周 靜 李紫嫣 胡建煜 劉 睿 呂 弋，*

(1.四川大學 分析測試中心，成都 610064；2.四川大學 化學學院，成都 610064)

生命科學的研究在21世紀進入了發(fā)展的新時代，為了更好地理解給定的生物系統，我們必須獲得生物分子的準確定量信息，以直接反映系統的客觀狀態(tài)。例如，對蛋白質和核酸，以及癌細胞、細菌和病毒等生物體的分析檢測有助于疾病診斷和生命科學的研究發(fā)展。為了滿足這一生物學研究要求，研究人員必須不斷開發(fā)新的分析技術來適應各種不同的檢測需求。核酸工具酶是一種廣泛應用于基因工程技術中的可以對核酸進行精確剪切、連接、修飾等作用的工具，因其具有序列識別特異性高、催化活性高、反應條件比較溫和以及生物相容性良好等優(yōu)點而備受關注。另一方面，電感耦合等離子體質譜(Inductively Coupled Plasma Mass Spectrometry，ICP-MS)作為一種強大的元素定量工具，在近年也被廣泛地應用到了食品檢驗、地質分析、環(huán)境監(jiān)測以及生物分析當中[1-3]。近些年，一些將核酸工具酶和金屬穩(wěn)定同位素標記方法兩者的優(yōu)點相結合建立起來的方法也被應用到了生物分析中，并展現出良好的發(fā)展前景。

1 方法簡介

1.1 核酸工具酶

核酸工具酶是一種廣泛應用于基因工程技術中的可以對核酸進行精確剪切、連接、修飾等作用的工具[4]。隨著核酸工具酶的不斷發(fā)展，越來越多的核酸工具酶被陸續(xù)報道，多種核酸工具酶已被用作“納米工具”，用于操縱生物體內不同的核酸底物，根據它們對作用底物的偏好，大致可以將它們分為聚合酶、核酸酶、限制酶和修飾酶等幾個大類[5]，其中以聚合酶和核酸酶在生物分析中的應用最為廣泛[6]。除了這些常見的核酸工具酶以外，一些自身擁有特殊性質的核酸工具酶也能夠為生物活性分子的檢測提供一些新的設計思路。例如，簇狀規(guī)則間隔的短回文重復序列(Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats，CRISPR)和相關蛋白組成的CRISPR-Cas系統和DNA酶，因具有獨特的生物識別能力和核酸酶活性，也在生物分析領域中被廣泛使用[7]。

1.2 基于金屬穩(wěn)定同位素標記的ICP-MS檢測方法

ICP-MS作為一種強大的元素定量工具，對大多數的元素測定都具有較高的靈敏度[8]，這使得大多數的元素和同位素都可被用作元素標簽，基于ICP-MS強大的元素及同位素定量功能發(fā)展出了金屬穩(wěn)定同位素標記方法[9]，該方法由清華大學張新榮教授在2001年首次提出，并在之后的20多年得到了快速發(fā)展。基于金屬穩(wěn)定同位素標記的ICP-MS檢測方法已被廣泛應用于生物分析領域中的蛋白質和核酸等生物活性分子的分析檢測中[9-11]。同時，由于該方法擁有出色的質量分辨率和強大的多元素同時檢測功能，可以有效避免常用光學方法中多波長激發(fā)和光譜重疊的問題[12-13]，使其在多組分檢測中具有非?？捎^的應用前景。在基于金屬穩(wěn)定同位素標記的ICP-MS分析策略中，元素標簽主要包含金屬離子標簽和金屬納米顆粒標簽兩大類。

1.2.1 金屬離子標簽

金屬離子標簽主要是指以金屬離子的形式與報告分子連接進行標記并實現信號的輸出，廣泛使用的是含1，4，7，10-四氮雜環(huán)十二烷-1，4，7，10-四乙酸(DOTA)或聚合戊酸(DPTA)等金屬螯合配體的大環(huán)化合物來裝載水溶液中的稀土金屬陽離子，然后再通過一些生物偶聯反應與寡核苷酸或抗體連接，來實現標記[14]，用于裝載金屬陽離子的大環(huán)化合物既有單個配體的也有含多個配體的[15]。常用的金屬離子標簽主要是稀土金屬元素，例如早期使用的銪離子(Eu3+)標記的鏈霉親和素[16]。

