馬錫慧，米運(yùn)強(qiáng)，韓永，張娟，李彬鈺，孫玉潔，朱蕾，王佳齊，肖漓

（1.中國(guó)人民解放軍總醫(yī)院第八醫(yī)學(xué)中心呼吸與危重癥醫(yī)學(xué)部研究所，北京市器官移植與免疫調(diào)節(jié)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100091；2. 聯(lián)勤保障部隊(duì)第984 醫(yī)院，北京 100094）

肺移植是目前公認(rèn)的治療各種終末期肺部疾病的有效方式［1］，隨著供體選擇、器官保存、圍術(shù)期管理和術(shù)后并發(fā)癥處理的不斷改進(jìn)，患者預(yù)后有了明顯的改善。但因?yàn)榉闻K與外界直接相通，更易接觸各種病原體和外來(lái)物，因此，面臨極高的感染風(fēng)險(xiǎn)，肺移植術(shù)后5 年內(nèi)急、慢性排斥反應(yīng)所致肺功能障礙的發(fā)生率也高達(dá)50%［2］。但感染和排斥反應(yīng)的治療方案相悖，免疫抑制劑的使用與患者的免疫狀態(tài)密切相關(guān)，淋巴細(xì)胞亞群是患者免疫狀態(tài)的直觀體現(xiàn)［3］，本文動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)2 例肺移植受者住院期間淋巴細(xì)胞亞群變化情況，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 資料與方法

1.1病例資料：病例1，男性，55 歲，診斷“矽肺Ⅲ期、間質(zhì)性肺炎、高血壓（3 級(jí)，極高危）”，因基礎(chǔ)肺功能差，肺部情況處于終末期階段，具有肺移植指征，于2021 年6 月10 日行VVECMO 輔助下雙肺移植術(shù)，為本院首例肺移植手術(shù)。術(shù)后診療計(jì)劃：① 肺功能方面：定期復(fù)查血?dú)?，監(jiān)測(cè)患者呼吸頻率、呼吸幅度、指脈氧飽和度，視患者情況調(diào)整輔助呼吸設(shè)備的使用。② 循環(huán)系統(tǒng)方面：監(jiān)測(cè)心率、血壓，維持容量負(fù)平衡，適當(dāng)利尿。③ 抗感染方面：給予預(yù)防感染等對(duì)癥支持治療，密切注意病原學(xué)檢查結(jié)果。④ 免疫抑制方案和免疫狀態(tài)：定期監(jiān)測(cè)淋巴細(xì)胞亞群和免疫抑制劑血藥濃度，及時(shí)調(diào)整藥量。⑤ 消化系統(tǒng)方面：?jiǎn)?dòng)腸外營(yíng)養(yǎng)，注意觀察患者消化道癥狀。⑥ 腎功能方面：監(jiān)測(cè)腎功能變化。⑦ 精神心理方面：床旁心理輔導(dǎo)，緩解患者焦慮?？古懦夥磻?yīng)治療方案：他克莫司+醋酸潑尼松+嗎替麥考酚鈉。根據(jù)淋巴細(xì)胞亞群和免疫抑制劑血藥濃度監(jiān)測(cè)結(jié)果，從術(shù)后第1 天開(kāi)始先后6 次調(diào)整他克莫司膠囊劑量，至術(shù)后12 d 確定他克莫司膠囊劑量為3 mg，1 次/12 h，患者肺移植術(shù)后病情平穩(wěn)，未出現(xiàn)感染和排斥反應(yīng)，經(jīng)多學(xué)科精心診療和護(hù)理，于術(shù)后14 d 出院，出院后就診無(wú)錫市人民醫(yī)院和無(wú)錫市惠山區(qū)康復(fù)醫(yī)院進(jìn)行康復(fù)鍛煉治療，康復(fù)鍛煉2 個(gè)月后出院，出院后規(guī)律口服他克莫司3 mg，1 次/12 h，醋酸潑尼松片15 mg，1 次/d，嗎替麥考酚鈉180 mg，1 次/12 h，術(shù)后半年返院復(fù)查1 次。

