宋 玥 周天慧 張 萍 姚曉慧 劉麗萍* 韓丹丹

(1.河北大學(xué) 公共衛(wèi)生學(xué)院，河北 保定 071002；2.北京市疾病預(yù)防控制中心，食物中毒診斷溯源技術(shù)北京市重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100013；3.珀金埃爾默企業(yè)管理(上海)有限公司,上海 200131)

砷是公認(rèn)的致癌物，人群主要通過(guò)受污染的飲用水、食品、空氣等暴露砷[1]。長(zhǎng)期低劑量暴露砷，可罹患皮膚癌等多種疾病。當(dāng)土壤、水等環(huán)境中砷含量高時(shí)會(huì)對(duì)農(nóng)作物造成污染，食用受砷污染的食品將對(duì)健康造成嚴(yán)重危害。我國(guó)對(duì)食品、飲用水中砷的限量進(jìn)行了嚴(yán)格的規(guī)定。

食用菌以其獨(dú)特的美味成為人們?nèi)粘Ｏ矏?ài)的食品，研究表明食用菌易積累各種重金屬，文獻(xiàn)[2]報(bào)道食用菌極易富集砷。食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) GB 2762—2017《食品中污染物限量》中規(guī)定，食用菌中總砷限量為0.5 mg/kg，《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 食品中總砷及無(wú)機(jī)砷的測(cè)定》GB 5009.11—2014中砷的檢測(cè)方法有電感耦合等離子體質(zhì)譜法(ICP-MS)、氫化物原子熒光光譜法、銀鹽法。ICP-MS操作簡(jiǎn)便、靈敏度高，是目前元素分析最強(qiáng)有力的分析技術(shù)[3]，但也因其價(jià)格昂貴、氬氣消耗量高，限制了其廣泛使用；氫化物原子熒光光譜法雖廣泛應(yīng)用于不同的實(shí)驗(yàn)室[4]，但由于檢測(cè)原理的要求，樣品前處理時(shí)需將樣品中不同形態(tài)的砷全部消解為三價(jià)砷或五價(jià)砷，對(duì)于砷形態(tài)復(fù)雜的食用菌，樣品前處理繁瑣，消解時(shí)間長(zhǎng)，簡(jiǎn)便快捷的微波消解技術(shù)的使用受到限制；銀鹽法靈敏度低，操作煩瑣，適用性差。

石墨爐原子吸收光譜法具有靈敏度高、選擇性好等優(yōu)勢(shì)，廣泛應(yīng)用于食品中鉛、鎘的分析檢測(cè)。以往由于砷的空心陰極燈能量低，限制了石墨爐原子吸收測(cè)定砷的使用，隨著砷的高性能燈、無(wú)極放電燈的推出和使用，目前石墨爐原子吸收光譜法已應(yīng)用于食用油[5-6]、茶葉[7]、土豆[8]、保健品[9]、大米[10]、雞肉[11]、乳及乳制品[12]、高鹽食品[13]、天然藥材[14]等樣品中總砷的測(cè)定。食用菌中總砷超標(biāo)被屢屢報(bào)道[15]，研究表明不同食用菌中砷形態(tài)復(fù)雜[16-18]，本文采用微波消解-石墨爐原子吸收光譜技術(shù)對(duì)食用菌中總砷進(jìn)行分析研究，為不同實(shí)驗(yàn)室測(cè)定食用菌中總砷提供一種快速、準(zhǔn)確、經(jīng)濟(jì)的方法。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器與試劑

美國(guó)PerkinElmer公司PinAcle900T原子吸收光譜儀(附自動(dòng)進(jìn)樣器和石墨爐)，砷無(wú)極放電燈，iCAP RQ 型電感耦合等離子體質(zhì)譜儀、U3000型HPLC高效液相色譜儀、Dionex IonPac AS7 色譜柱(4 mm×250 mm)賽默飛世爾科技有限公司；Milli-Q Integral超純水處理系統(tǒng)(美國(guó)Millipore公司)，Mettler Toledo電子天平，TOPEX+ 微波消解儀、G-400趕酸儀(上海屹堯儀器科技發(fā)展公司)，Grinder HM100 研磨儀，德國(guó)MMM公司Venticell高溫烘箱。