1.2.2 金屬納米顆粒標簽

與金屬離子標簽相比，金屬納米顆粒標簽可以得到更強的元素信號。因為一條寡核苷酸或者一個抗體只能連接一個螯合了金屬離子的大環(huán)化合物，也只能接上一個金屬納米顆粒。但一個金屬納米顆粒含有多個金屬原子，消解后在ICP-MS中可檢測到更強的信號[13，17]。研究表明，用金屬納米顆粒標簽取代用大環(huán)化合物裝載的稀土金屬離子標簽，可以有效地提高金屬穩(wěn)定同位素標記方法的靈敏度[18]。金、銀、鉑等穩(wěn)定金屬的納米顆粒是最常用的幾種納米顆粒標簽，另外近年來還發(fā)展出了鑭系納米顆粒、金屬元素量子點以及金屬納米簇等作為金屬納米顆粒標簽[19-22]。

2 核酸酶輔助的基于金屬穩(wěn)定同位素標記的ICP-MS檢測方法在生物分析中的應用

2.1 蛋白質檢測

基于金屬穩(wěn)定同位素標記的ICP-MS分析方法在蛋白質檢測中的應用，主要集中于對抗原抗體以及酶活性的檢測。根據不同酶識別和切割底物的特性，或者抗原抗體之間的相互作用，可以建立對酶活性或抗原抗體的檢測方法。例如在該方法被首次報導的研究中，利用了抗原抗體的經典三明治結構來捕獲促甲狀腺激素(TSH)，同時在抗體上修飾生物素，利用生物素與鏈霉親和素之間強烈的相互作用將修飾了鏈霉親和素的銪離子(Eu3+)與之連接，以將鑭系金屬元素Eu作為標簽元素通過ICP-MS檢測實現對TSH的定量檢測[16]。以及后來又利用金-硫鍵(Au-S)將AuNPs標記在抗體上用于抗原檢測[17]，這些都為之后的相關研究打好了基礎。

一種基于LA-ICP-MS(激光燒蝕-電感耦合等離子體質譜)的微陣列免疫測定方法在2007年被報導，將抗體與不同的金屬離子或納米顆粒偶聯，結合LA-ICP-MS能夠檢測具有微米級的空間分辨率的固體樣品的優(yōu)勢，可以在微陣列的每個點檢測到多種蛋白質[23]。根據金屬螯合大環(huán)化合物的原理，張新榮課題組又提出了一種基于金屬穩(wěn)定同位素標記的多種蛋白組合免疫分析方法(圖1)，該方法選擇了大環(huán)金屬螯合物SCN-DPTA去裝載不同的稀土金屬離子，并利用抗體-抗原反應進行特異性識別，實現了12種生物標志物蛋白的同時測定[24]。

圖1 a)SCN-DTPA裝載稀土元素標記上抗體流程示意圖；b)多組分蛋白組合免疫分析示意圖[24]Figure 1 a) Schematic diagram of SCN-DTPA loading with rare earth element-tagged antibodies；b) Schematic diagram of multi-component protein combinatorial immunoassay[24].

2009年，張新榮課題組提出了單顆粒ICP-MS(SP-ICP-MS)的檢測方法，將ICP-MS傳統的積分模式檢測替換為在時間分辨模式下記錄由等離子體炬中離子閃爍引起的瞬態(tài)信號來對目標物進行檢測[25]。在一定條件下，瞬態(tài)信號頻率可直接反應納米顆粒標簽的濃度，因此可以通過檢測瞬態(tài)信號頻率來量化被納米顆粒標記的抗體濃度。SP-ICP-MS方法的提出為金屬納米顆粒標簽提供了一種靈敏的讀出方法，為基于金屬穩(wěn)定同位素標記的ICP-MS檢測方法在生物分析中的應用提供了更多的可能性，由于SP-ICP-MS的優(yōu)異性能，研究人員們也已經發(fā)表了許多相關的研究工作[26-28]。

而對于酶活性的檢測，主要是基于酶自身的相關性質來建立方法，例如根據核酸外切酶Exo I可以從ssDNA的3末端進行剪切的能力(圖2)，LIU等[29]

圖2 a)Exo I介導的無標記ICP-MS法測定Exo I示意圖[29]；b)SP-ICP-MS檢測UDG活性方法示意圖[30]；c)無標記基于DNA模板化方法檢測CRISPR-Cas9示意圖[31]Figure 2 Schematic diagram a) Exo I-mediated Exo I detection by label-free ICP-MS；b) UDG activity detection by SP-ICP-MS；c) CRISPR-Cas9 detection based on label-free DNA-templated CuNPs method[31].

