用價值。

柳穿魚黃素（pectolinarigenin，Pec）屬于黃酮類化合物，可影響細胞增殖、凋亡、過敏反應(yīng)、抗感染等過程［5-8］。近年來關(guān)于柳穿魚黃素在腫瘤中的作用也得到了密切關(guān)注［9-10］。Wu 等［11］研究發(fā)現(xiàn)柳穿魚黃素通過抑制PI3K/AKT/mTOR/ERK 信號通路抑制HCC 增殖，促進細胞凋亡。此外，柳穿魚黃素還可通過抑制ERK 信號通路抑制肝癌細胞耐藥株的增殖、侵襲和遷移［12］。已有研究多聚焦于柳穿魚黃素直接抑制肝癌細胞生物學行為的作用觀察，關(guān)于柳穿魚黃素對肝癌微環(huán)境中細胞免疫應(yīng)答的調(diào)控作用尚未闡明。

本課題擬通過構(gòu)建肝癌荷瘤小鼠，給予柳穿魚黃素處理后，分析荷瘤小鼠體內(nèi)T 淋巴細胞亞型的變化，并探討其對T 淋巴細胞功能的影響，為其作為肝癌治療的抗腫瘤藥物提供理論基礎(chǔ)。

1 資料與方法

1.1材料：Hepa 1-6 細胞株來自本實驗室留存；柳穿魚黃素購自北京索萊寶科技有限公司；胎牛血清購自美國Gibco 公司；DMEM 高糖培養(yǎng)基、胰酶及細胞凍存液均購自蘇州新賽美生物科技有限公司；TRIzol 總RNA 提取試劑盒、逆轉(zhuǎn)錄試劑盒購自南京諾唯贊醫(yī)療科技有限公司；2×SYBR Green qPCR 擴增試劑盒購自美國Bimake 生物科技有限公司；Anti-CD16/CD32 抗體（Cat.14-0161-85）購自美國Invitrogen 公司。流式抗體Fixable viability dye（FVD）-PB450（Cat. 65-0863-14）購自美國Thermo公司。流式抗體anti-mouse CD3-FITC（Cat. 100203）及anti-mouse CD4-PECy7（Cat. 100422）購 自 美 國Biolegend 公司。流式抗體anti-mouse CD8a-PE（Cat.561095）購自美國BD bioscience 公司。

1.2實驗方法

1.2.1細胞培養(yǎng)：Hepa 1-6 細胞為本中心留存。Hepa 1-6 細胞在含5 % CO2，37℃的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，培養(yǎng)基為含10%胎牛血清的DMEM 高糖培養(yǎng)基。當細胞處于對數(shù)生長期，細胞密度大于90%時，進行傳代。用0.25%胰蛋白酶消化，當多數(shù)細胞形態(tài)變圓時，應(yīng)即加入3 倍體積的含10%胎牛血清的DMEM 液終止消化。低速離心后，吹打細胞沉淀制成細胞懸液，按1 ∶3 進行傳代。待培養(yǎng)細胞總量達到實驗需求時，收集細胞，細胞計數(shù)儀進行計數(shù)后，調(diào)整細胞濃度為3×106個/ml，按照每只小鼠100 μl 的劑量進行皮下荷瘤接種。

1.2.2構(gòu)建皮下移植瘤模型：SPF 級C57BL/6N 雌鼠10 只，8 周齡，體重18 ～20 g，購買于北京斯貝福生物技術(shù)有限公司。小鼠飼養(yǎng)于鄭州大學第一附屬醫(yī)院河南省消化器官移植重點實驗室SPF 級動物房，適應(yīng)性飼養(yǎng)7 d 后，進行荷瘤。皮下荷瘤鼠源肝癌細胞Hepa 1-6，3×105個/100 μl。荷瘤后，小鼠隨分為2 組，每組5 只。柳穿魚黃素處理組（Pec 組）小鼠經(jīng)腹腔注射給予Pec（使用劑量20 mg/kg），對照組（Ctrl 組）小鼠經(jīng)腹腔注射給予等量的生理鹽水。隔天給藥，連續(xù)給藥7 次。

每2 d 進行小鼠體重稱量及腫瘤大小的測量。使用游標卡尺測量移植瘤的生長情況，記錄小鼠腫瘤長徑（a） 與垂直徑（b），根據(jù)公式a×b2/2 計算腫瘤體積，并繪制腫瘤體積增長曲線。荷瘤第21 d，獲取小鼠脾臟及腫瘤引流淋巴結(jié)，流式細胞術(shù)檢測CD4+T 細胞和CD8+T 細胞的比例變化。剝離小鼠腫瘤，稱重后凍存于-80℃，提取RNA，利用 實 時 熒 光 定 量PCR（real time quantitative PCR，RT-qPCR）檢測相關(guān)因子（IFN-γ、Granzyme B、CXCL10及CXCR3） 的表達情況。動物實驗重復(fù)3次。

