謝孔平, 楊適, 毛冀, 魯松

1.四川省自然資源科學研究院，四川 成都 610015；

2.野生植物四川省科技資源共享服務平臺，四川 成都 610015；

3.峨眉山生物多樣性四川省野外科學觀測研究站，四川 峨眉山 610041

金線蓮為蘭科開唇蘭屬（Anoectochilus）多年生珍稀中草藥。據中國植物志記載我國有20種，2變種，產于我國西南部至南部[1]。另外根據多數學者的研究，認為開唇蘭屬和齒唇蘭屬（Odontochilus）在形態(tài)上區(qū)別比較小，主張將齒唇蘭屬合并入開唇蘭屬[1]。近些年金線蓮作為藥用植物盛于閩臺，在當地有“藥中之王”的美稱，又被人稱為“鳥人參”，民間治療范圍極廣[2]。據《福建藥物志》記載其性味平、甘，清熱涼血、祛風利濕，主治咯血、支氣管炎、腎炎、膀胱炎、糖尿病，乳糜尿，血尿，風濕性關節(jié)炎，小兒急驚風，毒蛇咬傷等[3-5]。而據《中國本草原色圖譜》記載臺灣金線蓮性味性平微寒, 味甘微苦無毒，入肝肺胃心脾諸經，功能具解熱、清火退火降血壓功能, 主療肝脾病，肺腫病, 遺精遺漏諸病, 兼治胸痛胰痛咳嗽血虛血熱吐血, 肝火小兒發(fā)育不良及毒蛇咬傷等[3,6]。目前金線蓮的藥用及商用價值逐漸被人們認可，逐漸由閩臺地區(qū)向全國其他省份發(fā)展，許多地區(qū)都有開發(fā)種植。現在市場最多的商品開發(fā)種主要為常被稱作福建金線蓮的花葉開唇蘭（A. roxburghii）和常被市場稱為銀線蓮的臺灣開唇蘭（A. formosanus）[2]。前期調查研究發(fā)現在廣西、浙江、云南、四川、貴州等地都有野生種群也有被開發(fā)銷售，常見的種有峨眉金線蘭（Anoectochilus emeiensis）、浙江金線蘭（A. zhejiangensis）、滇越金線蘭（A. chapaensis）、滇南開唇蘭（A. burmannicus）等。生產銷售中常把上述不同種不同產地的金線蓮統(tǒng)稱為金線蓮[2]。

峨眉金線蓮的研究較少，目前有報道的有峨眉金線蓮的組織培養(yǎng)等方面的工作[2,7]。金線蓮遺傳多樣性的研究在福建金線蓮中已有研究，但峨眉金線蓮此方面的工作仍屬空白，因此亟需開展此方面的研究。近些年各種分子標記技術的快速發(fā)展為開展峨眉金線蓮的遺傳多樣性研究提供了很好的支持，其中ISSR分子標記技術在福建金線蓮和臺灣金線蓮不同種群，不同產地，不同品系的鑒定等方面都表現出了較好的結果，但在峨眉金線蓮中還未得到驗證。

ISSR分子標記技術基于PCR擴增，使用微衛(wèi)星引物產生多態(tài)位點標記的技術，相比較于其他分子標記手段具有操作簡單、多態(tài)性高、重復性高的優(yōu)點且不需要預知基因組序列[8-11]。近些年在多種植物中ISSR的實驗技術在遺傳多樣性的分析中發(fā)揮了比較重要的作用[12-15]。研究擬對影響峨眉金線蓮ISSRPCR反應體系的5個因素（TaqDNA聚合酶，dNTPs，Mg2+，引物和DNA模板含量）利用正交試驗設計進行優(yōu)化分析，另外對優(yōu)化后的體系通過梯度PCR的方法篩選退火溫度（Tm），以解決由于ISSR實驗中引物序列單一多種因素會干擾實驗結果的問題，從而可以建立峨眉金線蓮種群遺傳多樣性ISSRPCR的最佳反應體系。

1 實驗材料

所用試驗所用的峨眉金線蓮（A. roxburghii）材料皆是2015年野外采集的野生資源，移植在峨眉山生物資源實驗站種質資源圃內。同時采集不同種群的蒴果以常規(guī)組培方法進行組織培養(yǎng)，所用配方參考魯松等[7]。待成苗長至8 cm左右采集其成熟葉片用作體系優(yōu)化、退火溫度篩選等。引物由哥倫比亞大學公布的ISSR反應體系引物序列中選擇，所選擇的引物序列為ISSR834，由成都擎科生物科技有限公司合成，序列為∶5'-AGAGAGAGAGAGAGAGYT-3'。DNA提取所用的常規(guī)生物耗材購自成都科龍化工有限公司，PCR體系構建所需的酶、DL2000 DNA Marker及電泳驗證所用的瓊脂糖等均購自TaKaRa公司。