建立了一種長期穩(wěn)定的無標記ICP-MS方法用于測定Exo I酶。以及LI等[30]報道了一種基于單顆粒ICP-MS檢測模式(SP-ICP-MS)的尿嘧啶-DNA糖基化酶(UDG)活性檢測方法，該方法中利用了UDG能夠特異性識別和去除尿嘧啶以誘導DNA探針切割的能力，以及內切酶IV(Endo IV)對AP位點(無嘌呤/無嘧啶位點)的特異性剪切能力來釋放元素信號?；贑RISPR-Cas9系統切割目標核酸底物的性質，HU等[31]提出了一種基于DNA模板化的銅納米顆粒(CuNPs)的無標記方法用于檢測CRISPR-Cas9。

2.2 核酸檢測

與蛋白質檢測相比，核酸工具酶輔助的基于金屬穩(wěn)定同位素標記的ICP-MS生物分析方法在核酸檢測中的應用更為廣泛。HAN等[32]首次提出了關于巰基功能化的DNA與大環(huán)化合物共價結合來對DNA進行標記的方法(圖3a)。該方法利用DNA雜交反應進行特異性識別，結合磁珠快速分離的優(yōu)點，通過Y、La、Ce、Pr、Nd、Sm、Eu、Gd、Tb、Dy、Ho、Er、Tm、Yb和Lu的元素標簽實現了15個與臨床疾病相關的DNA靶標的同時測定，如圖3b所示。LUO等[33]將這種標記DNA的方法與DNA聚合酶和DNA連接酶輔助的核酸滾環(huán)擴增方法結合實現了對三種病毒DNA(HIV、HAV、HBV)的超靈敏同時測定。

圖3 基于巰基功能化DNA和大環(huán)化合物標記的多組分檢測方法示意圖。a)標記原理；b)檢測原理[32]；c)Endon IV輔助的AuNPs標記方法用于DNA檢測[34]；d)CRISPR-Cas12a輔助的AuNPs標記方法用于DNA檢測[35]Figure 3 Schematic diagrams of the multi-component detection method based on thiol-functionalized DNA and macrocycle tagging.a) Tagging principle；b) Detection principle；c) Endon IV-assisted labeling of AuNPs for DNA detection；d) CRISPR-Cas12a-assisted AuNPs-tagging for DNA detection[35].

巰基功能化的核酸也可與金納米顆粒通過Au—S鍵來進行標記，WANG等[34]利用這種標記方法與核酸內切酶IV(Endon IV)相結合，通過內標元素校正和AuNPs標記的DNA探針得到的比率型信號，提高了檢測結果的精確度，并成功應用到了DNA檢測中(如圖3c)。我們也將這種標記方法與CRISPR-Cas12a這種具有核酸酶功能的特殊體系對非目標單鏈DNA高效地反式剪切能力結合(如圖3d)，同時利用AuNPs在ICP-MS中可測得強信號的優(yōu)勢，建立了對于HIV-DNA的靈敏檢測方法，檢測限可低至amol[35]。

多種疾病相關microRNA的定量檢測對臨床診斷具有重要意義，基于金屬穩(wěn)定同位素標記的ICP-MS檢測方法具有強大的多元素測得功能，該方法也被應用到了一些疾病相關microRNA的多組分測定當中。ZHANG等[36]報告了一種多組分microRNA測定的方法，如圖4所示，他們將鑭系元素標記的巰基功能化的DNA探針，與雙鏈特異性核酸酶(DSN)可水解雙鏈DNA或DNA-RNA異質雙鏈中的DNA，并且不會切割ssDNA或RNA的特殊性能相結合，提出了一種可檢測的多個鑭系金屬元素標簽作為多重擴增方法用于多組分microRNA的檢測。當目標microRNA與DNA探針互補形成雙鏈后，DSN可對DNA探針進行剪切釋放出元素信號，同時也釋放出目標microRNA又可以進入新一輪的DSN剪切反應，如此循環(huán)重復可以釋放出大量的元素信號。

圖4 DSN輔助的鑭系元素標記方法用于microRNA多組分檢測[36]Figure 4 Schematic diagrams of DSN-assisted lanthanide-tagging method for multicomponent microRNA detection[36].