砷標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液(100 mg/L，中國(guó)計(jì)量科學(xué)研究院)，硝酸(65%，德國(guó)Merck)，過(guò)氧化氫(30%，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司)，碳酸銨(優(yōu)級(jí)純)，硝酸鈀[Pd(NO3)2，1 g/L]，亞砷酸根As(Ⅲ，GBW08666)、一甲基砷酸(MMA，GBW08668)、二甲基砷酸(DMA，GBW08669)、砷酸根As(V，GBW08667)、砷甜菜堿(AsB，GBW08670)、砷膽堿(AsC，GBW08671)等砷形態(tài)標(biāo)準(zhǔn)溶液均購(gòu)于中國(guó)計(jì)量科學(xué)院。實(shí)驗(yàn)中所用試劑為優(yōu)級(jí)純，分析用水均為超純水。

1.2 樣品前處理

將市場(chǎng)購(gòu)買的食用菌(干劑)樣品去除不可食部分，粉碎研磨均勻后儲(chǔ)存于聚乙烯管中。稱取粉碎均勻的食用菌試樣0.25 g(精確到0.000 1 g)于微波消解罐中，加入6 mL硝酸和1 mL過(guò)氧化氫，預(yù)消解2 h，放入微波消解系統(tǒng)中按微波消解程序(見(jiàn)表1)進(jìn)行消解。消解完全后于140 ℃趕酸至0.5 mL，用超純水定容至25 mL，混勻待測(cè)，同時(shí)做空白實(shí)驗(yàn)。

表1 微波消解程序Table 1 Microwave digestion procedure

1.3 儀器工作條件

測(cè)定時(shí)采用塞曼背景校正，硝酸鈀(1 g/L)為基體改進(jìn)劑，進(jìn)樣體積為5 μL，樣品進(jìn)樣體積為20 μL，石墨爐原子吸收光譜儀的工作條件設(shè)定為：波長(zhǎng)193.7 nm，燈電流(無(wú)極放電燈)440 mA，狹縫 0.7 nm。石墨爐升溫程序見(jiàn)表2。

表2 石墨爐升溫程序Table 2 Furnace program

2 結(jié)果與討論

2.1 樣品前處理方法的選擇

測(cè)定總砷時(shí)樣品前處理方法主要有微波消解法、電熱板消解法、干灰化法、石墨消解法。采用原子熒光光譜法測(cè)定砷時(shí)由于原理所限，不同樣品中砷的存在形式不同，一般選擇電熱板消解、干灰化法或石墨消解法，保證樣品消解完全至關(guān)重要。石墨爐原子吸收光譜法測(cè)定樣品中總砷時(shí)，其原子化階段的高溫可以將不同形態(tài)的砷原子化。由于干灰化法時(shí)需要加入灰化輔助劑，會(huì)引入過(guò)多的干擾，避免選用。電熱板和石墨消解法操作繁瑣，需要加入大量強(qiáng)酸，且消化時(shí)間長(zhǎng)；微波消解法操作簡(jiǎn)單，消解能力強(qiáng)，用時(shí)短[19]。本文選擇微波消解進(jìn)行樣品前處理，由于樣品消解后消解液中的酸濃度較高，測(cè)定時(shí)會(huì)導(dǎo)致較高的背景，且也會(huì)對(duì)石墨管造成不可逆的損壞，因此消解后要進(jìn)行趕酸處理[20]。經(jīng)對(duì)趕酸溫度進(jìn)行優(yōu)化，結(jié)果表明趕酸溫度低于120 ℃時(shí)，趕酸時(shí)間過(guò)長(zhǎng)，影響工作效率；趕酸溫度高于150 ℃時(shí)，不好把控趕酸的終點(diǎn)，也會(huì)造成砷的損失。經(jīng)實(shí)驗(yàn)選擇趕酸溫度為135～145 ℃，3 h可完成趕酸過(guò)程。

