鄧格，豆猛，宮惠琳，鄭秉暄，石玉婷，衛(wèi)田，丁晨光，鄭瑾，丁小明，薛武軍，田普訓(xùn)（.西安交通大學(xué)第一附屬醫(yī)院腎臟病醫(yī)院腎移植科，陜西 西安 7006；.西安交通大學(xué)第一附屬醫(yī)院病理科，陜西 西安 7006）

腎移植已成為終末期腎臟病最成功的治療手段，然而抗體介導(dǎo)排斥反應(yīng)（antibody-mediated rejection，ABMR）仍是制約移植腎長(zhǎng)期存活的重要因素。作為固有免疫系統(tǒng)的重要組成成分，近年來巨噬細(xì)胞在越來越多疾病中顯示出獨(dú)特作用［1-2］。在移植免疫中，巨噬細(xì)胞可以引發(fā)適應(yīng)性免疫反應(yīng)，維持T 細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞性排斥反應(yīng)和B 細(xì)胞介導(dǎo)的ABMR。雖然由T 細(xì)胞、B 細(xì)胞組成的適應(yīng)性免疫在同種異體移植排斥反應(yīng)和耐受中的作用已得到廣泛認(rèn)可，但先天免疫的重要性卻未得到充分認(rèn)識(shí)。而巨噬細(xì)胞是一種具有明顯異質(zhì)性的細(xì)胞群體，在不同環(huán)境中可以轉(zhuǎn)換為不同亞型、發(fā)揮不同作用［3-4］。本研究旨在闡明ABMR 發(fā)生時(shí)巨噬細(xì)胞及不同亞型在移植腎組織內(nèi)的表達(dá)及浸潤(rùn)部位，分析巨噬細(xì)胞浸潤(rùn)與腎功能的相關(guān)性，有望揭示巨噬細(xì)胞參與ABMR 移植腎損傷的可能機(jī)制。

1 資料與方法

1.1GEO 數(shù)據(jù)集及數(shù)據(jù)處理：選取GEO 數(shù)據(jù)庫(kù)中由加拿大埃特蒙頓腎臟病學(xué)和移植免疫學(xué)系上傳的腎移植受者的微陣列表達(dá)數(shù)據(jù)集GSE36059，使用R 語(yǔ)言“l(fā)imma”包對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行l(wèi)og2 轉(zhuǎn)換并歸一化。通過CIBERSORT 生物信息學(xué)算法評(píng)估樣本中的免疫細(xì)胞浸潤(rùn)及比例。R 語(yǔ)言“ggplot2”包用于對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行可視化。

1.2進(jìn)行病理染色的本院腎移植受者的納入標(biāo)準(zhǔn)：① 于本院進(jìn)行首次同種異體腎移植的患者。② 術(shù)后規(guī)律隨訪。③ 腎臟穿刺病理組織活檢證實(shí)為抗體介導(dǎo)的排斥反應(yīng)。

1.3進(jìn)行病理染色的本院腎移植受者的排除標(biāo)準(zhǔn)：① 二次及以上同種異體腎移植患者；② 親屬活體腎移植受者；③ 未進(jìn)行腎臟穿刺病理組織活檢。