DNA酶(DNAzyme)與常見的核酸工具酶是蛋白質的本質不同，它是一種具有催化活性的DNA序列。DNA酶通常通過氧化底物、裂解DNA輸出生物信號。KANG等[37]將DNA酶和鑭系金屬元素標記方法結合，建立了對于3種疾病標志物的microRNA的進行同時檢測的生物分析方法。如圖5a所示，每條microRNA對應一個DNA酶的A部分和B部分、一個底物鏈和一種鑭系金屬元素標簽。三種不同的microRNA各自對應的底物鏈被固定在SA-MB上，在目標microRNA存在的情況下，組裝了三對DNA酶，它們可以與各自對應的microRNA雜交，隨后SA-MB上的底物鏈在Mg2+的催化作用下被這些DNA酶切割，連續(xù)釋放出帶有不同鑭系金屬元素標簽的DNA片段。經磁性分離后收集上清液中釋放出的鑭系金屬元素標簽，進行ICP-MS分析，即可實現多個microRNA的同時定量檢測。使用金屬穩(wěn)定同位素標記的ICP-MS檢測方法對于多組分同時定量，具有光譜干擾低，靈敏度高，選擇性好，對復雜基質抗性強等優(yōu)點。

圖5 a)基于DNA酶輔助的鑭系元素標記方法用于microRNA多組分檢測[37]；b)CRISPR-Cas12a輔助的鑭系元素標記生物分析方法用于Kana檢測[38]Figure 5 Schematic diagrams of a) DNAzyme-assisted lanthanide-tagging method for multicomponent microRNA detection[37]；b) CRISPR-Cas12a-assisted lanthanide-tagging bioanalytical methods for Kana detection[38].

2.3 小分子檢測

除了應用到核酸和蛋白質檢測中，基于金屬穩(wěn)定同位素標記的ICP-MS檢測方法還可與核酸適配體結合，用于一些小分子的定量檢測。例如，HU等[38]結合核酸適配體與目標物之間的特異性識別作用，采用巰基功能化的DNA和大環(huán)化合物共價結合的標記方法，建立了用于檢測野生魚樣本中卡那霉素(Kana)含量的檢測方法(如圖5b)?？梢酝ㄟ^這樣一些間接的方式實現對目標小分子的識別，再結合基于金屬穩(wěn)定同位素標記的ICP-MS檢測方法，來實現一些其他小分子的分析檢測。

3 結語

核酸工具酶輔助的金屬穩(wěn)定同位素標記的ICP-MS檢測方法逐漸在生物分析領域中占領一定的地位。對于多組分同時檢測，該方法是傳統光譜分析方法的有效代替品，甚至在靈敏度和分辨率方面比傳統光譜方法擁有更良好的性能。對于生物分析而言，在建立方法時如何降低生物基質的干擾也是需要考慮的因素，基于金屬穩(wěn)定同位素標記的ICP-MS檢測方法可以很好地滿足這一條件。

總之，核酸工具酶輔助的金屬穩(wěn)定同位素標記的ICP-MS檢測方法在生物分析中的應用潛力是不可忽視的，除了列在文中的這些生物分析方法以外，還有很多基于該方法的生物傳感平臺已經被大量報道。擁有質量分辨率高、基質干擾較小等優(yōu)點的ICP-MS檢測方法是生物分析領域發(fā)展研究中可靠的幫手。傳統光譜分析方法更適用于現場檢測、初步篩查等場景，而金屬穩(wěn)定同位素標記的ICP-MS檢測方法更適用于精準定量，都具有重要的研究價值和意義。