2 實驗方法

2.1 DNA提取

峨眉金線蓮葉片DNA 的提取采用改良CTAB 法及采用天根生化科技有限公司的植物總DNA提取試劑盒提取，用核酸蛋白含量測定儀和10 g·L-1瓊脂糖電泳檢測DNA濃度和純度，凝膠成像系統(tǒng)觀察提取結果，然后將符合試驗要求的模板DNA濃度稀釋為10 ng/μL，儲存于-20°C冰箱中冷藏備用。所用檢測凝膠成像系統(tǒng)及后續(xù)PCR擴增結果分析所用凝膠成像系統(tǒng)均為Gel Doc EZ Imager（Bio-Rad）。

2.2 PCR擴增與體系正交實驗

正交試驗采用5因素4水平的設計進行篩選L16（45），對引物ISSR834、Taq 酶濃度、模板DNA含量、dNTPs、Mg2+進行篩選，具體含量見表1和表2。采用總體積為25 μL的反應體系，包含了2 μL的10× PCR Buffer， ddH2O 補足最終體積。本實驗中應用了Bio-Rad公司的C1000 Touch Thermal Cycler型號PCR儀。其反應程序設置為：94°C，變性5 min；94°C，變性45 s；53°C，退火45 s；72°C，延伸1 min 45 s，共45個循環(huán)；72°C，變性10 min。利用2%瓊脂糖凝膠電泳檢測擴增產物，凝膠成像系統(tǒng)拍照分析。之后對電泳結果進行分析，其中電泳條帶數量最多、清晰度高和背景低的最佳組合記16分，最差組合記1分，統(tǒng)計各個組合的評分數，然后對評分進行極差分析[10-11]。

2.3 退火溫度（Tm）的確定

采用德國Eppendorf Mastercycler X50梯度PCR儀梯度進行最佳退火溫度（Tm）的確定，設定退火溫度為50°C~60°C，采用上述正交試驗中篩選出的最優(yōu)反應體系，對Tm進行梯度測驗。由PCR儀自動生成7個溫度梯度[10,11]。

2.4 對優(yōu)化的ISSR-PCR擴增體系的驗證

根據實驗分析結果，獲得最佳反應體系和最適退火溫度（Tm），用引物ISSR834對12份不同種群的野生峨眉金線蓮材料進行ISSR-PCR擴增，從而驗證最終的ISSR優(yōu)化擴增體系。

表1 ISSR-PCR反應體系正交設計因素及水平Tab.1 Level of ISSR-PCR system factors in orthogonal design

表2 ISSR-PCR反應體系L16（45）正交設計及直觀分析表Tab.2 L16（45） orthagonal design for ISSR-PCR and intuitive analysis

3 結果與分析

3.1 ISSR-PCR擴增結果分析

圖1-a為本實驗16個ISSR-PCR正交試驗的結果，由圖可見，不同的處理間DNA模板含量、Taq酶的濃度、dNTPs及Mg2+的濃度不同而導致PCR試驗的擴增結果有比較明顯的差異，主要表現在擴增條帶的多態(tài)性、特異性、亮度及清晰度等方面。在16個反應體系中，多態(tài)性低而且主帶不是很明顯的有組合1、2、3、10和14；部分條帶背景界限模糊、有些條帶比較微弱的組合有5、11、12、13及16；條帶強度比較高、多態(tài)性好、且條帶界限比較分明的是組合4與7；其中按照評分標準，評分最高的是組合4，由圖可見其條帶明亮的最多、界限比較明顯，多態(tài)性最好。綜合各種因素，最終得到的峨眉金線蓮ISSR-PCR正交試驗總體積25 μL的最佳反應體系中各成分的組成為：2.0 μL 10× Buffer、40 ng DNA模板、0.4 μmol·L-1引物、0.4 mmol·L-1dNTPs、2.0 mmol·L-1Mg2+及0.8 U Taq DNA 聚合酶。

3.2 極差分析

表2為峨眉金線蓮ISSR-PCR實驗以834為引物的各因素的極差分析結果，表明各因素對PCR擴增體系的影響程度和極差的大小成正比。不同因素的影響程度從引物的濃度、TaqDNA聚合酶含量、Mg2+含量、DNA模板的濃度、dNTPs依次從大到小排列。擴增結果最為理想，評分最高的為組合4。