2.2 樣品預(yù)處理選擇

實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)個(gè)別干劑食用菌樣品基質(zhì)復(fù)雜，背景吸收較高，無(wú)法準(zhǔn)確測(cè)定砷含量。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)消解液中殘存少許無(wú)機(jī)鹽，可能為樣品預(yù)處理不完全所致，帶入了外源性的土壤顆粒等雜質(zhì)，影響了測(cè)定的準(zhǔn)確性，經(jīng)對(duì)干劑食用菌進(jìn)行泡發(fā)，除去根部粘帶的土壤顆粒等雜質(zhì)，可消除此現(xiàn)象。建議干劑食用菌預(yù)處理時(shí)一定要去除食用菌根部粘帶的雜質(zhì)，取可食部分進(jìn)行預(yù)處理，粉碎均勻，保障樣品的代表性。

2.3 基體改進(jìn)劑的選擇

基體改進(jìn)劑不僅能改善基體性能，使基體轉(zhuǎn)化為易揮發(fā)的化學(xué)形態(tài)，以利于在灰化階段驅(qū)盡，且能改善被測(cè)元素的性能，使之轉(zhuǎn)化為更穩(wěn)定或更易揮發(fā)的形態(tài)，以使用更高的灰化溫度除盡基體雜質(zhì)而被測(cè)元素又不損失，或先于基體揮發(fā)以避免基體的干擾。砷是易揮發(fā)元素，需要加入基體改進(jìn)劑，提高灰化溫度，降低背景干擾。鈀和鎳都可以提高灰化溫度，但是鈀的靈敏度比鎳高[21]。硝酸鈀是石墨爐原子吸收光譜法測(cè)定砷的常用基體改進(jìn)劑[22-24]，其能與待測(cè)組分砷結(jié)合成更穩(wěn)定的化合物，有效提高灰化溫度，降低背景干擾。本實(shí)驗(yàn)選擇硝酸鈀為基體改進(jìn)劑，測(cè)試了無(wú)基體改進(jìn)劑和加入基體改進(jìn)劑硝酸鈀時(shí)食用菌消解液的吸光度，結(jié)果見(jiàn)圖1，不加基體改進(jìn)劑時(shí)，待測(cè)元素?fù)p失較多，背景峰很高，無(wú)法準(zhǔn)確測(cè)定。

圖1 未加基體改進(jìn)劑和加入基體改進(jìn)劑時(shí)樣品消解液的吸收峰和背景峰Figure 1 The absorption peak and background peak of sample digestion solution without and with matrix improver.

對(duì)基體改進(jìn)劑硝酸鈀濃度進(jìn)行優(yōu)化，分別配制0.1、0.5、1.0、1.5和2.0 g/L的硝酸鈀溶液進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，結(jié)果見(jiàn)圖2和圖3，硝酸鈀作為基體改進(jìn)劑時(shí)，濃度在0.5、1.0、1.5和2.0 g/L時(shí)對(duì)吸光度的影響差別不大，但是1 g/L的峰形圖最好，因此本研究選用1 g/L硝酸鈀作基體改進(jìn)劑。

圖2 基體改進(jìn)劑濃度與吸光度曲線圖Figure 2 Matrix improver concentration and absorbance curve.

圖3 不同濃度基體改進(jìn)劑中食用菌樣品消解液的峰形圖對(duì)比Figure 3 Comparison of peak patterns of digestion solution of edible mushrooms samples in different concentrations of matrix improvers.

2.4 石墨爐升溫程序的優(yōu)化

灰化溫度和原子化溫度是石墨爐原子吸收光譜法分析中的兩個(gè)關(guān)鍵溫度。

2.4.1 灰化溫度的選擇

灰化的作用是盡量將與被測(cè)元素共存的基體除去，避免在原子化階段對(duì)目標(biāo)元素的原子化效率產(chǎn)生影響，同時(shí)防止基體成分在測(cè)定波長(zhǎng)區(qū)域產(chǎn)生非特征的背景吸收?；一瘻囟冗^(guò)高會(huì)造成被測(cè)元素的損失，使方法靈敏度降低；灰化溫度過(guò)低，會(huì)造成背景偏高，且對(duì)原子化階段產(chǎn)生干擾。

分別在800～1 400 ℃測(cè)定某食用菌樣品，如圖4和圖5所示，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，灰化溫度在1 200 ℃時(shí)吸光度高，峰形較好，因此選擇1 200 ℃作為灰化溫度進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

圖4 灰化溫度對(duì)吸光度的影響Figure 4 The effect of pyrolysis temperature on absorbance.