1.4進(jìn)行病理染色的患者分組及一般資料：選取2021 年1 月— 2021 年12 月于本院進(jìn)行同種異體腎移植并行腎臟穿刺病理組織活檢的患者作為Stable 組和ABMR 組，選取行腎臟穿刺病理顯示腎小球、腎小管及間質(zhì)等結(jié)構(gòu)正常，但lifeport 灌注參數(shù)阻力較高的DCD 供者棄腎作為Control 組。共選取15 例患者，分為3 組，每組5 例。Control 組包括3 例男性、2 例女性，平均年齡為（38.20 ±10.45）歲，收集標(biāo)本時(shí)尿蛋白均為陰性，肌酐為（54.40±8.73） μmol/L。Stable 組包括1 例男性、4 例女性，平均年齡為（36.40 ± 9.34）歲，5 例患者原發(fā)腎病均為腎小球腎炎，收集標(biāo)本時(shí)腎移植術(shù)后時(shí)長(zhǎng)為（2.31±1.77）個(gè)月，5 例患者尿蛋白均為陰性，肌酐為（124.00±44.97） μmol/L，群體反應(yīng)性抗體（panel reactive antibody，PRA）均為陰性。ABMR 組包括4 例男性、1 例女性，平均年齡為（43.20±11.50）歲，4 例患者原發(fā)性腎病為腎小球腎炎、1 例為IgA 腎病，收集標(biāo)本時(shí)腎移植術(shù)后時(shí)長(zhǎng)為（4.25±3.65）個(gè)月，5 例患者尿蛋白均為陽(yáng)性，肌酐為（457.60±152.27） μmol/L， PRA均為陽(yáng)性 （基線資料見表1）。3 組患者在性別、年齡方面差異無顯著性（P ＞0.05）。本研究中公民逝世后器官捐獻(xiàn)來源的腎移植供者、受者均按照中國(guó)人體器官分配與共享計(jì)算機(jī)系統(tǒng)（COTRS）程序分配且經(jīng)過本院《人體器官移植技術(shù)臨床應(yīng)用與倫理會(huì)》批準(zhǔn)。

表1 基線資料表（±s）

表1 基線資料表（±s）

項(xiàng)目 Control 組（n ＝5） Stable 組（n ＝5） ABMR 組（n ＝5） P 值性別（例） 0.153男3 1 4女2 4 1年齡（歲，images/BZ_41_1599_1402_1619_1446.png±s） 38.20 ± 10.45 36.40 ± 9.34 43.20 ± 11.50 0.582 HLA 錯(cuò)配數(shù)（個(gè)） 0.435 0 2 1 1 2 2 1 1 3 3 及以上 0 0原發(fā)腎病（例） 0.292慢性腎炎 5 4 IgA 腎病 0 1術(shù)后時(shí)間（月，images/BZ_41_1599_1402_1619_1446.png±s） 2.31 ± 1.77 4.25 ± 3.65 0.317尿蛋白（例） ＜0.05陰性 5 5 0陽(yáng)性 0 0 5肌酐（μmol/L，images/BZ_41_1599_1402_1619_1446.png±s） 54.40 ± 8.73 124.00 ± 44.97 457.60 ± 152.27 ＜0.05 PRA（例） 0.008陽(yáng)性 0 5陰性 5 0

1.5 腎移植受者免疫誘導(dǎo)及免疫抑制方案：根據(jù)器官移植免疫抑制劑臨床應(yīng)用技術(shù)規(guī)范（2019 版）［4］，腎移植受者術(shù)前及術(shù)中免疫誘導(dǎo)方案為兔抗人胸腺細(xì)胞免疫球蛋白50 ～75 mg/d，自手術(shù)當(dāng)天開始連用3 d）或兔抗人T 淋巴細(xì)胞免疫球蛋白（200 mg/d，自手術(shù)當(dāng)天開始連用3 d）；術(shù)后免疫抑制維持方案為鈣調(diào)神經(jīng)磷酸酶抑制劑CNI 類（他克莫司或環(huán)孢素A）+嗎替麥考酚酯或麥考酚鈉+甲潑尼龍為基礎(chǔ)的三聯(lián)免疫抑制方案，根據(jù)血藥濃度監(jiān)測(cè)結(jié)果適當(dāng)調(diào)整免疫抑制劑用量。

1.6 標(biāo)本收集：Control 組標(biāo)本來源于DCD 供者的腎臟穿刺組織。Stable 組和ABMR 組標(biāo)本來源于腎移植受者超聲引導(dǎo)下的穿刺活檢組織。