病例2，女性，18 歲，診斷“藥物中毒（百草枯）、肺間質(zhì)纖維化、Ⅰ型呼吸衰竭”，該患者2021 年12 月5 日服用“感冒藥”后出現(xiàn)惡心嘔吐癥狀，住院治療期間開(kāi)始出現(xiàn)間斷胸悶氣短，逐漸加重。2021 年12 月17 日患者尿液中檢測(cè)到百草枯70 ng/ml。診斷明確，肺纖維化進(jìn)展迅速，具有肺移植適應(yīng)證，患者術(shù)前肺組織百草枯殘留量為零，術(shù)前存在肝功能和凝血功能異常、電解質(zhì)紊亂、血淀粉酶升高，其他器官功能尚可。于2022 年1 月6 日行VVECMO 輔助下雙肺移植術(shù)。術(shù)后第1 天拔除ECMO 置管及氣管插管，給予無(wú)創(chuàng)呼吸機(jī)及高流量交替應(yīng)用。術(shù)后診療計(jì)劃與病例1 相似，從肺功能、循環(huán)系統(tǒng)、抗感染、免疫抑制和免疫狀態(tài)、消化系統(tǒng)等7 方面進(jìn)行，并根據(jù)百草枯中毒的特點(diǎn)和多器官功能障礙的嚴(yán)重性啟動(dòng)個(gè)體化診療方案。抗排斥反應(yīng)治療方案：患者術(shù)前已存在免疫抑制，感染風(fēng)險(xiǎn)高，因此進(jìn)行了加強(qiáng)抗感染治療，患者術(shù)后第4 天開(kāi)始服用免疫抑制劑（環(huán)孢素A），并根據(jù)淋巴細(xì)胞亞群和免疫抑制劑血藥濃度監(jiān)測(cè)結(jié)果及時(shí)調(diào)整用量和更換免疫抑制劑，術(shù)后第7 天更換免疫抑制劑為他克莫司，術(shù)后12 d 確定抗排斥治療方案他克莫司2 mg，1 次/12 h，醋酸潑尼松片20 mg，1 次/d，嗎替麥考酚鈉180 mg，1 次/12 h，經(jīng)多學(xué)科精心診療和護(hù)理，患者一般情況可，未出現(xiàn)明顯感染和排斥反應(yīng)，肝臟、腎臟和消化系統(tǒng)功能逐漸恢復(fù)，經(jīng)評(píng)估于術(shù)后13 d 出院，轉(zhuǎn)至無(wú)錫人民醫(yī)院行康復(fù)治療。

本研究經(jīng)我院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，且患者均簽署知情同意書(shū)。

1.2實(shí)驗(yàn)儀器與實(shí)驗(yàn)材料：實(shí)驗(yàn)儀器包括流式細(xì)胞儀（BD 公司，型號(hào)FACS Canto Plus），多管架平衡離心機(jī)（湘儀，型號(hào)TDZ5 -WS），渦旋混勻器（Thermo，LP vortex Mixer）。實(shí)驗(yàn)材料包括移液器及槍頭一套、絕對(duì)計(jì)數(shù)管（BD 公司，型號(hào)Trucount）、淋巴細(xì)胞亞群檢測(cè)試劑6-color TBNK Reagent（BD 公司，型號(hào)MultitestTM REF 644611）、10×FACS 溶血素（BD 公司）、FACS 7 色設(shè)置微球（BD 公司）。樣本為EDTA 抗凝外周全血。

1.3實(shí)驗(yàn)方法：將20 μl 淋巴細(xì)胞亞群檢測(cè)試劑（CD3/CD8/CD45/CD4/CD16+56/CD19）移到絕對(duì)計(jì)數(shù)管的底部。采用反向移液法吸取50 μl 充分混勻的乙二胺四乙酸抗凝外周全血，加入絕對(duì)計(jì)數(shù)管底部，震蕩混勻后室溫避光孵育15 min。每管加入450 μl 溶血素（10×FACS 溶血素∶蒸餾水＝1 ∶10），充分混勻之后，室溫避光孵育15 min。采用流式細(xì)胞儀檢測(cè)樣本中的淋巴細(xì)胞亞群，采用Canto 軟件獲取和分析淋巴細(xì)胞亞群比例和絕對(duì)計(jì)數(shù)。

1.4 觀察指標(biāo)：觀察肺移植受者術(shù)前及術(shù)后送檢的淋巴細(xì)胞亞群的表達(dá)變化，確定患者免疫狀態(tài)，及時(shí)調(diào)整治療方案，評(píng)估淋巴細(xì)胞亞群動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)在肺移植受者的應(yīng)用價(jià)值。