1.2.3 流式細胞術(shù)：頸椎脫臼法處死2 組實驗小鼠，取脾臟及腫瘤區(qū)域引流淋巴結(jié)（腫瘤側(cè)腋窩及腹股溝淋巴結(jié)），置于PBS 中。研磨后過濾，濾液離心1500 rpm×5 min。加入2 ml 紅細胞裂解液處理5 min，加3 倍體積PBS 進行中和， 離心1500 rpm×5 min，細胞沉淀以PBS 重懸。每種樣本取1×106個細胞進行表面染色。每管加1 μl anti-CD16/CD32 抗體，以封閉細胞表面Fc 受體，于4℃作用10 min。分別加入下列5 種熒光素標記的流式抗體（終濃度均為1 μg/ml），包括Fixable viability dye （FVD）-PB450、anti-mouse CD3-FITC、anti-mouse CD4-PECy7、anti-mouse CD8a-PE，4℃避光孵育30 min。加2 ml 預(yù)冷PBS 中和染色，離心1500 rpm×5 min，重復(fù)2 次。棄上清，加200 μl PBS 重懸細胞，上流式細胞儀進行檢測。流式數(shù)據(jù)采用FlowJo 軟件進行作圖分析。

1.2.4 免疫組化：新鮮腫瘤組織經(jīng)福爾馬林固定后送武漢賽維爾公司進行免疫組化染色，檢測CD8 抗原表達情況。以Image-pro plus 6.0 （Media Cybernetics， Inc.， Rockville， MD， USA）軟件分析單位面積內(nèi)CD8 陽性細胞數(shù)量。具體分析方法如下：每組內(nèi)每張切片隨機挑選至少3 個200 倍視野進行拍照。拍照時盡量讓組織充滿整個視野，保證每張照片的背景光一致。應(yīng)用Image-Pro Plus 6.0軟件選取相同的棕黃色作為判斷所有照片陽性的統(tǒng)一標準，對3 個200 倍視野內(nèi)陽性細胞進行計數(shù)。計算組織面積，求出每平方毫米陽性細胞的數(shù)量。

1.2.5 RT-qPCR：Trizol 法提取組織RNA，逆轉(zhuǎn)錄成cDNA。采用2×SYBR Green qPCR（Bimake）進行定量PCR 擴增。本文中涉及的小鼠基因及相應(yīng)的引物序列如下（表1）。

表1 小鼠基因及相應(yīng)的引物序列

1.3 統(tǒng)計學方法：應(yīng)用Graphpad prism 8.0 軟件對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計學處理，所有數(shù)據(jù)用均數(shù)±標準差（±s）表示，采用t 檢驗或者單因素方差分析（One-way ANOVA analysis）。P ＜0.05 為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié) 果

2.1 柳穿魚黃素有效抑制小鼠肝癌進展：兩組小鼠體重變化曲線基本重合，說明實驗使用的柳穿魚黃素劑量在安全范圍內(nèi)，不影響小鼠的基本生理狀態(tài)，見圖1A（P ＞0.05）。腫瘤體積增長曲線結(jié)果顯示Pec 組小鼠腫瘤體積明顯減?。≒ ＜0.05），見圖1B。荷瘤21 d 后完整剝除腫瘤組織進行稱重，發(fā)現(xiàn)Pec 組小鼠腫瘤重量明顯減輕（P ＜0.05），見圖1C。以上結(jié)果證實，柳穿魚黃素具有顯著抑制肝癌進展的作用。

圖1 兩組小鼠皮下移植瘤模型構(gòu)建情況

2.2 柳穿魚黃素處理后小鼠體內(nèi)CD8+T 淋巴細胞比例增加：流式細胞術(shù)結(jié)果顯示，與對照組相比，Pec 組小鼠脾臟中，CD8+T 淋巴細胞比例顯著增加（P ＜0.05），而CD4+T 淋巴細胞比例減少（P ＜0.05），見圖2A、B。在荷瘤小鼠的腫瘤區(qū)域引流淋巴結(jié)中也得到一致結(jié)果，見圖2C、D。以上結(jié)果提示柳穿魚黃素可能調(diào)控肝癌荷瘤小鼠體內(nèi)T淋巴細胞含量進而影響肝癌進程。

圖2 兩組小鼠體內(nèi)CD4+、CD8+ T 淋巴細胞比例情況

2.3 柳穿魚黃素處理后腫瘤組織中CD8+T 淋巴細胞浸潤增多：對荷瘤小鼠腫瘤組織的流式分析結(jié)果顯示，與Ctrl 組相比，Pec 組小鼠腫瘤組織內(nèi)CD45+CD8+T 淋巴細胞比例顯著增多（P ＜0.05），見圖3A、B。免疫組化結(jié)果同樣證實腫瘤組織內(nèi)提示CD8+T 淋巴細胞數(shù)量增加（P ＜0.05），見圖3C、3D。以上結(jié)果說明柳穿魚黃素可促進肝癌荷瘤小鼠體內(nèi)CD8+T 淋巴細胞浸潤。