1.7 免疫組織化學(xué)染色：腎臟穿刺組織經(jīng)4%多聚甲醛溶液固定至少24 h 后，進(jìn)行石蠟包埋，并切成4 μm 厚度的連續(xù)石蠟切片。切片65℃烘烤2 h，經(jīng)二甲苯脫蠟、梯度酒精水化、抗原修復(fù)、內(nèi)源性H2O2酶阻斷后，選擇相應(yīng)一抗稀釋后滴加至切片上37℃孵育2 h （表2），再滴加對(duì)應(yīng)酶標(biāo)二抗IgG 聚合物37℃孵育30 min 后，進(jìn)行DAB 顯色5 ～7 min，自來水沖洗終止顯色。顯色完畢，經(jīng)蘇木素溶液進(jìn)行復(fù)染、分化返藍(lán)，梯度酒精脫水、二甲苯透明、中心樹脂膠封片。

表2 免疫組化染色所用一抗

1.8 結(jié)果觀察：染色后的切片在光學(xué)顯微鏡的不同放大倍數(shù)下進(jìn)行觀察，10×20 放大倍數(shù)下隨機(jī)選取不同視野進(jìn)行拍照，同一患者的標(biāo)本根據(jù)連續(xù)切片選取同一視野。每例患者的切片在光學(xué)顯微鏡下隨機(jī)選取10 個(gè)腎小球視野進(jìn)行拍照，手動(dòng)計(jì)數(shù)每個(gè)腎小球內(nèi)CD68+及CD86+巨噬細(xì)胞的數(shù)量，取平均值后進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。

1.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法：采用GraphPad Prism9.0 軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。分類資料的組間比較采用卡方檢驗(yàn)或Fisher 確切概率法。正態(tài)分布資料以均值±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，組間比較采用t 檢驗(yàn)，

兩組以上的均值比較采用單因素方差分析。相關(guān)性分析采用Pearson 法。P ＜0.05 表示差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1GSE36059 數(shù)據(jù)集中的巨噬細(xì)胞浸潤(rùn)情況：通過CIBERSORT 算法對(duì)GSE36059 中的免疫細(xì)胞浸潤(rùn)進(jìn)行分析（圖1），結(jié)果表明，與Stable 組相比，ABMR 組中的M0 巨噬細(xì)胞及M1、M2 型巨噬細(xì)胞比例顯著增加，其中M1 型巨噬細(xì)胞比例的增加具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（圖2）。

圖1 GSE36059 數(shù)據(jù)集中所有樣本內(nèi)不同免疫細(xì)胞比例的條形圖

圖2 GSE36059 數(shù)據(jù)集中Stable 組和ABMR 組之間M0巨噬細(xì)胞及M1、M2 型巨噬細(xì)胞比例的小提琴圖

2.2不同組間浸潤(rùn)巨噬細(xì)胞的數(shù)量及部位：相比Control 組和Stable 組，ABMR 組的移植腎組織內(nèi)浸潤(rùn)的總巨噬細(xì)胞（CD68+）數(shù)量明顯增多 （圖3A d ～f，3B），且浸潤(rùn)的巨噬細(xì)胞主要分布在微血管周圍（腎小球內(nèi)和間質(zhì)毛細(xì)血管，CD31+，圖3A a ～c）。

2.3浸潤(rùn)總巨噬細(xì)胞的亞型：對(duì)腎組織內(nèi)的總巨噬細(xì)胞進(jìn)一步分型染色，結(jié)果顯示，浸潤(rùn)在微血管周圍的總巨噬細(xì)胞以促炎性的M1 型巨噬細(xì)胞（CD68+CD86+）為主（圖3A g ～i，3C），組織修復(fù)、抑炎相關(guān)的M2 型巨噬細(xì)胞（CD68+CD206+）無顯著浸潤(rùn)（圖3A j ～l）。