2 結(jié) 果

2.1 2 例患者在肺移植前后不同時(shí)間點(diǎn)的淋巴細(xì)胞亞群比例和絕對(duì)計(jì)數(shù)（表1、表2）。

表1 病例1 在肺移植前后不同時(shí)間點(diǎn)的淋巴細(xì)胞亞群比例和絕對(duì)計(jì)數(shù)

表2 病例2 在肺移植前后不同時(shí)間點(diǎn)的淋巴細(xì)胞亞群比例和絕對(duì)計(jì)數(shù)

病例1：術(shù)前淋巴細(xì)胞亞群在正常水平，術(shù)后第9 天開(kāi)始，T 淋巴細(xì)胞（包括CD3+T、CD3+CD4+T和CD3+CD8+T 淋巴細(xì)胞）絕對(duì)計(jì)數(shù)恢復(fù)至參考值范圍內(nèi)。術(shù)后住院期間CD3+CD8+T 淋巴細(xì)胞比例和NK 細(xì)胞絕對(duì)數(shù)均低于正常水平、B 淋巴細(xì)胞比例均高于正常水平，術(shù)后6 個(gè)月均已恢復(fù)至參考值范圍。B 淋巴細(xì)胞絕對(duì)數(shù)均維持在正常水平。CD4/CD8 在術(shù)后第8 天開(kāi)始高于參考值范圍。

病例2：術(shù)前淋巴細(xì)胞亞群嚴(yán)重低于正常水平，CD3+T 和CD3+CD8+T 淋巴細(xì)胞絕對(duì)計(jì)數(shù)在術(shù)后第7 天恢復(fù)至參考值范圍。術(shù)后住院期間CD3+CD4+T 淋巴細(xì)胞比例和絕對(duì)計(jì)數(shù)、CD4/CD8 均低于正常水平，NK 細(xì)胞和B 淋巴細(xì)胞絕對(duì)計(jì)數(shù)多數(shù)時(shí)間點(diǎn)低于參考值范圍。

2.2 2 例患者淋巴細(xì)胞亞群隨時(shí)間變化 （圖1 ～4）：2 例患者淋巴細(xì)胞各亞群比例與對(duì)應(yīng)絕對(duì)計(jì)數(shù)隨時(shí)間變化趨勢(shì)均不一致。病例1 CD3+CD4+T 淋巴細(xì)胞與總（CD3+）T 淋巴細(xì)胞比例隨時(shí)間變化趨勢(shì)一致。病例2 CD3+CD8+T 淋巴細(xì)胞與總（CD3+）T淋巴細(xì)胞比例隨時(shí)間變化趨勢(shì)一致。

圖1 患者淋巴細(xì)胞亞群隨時(shí)間變化

圖2 患者淋巴細(xì)胞亞群隨時(shí)間變化

3 討 論

肺移植目前已經(jīng)成為公認(rèn)的治療終末期肺部疾病的一種有效方法［1］，同其他實(shí)體器官移植一樣，防治排斥反應(yīng)和感染一直是肺移植的兩大難點(diǎn)［4］，同時(shí)肺臟作為一個(gè)開(kāi)放的器官，直接與外界相通，因此其感染和排斥反應(yīng)的發(fā)生情況較其他器官更為復(fù)雜，這也是導(dǎo)致肺移植生存率低于其他器官移植的原因之一［5］，及時(shí)評(píng)估肺移植受者免疫狀態(tài)，有效預(yù)防感染和排斥反應(yīng)尤為重要，淋巴細(xì)胞亞群作為評(píng)估機(jī)體免疫狀態(tài)的指標(biāo)越來(lái)越受到臨床醫(yī)生的重視，尤其是淋巴細(xì)胞亞群絕對(duì)計(jì)數(shù)，因其能更準(zhǔn)確地反映某種淋巴細(xì)胞的數(shù)量變化，而不受其他亞群的影響，因此，淋巴細(xì)胞亞群絕對(duì)計(jì)數(shù)能更準(zhǔn)確地反映機(jī)體的免疫功能高低水平。