圖5 不同灰化溫度的峰形圖對(duì)比Figure 5 Comparison of peaks at different ashing temperatures.

2.4.2 原子化溫度的選擇

原子化階段的目的是將處于分子或離子狀態(tài)的目標(biāo)元素通過(guò)熱分解的作用使其變成處于基態(tài)的自由原子。原子化溫度過(guò)高，導(dǎo)致噪音增加及石墨管壽命降低；原子化溫度過(guò)低，會(huì)使吸收峰變的平坦且吸光度值變小。

分別在1 900～2 400 ℃測(cè)定某食用菌樣品，如圖6和圖7所示，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，原子化溫度在2 300 ℃時(shí)吸光度較高，峰形較好，因此選擇2 300 ℃為原子化溫度。

圖6 原子化溫度對(duì)吸光度的影響Figure 6 The effect of atomic temperature on absorbance.

圖7 不同原子化溫度的峰形圖對(duì)比Figure 7 Comparison of peaks at different atomization temperatures.

2.5 方法學(xué)考察

2.5.1 線性范圍及檢出限

采用砷標(biāo)準(zhǔn)溶液逐級(jí)稀釋后分別配制成濃度為0、2.0、4.0、8.0、10.0、12.0、16.0、20.0和30.0 μg/L的標(biāo)準(zhǔn)系列溶液進(jìn)行線性范圍實(shí)驗(yàn)，線性方程見(jiàn)表4。采用空白溶液測(cè)定檢出限，測(cè)定11次空白溶液，根據(jù)檢出限計(jì)算公式LOD=3SD/b(b為工作曲線斜率)和定量限計(jì)算公式LOQ=10SD/b(b為工作曲線斜率)測(cè)得檢出限為0.4 μg/L，定量限為1.30 μg/L，當(dāng)樣品取樣量為0.25 g，定容體積為25 mL時(shí)，方法檢出限為0.04 mg/kg，方法定量限為0.13 mg/kg，結(jié)果見(jiàn)表3。

表3 線性范圍及檢出限Table 3 Linear range and detection limit

2.5.2 方法的準(zhǔn)確性和重現(xiàn)性實(shí)驗(yàn)

以精密度考察方法的重現(xiàn)性，以加標(biāo)回收實(shí)驗(yàn)和有證標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)考察方法準(zhǔn)確性。

2.5.2.1 精密度和加標(biāo)回收實(shí)驗(yàn)

選用市售香菇和銀耳，分別添加三個(gè)不同濃度水平的砷標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行加標(biāo)回收和精密度實(shí)驗(yàn)，實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示三個(gè)濃度水平的加標(biāo)回收率均在80.6%～104%。三個(gè)濃度水平的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差RSD均小于6.6%，結(jié)果見(jiàn)表4。

表4 香菇、銀耳加標(biāo)回收率和精密度Table 4 Spiked recovery and precision of lentinus edodes and tremella (n=6) /(mg·kg-1)

2.5.2.2 實(shí)際樣品的精密度

選取三個(gè)不同濃度砷含量的食用菌樣品進(jìn)行方法精密度考察，平行制備6個(gè)樣品，測(cè)定總砷含量，結(jié)果見(jiàn)表5，RSD值均小于5.0%。

表5 實(shí)際樣品精密度測(cè)定結(jié)果Table 5 Actual sample precision measurement results (n=6) /(mg·kg-1)

2.5.2.3 有證標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)測(cè)定

由于沒(méi)有含砷高的食用菌基體標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)，采用其他基質(zhì)的有證標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)考察方法的準(zhǔn)確性，測(cè)定結(jié)果見(jiàn)表6。結(jié)果顯示，測(cè)定值均在標(biāo)準(zhǔn)值范圍內(nèi)。

表6 標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)測(cè)定結(jié)果Table 6 Standard material determination results(n=6) /(mg·kg-1)