3.3 退火溫度（Tm）的優(yōu)化結果

圖1-b為以上述組合4的體系即最佳PCR反應體系的正交試驗結果，以834為引物，進行最佳退火溫度（Tm）的篩選。表明在50°C~60°C的溫度梯度范圍內，PCR實驗結果隨著退火溫度的不同而有不同的表現。且隨著退火溫度的逐漸升高，部分擴增條帶逐漸清晰，而且界限比較明顯，數量也逐漸增多，在退火溫度為56.5°C時擴增的結果表現最好，而超過56.5°C后部分條帶逐漸轉弱，數量變少，在最高溫度60°C時無擴增條帶出現，而在退火溫度較低的情況下，部分條帶較暗，數量較少。因此，峨眉金線蓮ISSR-PCR擴增實驗的最佳退火溫度為56.5°C。綜上，將擴增程序確定為：94°C，變性5 min；94°C，變性45 s；56.5°C，退火45 s；72°C，延伸1 min 45 s，共45個循環(huán)；72°C，變性10 min。

圖1 1-a：峨眉金線蓮ISSR-PCR正交試驗電泳圖；1-b：引物834退火溫度篩選；1-c:引物834對12份峨眉金線蓮的ISSR-PCR擴增Fig.1 Fig.1-a: Electrophoresis diagram of ISSR-PCR orthogonal test of Anoectochilus omeiensis; 1-b：Selection of annealing temperature of primer 834; 1-c: ISSR-PCR amplification of 12 Anoectochilus omeiensis samples with primer 834.

3.4 最佳反應體系的驗證

由圖1-c所示，采用引物ISSR834對其他12份不同種群的峨眉金線蓮種質材料進行了擴增，以驗證和檢測上述優(yōu)化的峨眉金線蓮ISSR-PCR反應體系和最佳退火溫度。結果表明，12個不同種群的野生峨眉金線蓮葉片DNA為模板的實驗擴增條帶均能夠表現出非特異性擴增條帶比較少、清晰明顯、界限分明、多態(tài)性高的特點。這證明了本實驗優(yōu)化的體系有較強的穩(wěn)定性和較高的可靠性，該體系可以用于后續(xù)的峨眉金線蓮及開唇蘭屬植物的野外種群的遺傳多樣性分析研究。同時將該體系應用于其他引物，如807，811，822，827，841等，除重新優(yōu)化退火溫度外，該體系的擴增都獲得了良好的效果。

3.5 834引物對不同種群的鑒定結果

引物834（見圖1-c）對峨眉金線蓮12個野生種群的分析結果顯示共具有4條多態(tài)性條帶，分別位于1 600 bp、1 450 bp、860 bp及630 bp。其中1 450 bp條帶為種群2所特有，而1 600 bp為種群1和2所特有，860 bp條帶為種群8所特有，630 bp條帶可以較好地把12個種群分為兩大組1，2，6，8等為一組，剩余地8個種群為一組。且上述4個條帶強度都較強。另外630 bp條帶兩大組中1，2，6，8組樣品皆表現為圓葉型，其余8組皆表現為橢圓且?guī)Ъ奔庑腿~，就上述12個種群的分析看630 bp為圓葉種群的特有條帶。綜合分析來看834引物在峨眉金線蓮野生種群的擴增條帶多態(tài)性較高，可以用于后續(xù)不同種群不同表型的峨眉金線蓮種群的遺傳多樣性分析。

4 討論

ISSR-PCR的實驗方法，通常以1-4個堿基串聯(lián)組成的16-18個重復微衛(wèi)星序列和幾個非重復的錨定堿基為引物，提高了PCR擴增反應的專一性，同時又具有成本低、穩(wěn)定性及重復性好等特點，能比較好地揭示實驗物種地遺傳多樣性特點，故而被很多科研人員采用。但是作為一種基于PCR的分子標記實驗技術，其實驗結果往往會受到多種因素的影響，而且在不同科屬的植物中也有比較大的差異，甚至同一屬不同種之間都會有很大的不同。在用ISSR-PCR的實驗方法進行遺傳多樣性分析時常常需要獲得適合不同植物擴增的最優(yōu)反應體系。單因素和正交試驗設計相結合的方法常被用來優(yōu)化ISSRPCR的反應體系，近些年此類的研究較多。其中常采用梯度試驗的方法來進行單因素試驗設計，以探索單個因素的最適條件，如張福生等之前對金線蓮的ISSR-PCR最佳反應體系優(yōu)化就采用了此種方法[9,11,16]。但此種方法需要擴增多次，所需時間精力較大，會增加不少成本而且不能兼顧考察各個因素之間的交互影響。因此許多學者采用正交試驗的設計方法來探索最優(yōu)體系，如唐軍榮等就采用了此種方法來探索金線蓮的最優(yōu)ISSR-PCR反應體系[17]，此種方法可以兼顧各個影響因子的交互作用，許多研究人員在多種植物中都采用了此種方法來探索ISSR的最優(yōu)體系，如：唐楠等在白芥（Sinapis alba），黃曉慧等在蘭屬（Cymbidium），陳云霞等在銀縷梅（Shaniodendron subaequale），劉玲在桑屬（Morus），田霞在葛縷子（Carum carvi）等植物中都采用了此法[18-22]。