圖3 巨噬細(xì)胞及其亞型在不同患者體內(nèi)的表達(dá)情況

2.4巨噬細(xì)胞的浸潤(rùn)程度與移植腎功能的相關(guān)性：采用Pearson 相關(guān)性分析檢驗(yàn)?zāi)I移植受者血清肌酐與平均每個(gè)腎小球內(nèi)總巨噬細(xì)胞、M1 型巨噬細(xì)胞的細(xì)胞數(shù)量的相關(guān)性。結(jié)果顯示：血清肌酐與平均每個(gè)腎小球內(nèi)總巨噬細(xì)胞（圖4A）、M1 型巨噬細(xì)胞（圖4B）的細(xì)胞數(shù)量之間具有相關(guān)性，且相關(guān)系數(shù)分別為0.795、0.823，P 值均小于0.05，表明平均每個(gè)腎小球內(nèi)巨噬細(xì)胞（總巨噬細(xì)胞以及M1型巨噬細(xì)胞）的細(xì)胞數(shù)量與移植腎功能密切相關(guān)。

圖4 肌酐與腎小球內(nèi)總/M1 型巨噬細(xì)胞數(shù)量的Pearson 相關(guān)性分析

3 討 論

隨著外科技術(shù)手段的進(jìn)步及現(xiàn)有免疫抑制劑的廣泛使用，腎移植術(shù)后急性排斥反應(yīng)的發(fā)生率顯著下降，移植腎1 年存活率可以達(dá)到90%以上［6-8］。但目前腎移植術(shù)后早期發(fā)生的急性排斥反應(yīng)中超50%為ABMR，且超60%的晚期腎移植失敗原因也為ABMR［9］。ABMR 尚缺乏有效治療手段。巨噬細(xì)胞是先天免疫系統(tǒng)的關(guān)鍵效應(yīng)細(xì)胞。傳統(tǒng)免疫學(xué)中，巨噬細(xì)胞主要被視為清道夫細(xì)胞，其主要功能是清除病原體、死亡細(xì)胞和外來分子，近年來越來越多的研究表明巨噬細(xì)胞在組織炎癥和修復(fù)中起著重要作用［10］。

本研究顯示發(fā)生ABMR 時(shí)，巨噬細(xì)胞在移植腎組織內(nèi)具有顯著浸潤(rùn)，浸潤(rùn)巨噬細(xì)胞的數(shù)量與腎臟功能具有顯著相關(guān)性。李憲昌教授團(tuán)隊(duì)2020 年發(fā)表在Science 上的一項(xiàng)重大研究發(fā)現(xiàn)，在小鼠同種異體腎移植和心臟移植中，巨噬細(xì)胞具有和適應(yīng)性免疫系統(tǒng)相似的免疫記憶，在缺乏T 細(xì)胞、B 細(xì)胞的免疫環(huán)境中可顯示出對(duì)排斥的獨(dú)特貢獻(xiàn)［11］。2018 年Jordi Ochando 教授的研究團(tuán)隊(duì)在Immunity發(fā)表的重要論著則表明，第一時(shí)間浸潤(rùn)同種異體移植物的巨噬細(xì)胞可以通過移植物中的損傷相關(guān)分子模式進(jìn)行“訓(xùn)練”，而這種“訓(xùn)練過的”巨噬細(xì)胞直接參與了移植物排斥反應(yīng)［12］。以上研究均證明巨噬細(xì)胞作為先天性免疫系統(tǒng)的一部分，在移植排斥反應(yīng)中發(fā)揮著我們過去尚未完全認(rèn)識(shí)到的重要作用。