2.6 實(shí)際樣品的分析

采集市售食用菌樣品，按所建方法進(jìn)行樣品中總砷含量測(cè)定，結(jié)果如表7所示。

表7 實(shí)際樣品測(cè)定結(jié)果Table 7 Actual sample determination results

GB 2762—2017規(guī)定，食用菌及其制品總砷限量指標(biāo)為0.5 mg/kg，編號(hào)為Y3、Y6、Y7、Y8的食用菌已超出限量范圍，屬超標(biāo)樣品。由于石墨爐測(cè)定砷含量線性范圍較窄，對(duì)于砷含量較高，超過(guò)標(biāo)準(zhǔn)曲線范圍的樣品應(yīng)稀釋到標(biāo)準(zhǔn)曲線范圍內(nèi)再進(jìn)行測(cè)定，以得到準(zhǔn)確可靠的結(jié)果。如圖8和圖9所示，樣品稀釋后的背景峰更低，吸收峰形更好。

圖8 Y6與Y6稀釋5倍后的吸收峰和背景峰對(duì)比圖Figure 8 Contrast diagram of absorption peak and background peak of Y6 and Y6 diluted by 5 times.

圖9 Y7與Y7稀釋5倍后的吸收峰和背景峰對(duì)比圖Figure 9 Contrast diagram of absorption peak and background peak of Y7 and Y7 diluted by 5 times.

2.7 砷含量高的食用菌樣品分析

為了研究微波消解后消解液中砷的形態(tài)，選取5個(gè)砷含量超過(guò)0.4 mg/kg的樣品經(jīng)微波消解后的消解液過(guò)0.45 μm濾膜后，采用高效液相色譜-電感耦合等離子體質(zhì)譜法(HPLC-ICP-MS)測(cè)定其砷形態(tài)(色譜條件：Dionex IonPac AS7色譜柱；流動(dòng)相A相：10 mmol/L碳酸銨；B 相：100 mmol/L碳酸銨；洗脫方式：梯度洗脫)。結(jié)果見(jiàn)圖10，樣品編號(hào)為Y6和Y8的食用菌樣品消解液中AsB含量高，為主要砷存在形式，樣品編號(hào)為Y3、Y7和Y9的食用菌樣品消解液As(V)含量高，為主要砷存在形式。

實(shí)驗(yàn)表明，不同的食用菌樣品經(jīng)微波消解趕酸后，砷形態(tài)仍然復(fù)雜，若采用原子熒光光譜法測(cè)定該類樣品，不能采用微波消解進(jìn)行樣品前處理，否則會(huì)造成測(cè)定結(jié)果偏低，特別是編號(hào)Y6和Y8食用菌，可能會(huì)出現(xiàn)假陰性。而采用石墨爐原子吸收光譜法測(cè)定總砷時(shí)可以采用微波消解進(jìn)行樣品前處理，快速準(zhǔn)確測(cè)定有機(jī)砷含量高的食用菌樣品中總砷含量。

圖10 食用菌樣品砷形態(tài)色譜圖(a—Y3，b—Y6，c—Y7，d—Y8，e—Y9)Figure 10 Arsenic chromatogram of edible mushrooms samples(a—Y3，b—Y6，c—Y7，d—Y8，e—Y9).

3 結(jié)論

采用微波消解-石墨爐原子吸收光譜法測(cè)定食用菌中總砷含量。通過(guò)優(yōu)化灰化溫度、原子化溫度、基體改進(jìn)劑的濃度等條件，與HGAFS相比，該方法在樣品前處理時(shí)無(wú)需將食用菌樣品中不同砷形態(tài)全部轉(zhuǎn)化為無(wú)機(jī)砷，大大縮短了食用菌樣品前處理的時(shí)間。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，方法具有操作簡(jiǎn)便、經(jīng)濟(jì)、準(zhǔn)確、可靠等優(yōu)點(diǎn)，適用于食用菌中總砷含量的測(cè)定。但方法線性范圍較窄，對(duì)于砷含量高的樣品需稀釋到標(biāo)準(zhǔn)曲線范圍內(nèi)測(cè)定才能保證測(cè)定的準(zhǔn)確性。