圖3 兩組小鼠腫瘤組織中CD8+ T 淋巴細胞含量

2.4 柳穿魚黃素處理增強CD8+T 淋巴細胞相關(guān)效應(yīng)分子的表達水平：RT-qPCR 結(jié)果顯示，在Pec組小鼠腫瘤組織中，IFN-γ、Granzyme B 的表達水平顯著高于對照組（P ＜0.05），見圖4A、4B。同時，與CD8+T 淋巴細胞趨化密切相關(guān)的因子CXCL10 及受體CXCR3 表達水平同樣顯著升高（P ＜0.05），見圖4C、D。以上結(jié)果提示，柳穿魚黃素促進肝癌荷瘤小鼠體內(nèi)CD8+T 淋巴細胞在腫瘤組織中的浸潤，同時增強CD8+T 細胞效應(yīng)分子的分泌水平，進而發(fā)揮抑制肝癌進展的作用。

圖4 兩組小鼠腫瘤組織中各效應(yīng)分子的表達情況

3 討 論

肝癌是一種消化系統(tǒng)常見的惡性腫瘤，因其易轉(zhuǎn)移和易復(fù)發(fā)，肝癌患者預(yù)后較差［13-17］。目前，肝癌的治療主要包括外科手術(shù)、放化療、靶向免疫治療及中藥輔助治療等［18］。其中，靶向免疫治療是腫瘤治療和免疫學研究的熱點，但是肝癌微環(huán)境存在的免疫抑制現(xiàn)象是導(dǎo)致肝癌免疫治療效果差的主要因素［19］。腫瘤免疫抑制微環(huán)境能極大程度的抑制機體抗腫瘤CD8+T 細胞的活化，從而導(dǎo)致腫瘤的免疫逃逸［20］。而中藥因其具有誘導(dǎo)肝癌細胞凋亡、抑制癌細胞增殖、抑制新生血管生成及抗腫瘤免疫調(diào)節(jié)等多重作用，受到研究學者的關(guān)注［21］。因此，尋找能夠有效提高肝癌患者體內(nèi)抗腫瘤CD8+T 細胞浸潤及功能的方法，對提高肝癌免疫治療的效果具有重要意義。

柳穿魚黃素是一種從中藥中提取的天然黃酮類化合物，具有抗炎活性、抗病毒和抗腫瘤的作用［22-23］。在本研究中，我們使用了不影響小鼠正常生理狀態(tài)的安全劑量的柳穿魚黃素處理肝癌荷瘤小鼠后，小鼠腫瘤體積顯著減少，腫瘤重量明顯減輕，證實了其對肝癌的抗腫瘤作用。分析荷瘤小鼠外周脾臟及腫瘤區(qū)域的腋窩及腹股溝引流淋巴結(jié)，我們發(fā)現(xiàn)柳穿魚黃素處理組小鼠體內(nèi)CD8+T 細胞比例升高。同時，在腫瘤組織中流式分析和免疫組化結(jié)果顯示腫瘤組織內(nèi)浸潤CD8+T 細胞數(shù)目增多。以上結(jié)果說明柳穿魚黃素可增加肝癌荷瘤小鼠體內(nèi)CD8+T 細胞的浸潤。

CD8+T 細胞活化后通過釋放具有殺傷作用的細胞因子包括IFN-γ、顆粒酶B 等發(fā)揮細胞毒作用［24］。同時，趨化因子CXCL10 通過與其受體CXCR3 結(jié)合，可招募CD8+T 細胞進入癌組織，直接殺傷腫瘤細胞，有效提高患者總生存率［25-26］。我們發(fā)現(xiàn)柳穿魚黃素處理后，腫瘤組織中IFN-γ、顆粒酶B 等細胞因子及與CD8+T 細胞趨化密切相關(guān)的趨化因子CXCL10 及其受體CXCR3 表達水平均顯著上升。

綜上所述，柳穿魚黃素可增加肝癌荷瘤小鼠體內(nèi)CD8+T 細胞的浸潤，并增強其效應(yīng)因子IFN-γ的表達水平，進而發(fā)揮抑制肝癌進展的抗腫瘤作用。同時，我們研究發(fā)現(xiàn)，柳穿魚黃素處理后小鼠體內(nèi)CD4+T 細胞比例下降，但其具體機制有待進一步研究明確。此外，除了T 淋巴細胞外，B 淋巴細胞和NK 細胞等其他免疫細胞亞型也可以參與抗腫瘤免疫應(yīng)答過程，并影響IFN-γ 細胞因子的分泌。我們將在未來深入研究柳穿魚黃素與抗腫瘤免疫應(yīng)答過程密切相關(guān)的其他免疫細胞亞群，包括B淋巴細胞、NK 細胞等的調(diào)控關(guān)系，全面分析柳穿魚黃素對免疫應(yīng)答過程中的免疫細胞功能的影響。