本研究中病例1 為職業(yè)礦工，接觸煤礦、金礦及打隧道15 年，2019 年經(jīng)當(dāng)?shù)芈殬I(yè)病防治研究院診斷為“職業(yè)性矽肺Ⅲ期”，該患者肺移植術(shù)前存在高碳酸血癥，F(xiàn)EV1＜30%預(yù)計(jì)值且1 年內(nèi)快速下降，肺臟彌散功能無(wú)法完成，影像學(xué)有嚴(yán)重的特征性改變，反復(fù)發(fā)作性氣胸，具有明顯肺移植適應(yīng)證，且有研究報(bào)道肺移植治療Ⅲ期矽肺效果良好，術(shù)后患者可長(zhǎng)期存活［6］。

病例1 淋巴細(xì)胞亞群結(jié)果顯示：該患者術(shù)后3 d、4 d 總（CD3+）T 淋巴細(xì)胞、CD3+CD4+T 淋巴細(xì)胞、CD3+CD8+T 淋巴細(xì)胞、NK 細(xì)胞處于嚴(yán)重低下?tīng)顟B(tài)，結(jié)合免疫抑制劑血藥濃度監(jiān)測(cè)結(jié)果，將他克莫司劑量（初始劑量3 mg，2 次/d）先后調(diào)整為1.5 mg，2 次/d 及1 mg，2 次/d。術(shù)后5 d 總T 淋巴細(xì)胞、CD3+CD4+T 淋巴細(xì)胞、CD3+CD8+T 淋巴細(xì)胞、NK 細(xì)胞絕對(duì)數(shù)持續(xù)回升，術(shù)后8 d 總T 淋巴細(xì)胞、CD4/CD8 升高明顯，為防止排斥反應(yīng)發(fā)生，結(jié)合血藥濃度、血常規(guī)及臨床表現(xiàn)，術(shù)后7 d、8 d先后調(diào)整他克莫司劑量為2 mg 2 次/d、早2 mg 晚2.5 mg。術(shù)后9 d 開(kāi)始，總T 淋巴細(xì)胞繼續(xù)升高至參考值范圍，術(shù)后11 d、13 d 總T 淋巴細(xì)胞絕對(duì)計(jì)數(shù)相對(duì)穩(wěn)定，因此術(shù)后9 d、12 d 先后調(diào)整他克莫司劑量為2.5 mg，2 次/d 及3 mg，2 次/d。該患者術(shù)后6 個(gè)月復(fù)查時(shí)，淋巴細(xì)胞亞群絕對(duì)計(jì)數(shù)已恢復(fù)至正常，這與練巧燕等［7］的研究結(jié)果一致。王宇成等［8］的研究表明，腎移植術(shù)后急性排斥反應(yīng)患者CD4/CD8 明顯升高，值得注意的是，該肺移植患者術(shù)后8 d CD4/CD8 持續(xù)高于參考值范圍，應(yīng)持續(xù)動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)淋巴細(xì)胞亞群及其他檢查指標(biāo)，以防出現(xiàn)肺移植術(shù)后排斥反應(yīng)。

本研究中病例2 為百草枯中毒患者。百草枯是一種廣泛使用的有機(jī)雜環(huán)類(lèi)接觸性脫葉劑和除草劑。急性百草枯中毒截至目前仍無(wú)特效治療方法，病死率高達(dá)50%～70%［9］。百草枯中毒引起肺、肝、腎、心、腦等多臟器功能障礙［10］，它的主要靶器官是肺臟，通過(guò)復(fù)雜的分子機(jī)制最終引起肺纖維化。許多報(bào)道顯示［11-12］，肺移植已成為目前治療肺間質(zhì)纖維化的有效治療方式，甚至是最后的選擇。而肺移植也成為致死劑量百草枯攝入后目前唯一有效的治療方法［13］。

該患者術(shù)前已進(jìn)行4 次甲潑尼龍琥珀酸鈉聯(lián)合環(huán)磷酰胺沖擊治療聯(lián)合常規(guī)免疫抑制治療，淋巴細(xì)胞亞群結(jié)果顯示患者存在嚴(yán)重免疫抑制，術(shù)后即加強(qiáng)抗感染治療且暫未使用免疫抑制劑。患者術(shù)后4 d 淋巴細(xì)胞亞群結(jié)果顯示總T 淋巴細(xì)胞、CD3+CD4+T 淋巴細(xì)胞、CD3+CD8+T 淋巴細(xì)胞較前升高，為防止排斥反應(yīng)發(fā)生，經(jīng)多學(xué)科聯(lián)合評(píng)估，術(shù)后4 d 開(kāi)始給予環(huán)孢素A（100 mg，2 次/d）免疫抑制治療。術(shù)后6 d、7 d 根據(jù)血藥濃度和淋巴細(xì)胞亞群結(jié)果，先后提高環(huán)孢素A 劑量（150 mg，2 次/d）和更換環(huán)孢素A 為他克莫司（2 mg，2 次/d）。