根據極差分析結果，引物濃度是影響峨眉金線蓮ISSR-PCR擴增結果最大的因素，這與陳云霞等在銀縷梅，朱成豪等在鱗尾木（Lepionurus sylvestris），錢前等在黑果枸杞（Lycium ruthenicum）中的結果一致[20,23,24]，引物的濃度高低對PCR擴增產物的產量及PCR反應的特異性都有影響。這個結果與唐軍榮等在金線蓮中的結果不一致，他們的結果顯示Taq酶的濃度是影響因素最大的。本實驗中Taq酶對峨眉金線蓮ISSR-PCR擴增結果的影響僅次于引物濃度，Taq酶在PCR實驗中往往關系著實驗的成敗，是擴增反應的催化劑，其濃度的高低會影響擴增效率及非特異性條帶的產生，如彭慧等在異鱗石山棕（Guihaia heterosquama），經建永等在歐洲李（Prunus domestica），唐雨晨等在藜蘆（Veratrum nigrum），高慧新等在褐苞薯蕷（Dioscorea persimilis）中都發(fā)現Taq酶的濃度是影響因素最大的[14,25-27]。Mg2+濃度的影響在本實驗中次于Taq酶，Mg2+濃度的大小會對PCR擴增產物產生直接的影響，其濃度的高低一是可以影響酶的活性，另外還可以影響DNA模板與引物結合的效率，如郭傲等在無花果（Ficus carica），任雪羽等在木槿（Hibiscus syriacus），陳曦等在藍花丹（Plumbago auriculata），田霞等在藏茴香（Carum carvi）中都發(fā)現Mg2+濃度的大小是影響ISSRPCR擴增效果最大的因素[15,22,28,29]。DNA模板的含量及質量也關系著PCR實驗的成敗，但在本實驗的極差分析結果顯示其影響相對較小，這與黃曉慧等在蘭屬，丁雯等在酸棗（Ziziphus jujubavar.spinosa），黃旭萍等在山烏桕（Triadica cochinchinensis），劉玲等在桑屬（Morus）中都發(fā)現DNA模板濃度的高低是影響ISSR-PCR擴增效果最大的因素的結果不同[12,19,21,30]。相比較于其他因素，dNTPs的含量在峨眉金線蓮ISSR-PCR極差分析值最小，dNTPs是ISSR-PCR反應的原材料之一，其濃度的高低可以影響PCR的錯配及產物的合成效率，唐楠等在白芥，林丹等在云南沉香（Aquilaria yunnanensis），羅湘等在龍珠果（Passiflora foetida），張婉茹等在稗草（Echinochloa crusgalli）中都發(fā)現dNTPs濃度的高低是最大的影響因素[13,18,31,32]。

引物的退火溫度（Tm）是影響擴增反應的另一重要因素[33]，本實驗最終確定了引物834在峨眉金線蓮的ISSR-PCR反應中的最適退火溫度為56.5°C，適宜的引物退火溫度顯著增加擴增條帶數，條帶的清晰度及特異性。這與張福生等的結果不同，可能與所采用的不同種材料有關。

綜上所述，利用5因素4水平的正交實驗探討了各因素的不同水平對峨眉金線蓮ISSR-PCR反應結果的影響，建立了穩(wěn)定且重復性好的ISSR-PCR反應體系，即在25 μL體系中含：40 ng DNA模板、0.4 μmol·L-1引物、0.4 mmol·L-1dNTPs、2.0 mmol·L-1Mg2+、0.8 U Taq DNA 聚合酶、2.0 μL 10× Buffer。同時篩選了最適的退火溫度（Tm），提出適合峨眉金線蓮的ISSR-PCR實驗程序為：94°C，變性5 min；94°C，變性45 s；56.5°C，退火45 s；72°C，延伸1 min 45 s，共45個循環(huán)；72°C，變性10 min。該體系對以ISSR分子標記為手段來分析峨眉金線蓮的野生種群的遺傳多樣性提供了基礎，同時也為同屬的其他植物有參考價值。