巨噬細(xì)胞是一群具有顯著可塑性的細(xì)胞，可以從一種表型轉(zhuǎn)換為另一種［3-4］。1980 — 2000 年間，科學(xué)家們發(fā)現(xiàn)巨噬細(xì)胞可以由Th1 型細(xì)胞因子γ-干擾素（interferon-γ，IFN-γ）或Th2 型細(xì)胞因子白介素-4（interleukin 4，IL-4）和IL-13誘導(dǎo)為經(jīng)典活化的M1 型巨噬細(xì)胞（classically activated macrophages）［13］或替代活化M2 型巨噬細(xì)胞（alternatively activated macrophages）［14］。M1 亞型的極化可以促進(jìn)多種炎癥因子產(chǎn)生，如IL-1β、IL-6、腫 瘤 壞 死 因 子-α（tumor necrosis factor，TNF-α）、環(huán)氧合酶2（cyclooxygenase 2，COX2），以及誘導(dǎo)型一氧化氮合酶（inducible nitric oxide synthase，iNOS）和MHC-Ⅱ的高表達(dá)［15-16］，誘發(fā)或加重組織的炎癥反應(yīng)。M2 亞型的巨噬細(xì)胞可以通過吞噬凋亡細(xì)胞，阻止凋亡細(xì)胞內(nèi)炎性介質(zhì)的釋放，產(chǎn)生抗炎介質(zhì)，如IL-10、轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β（transforming growth factor-β，TGF-β）［17-18］，TGF-β 可以促進(jìn)血管生成和成纖維細(xì)胞激活［19］，IL-10 則可以抑制效應(yīng)性T 細(xì)胞、促進(jìn)Foxp3+調(diào)節(jié)性T 細(xì)胞（regulatory T cells，Treg）的產(chǎn)生［20］；IL-4、IL-13 可以使M2 型巨噬細(xì)胞產(chǎn)生高水平的精氨酸酶1（arginase-1，Arg-1）催化鳥氨酸等底物以促進(jìn)纖維化和傷口愈合［21］。巨噬細(xì)胞的可塑特性使得研究者們需要進(jìn)一步了解浸潤(rùn)在移植物中巨噬細(xì)胞的具體表型，從而更好地闡明巨噬細(xì)胞在ABMR 的發(fā)生發(fā)展中的作用機(jī)制。

本研究中，利用CIBERSORT 對(duì)GSE36059 數(shù)據(jù)集中浸潤(rùn)的巨噬細(xì)胞分型進(jìn)行分析，結(jié)果顯示M1 型巨噬細(xì)胞在ABMR 發(fā)生時(shí)顯著增多，而M2型巨噬細(xì)胞浸潤(rùn)的差異則不明顯，對(duì)本中心腎移植受者的腎臟活檢組織的IHC 染色也進(jìn)一步證明了該結(jié)果，且相關(guān)性分析顯示M1 型巨噬細(xì)胞的數(shù)量與移植腎功能同樣具有顯著相關(guān)性。其他研究表明在小鼠心臟移植模型中，M1 樣單核細(xì)胞可以從骨髓浸潤(rùn)至心臟移植物中，參與排斥反應(yīng)的發(fā)生［22］。

上述結(jié)果確定了巨噬細(xì)胞尤其是M1 型巨噬細(xì)胞在ABMR 中具有重要作用，但移植物中巨噬細(xì)胞的來源以及它介導(dǎo)移植物損傷的具體機(jī)制目前研究尚不清楚。我們的IHC 染色發(fā)現(xiàn)巨噬細(xì)胞主要浸潤(rùn)在微血管周圍（腎小球內(nèi)和間質(zhì)毛細(xì)血管周圍），而ABMR 發(fā)生的關(guān)鍵特征是內(nèi)皮細(xì)胞的損傷和激活［23］，因此，巨噬細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞的共定位現(xiàn)象使得我們推測(cè)二者間存在相互作用，這種作用可以趨化巨噬細(xì)胞浸潤(rùn)至移植物內(nèi)、參與ABMR移植物損傷的發(fā)生發(fā)展。Pabois 等［24］研究也表明，在心臟移植受者活檢組織和體外實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，內(nèi)皮細(xì)胞可以通過notch 信號(hào)通路募集巨噬細(xì)胞并誘導(dǎo)其向M1 極化，參與ABMR 的發(fā)生。巨噬細(xì)胞可以產(chǎn)生iNOS 促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞損傷和腎小管毒性［25］。

綜上，本研究發(fā)現(xiàn)M1 型巨噬細(xì)胞在ABMR 中顯著增多，且巨噬細(xì)胞、B 淋巴細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞之間可能存在相互作用，但移植物中巨噬細(xì)胞的來源以及與內(nèi)皮細(xì)胞的具體作用機(jī)制、如何造成移植物損傷，都是我們進(jìn)一步研究的重點(diǎn)內(nèi)容。