該患者總T 淋巴細(xì)胞和CD3+CD8+T 淋巴細(xì)胞絕對(duì)計(jì)數(shù)在術(shù)后第7 天恢復(fù)至參考值范圍，而CD3+CD4+T 淋巴細(xì)胞絕對(duì)計(jì)數(shù)、CD4/CD8 在住院期間均持續(xù)低于正常水平，有研究表明外周血CD4+T淋巴細(xì)胞的變化與腎移植術(shù)后早期嚴(yán)重肺部感染的轉(zhuǎn)歸密切相關(guān)［14］，，因此應(yīng)警惕該患者感染的發(fā)生。術(shù)后7 d 以后，CD3+CD8+T 淋巴細(xì)胞比例開(kāi)始偏高而CD3+CD4+T 淋巴細(xì)胞比例持續(xù)偏低，結(jié)合絕對(duì)計(jì)數(shù)結(jié)果，說(shuō)明CD3+CD8+T 淋巴細(xì)胞比例屬于反應(yīng)增高，CD3+CD4+T 淋巴細(xì)胞的抑制程度更高，恢復(fù)更慢，該患者術(shù)后13 d 內(nèi)CD3+CD4+T淋巴細(xì)胞和B 淋巴細(xì)胞絕對(duì)計(jì)數(shù)多數(shù)時(shí)間點(diǎn)低于參考值范圍，因患者術(shù)后時(shí)間較短。因此，本研究暫未獲得該患者的淋巴細(xì)胞亞群隨訪數(shù)據(jù)，應(yīng)繼續(xù)進(jìn)行淋巴細(xì)胞亞群動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)，以及時(shí)了解患者機(jī)體免疫狀態(tài)恢復(fù)情況，避免發(fā)生嚴(yán)重感染。

2 例患者淋巴細(xì)胞亞群隨時(shí)間變化圖顯示：淋巴細(xì)胞各亞群比例與對(duì)應(yīng)絕對(duì)計(jì)數(shù)隨時(shí)間變化趨勢(shì)均不一致。說(shuō)明：淋巴細(xì)胞亞群絕對(duì)計(jì)數(shù)能更準(zhǔn)確地反映機(jī)體的免疫狀態(tài)，二者結(jié)合可以直觀地反映機(jī)體的免疫程度和變化趨勢(shì)。病例1 CD3+CD4+T 淋巴細(xì)胞與總（CD3+）T 淋巴細(xì)胞比例隨時(shí)間變化趨勢(shì)一致，說(shuō)明CD3+CD4+T 淋巴細(xì)胞是引起總T 淋巴細(xì)胞變化的主要因素。病例2 CD3+CD8+T 淋巴細(xì)胞與總（CD3+）T 淋巴細(xì)胞比例隨時(shí)間變化趨勢(shì)一致，說(shuō)明CD3+CD8+T 淋巴細(xì)胞是引起總T 淋巴細(xì)胞變化的主要因素［15］。

綜上所述，通過(guò)及時(shí)的淋巴細(xì)胞亞群檢測(cè)和免疫力評(píng)估，結(jié)合其他檢查指標(biāo)，在多學(xué)科聯(lián)合診療和護(hù)理下，兩例肺移植患者圍術(shù)期均未出現(xiàn)感染和排斥反應(yīng)，移植肺功能和患者長(zhǎng)期存活還需進(jìn)一步隨訪研究。同其他實(shí)體器官移植一樣［16-20］，淋巴細(xì)胞亞群在肺移植術(shù)后免疫監(jiān)測(cè)中同樣發(fā)揮著重要的作用，與肺移植患者的個(gè)體化診療和免疫抑制劑的使用相關(guān)。且有研究報(bào)道，外周血T 淋巴細(xì)胞亞群對(duì)于鑒別肺移植術(shù)后感染和排斥反應(yīng)具有一定幫助［21］。另外，淋巴細(xì)胞亞群比例和絕對(duì)計(jì)數(shù)聯(lián)合分析，能夠更加全面地反映機(jī)體的免疫程度和變化趨勢(shì)，為臨床精準(zhǔn)診療提供明確的依據(jù)。