丁 寧 楊瑩瑩 仇志峰 宋志文#

(1.青島理工大學(xué)環(huán)境與市政工程學(xué)院，山東 青島266520；2.山東省調(diào)水工程運(yùn)行維護(hù)中心，山東 青島266111)

細(xì)菌是水體的重要組成部分，其群落結(jié)構(gòu)組成與水環(huán)境因子相互影響、相互作用，并且在生物地球化學(xué)循環(huán)中發(fā)揮著重要作用，了解細(xì)菌群落的時(shí)空變化是預(yù)測(cè)和控制自然與工程系統(tǒng)中細(xì)菌功能的必要前提。飲用水系統(tǒng)中的細(xì)菌與水的自?xún)裟芰γ芮邢嚓P(guān)，并可能對(duì)公共衛(wèi)生安全產(chǎn)生影響[1]。細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)在一定程度上能夠反映水質(zhì)情況[2]，如藍(lán)細(xì)菌過(guò)度繁殖可能會(huì)引起“水華”[3]，而黃桿菌屬(Flavobacterium)能夠分解有機(jī)物改善水質(zhì)[4]。因此，探究飲用水水源地水體中細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)組成與環(huán)境因子的相關(guān)性對(duì)水環(huán)境保護(hù)與供水安全具有重要意義。

引黃濟(jì)青工程是將黃河水引向青島的跨流域調(diào)水工程，自2014年4月開(kāi)始與南水北調(diào)東線(xiàn)聯(lián)合運(yùn)行，實(shí)現(xiàn)黃河水和長(zhǎng)江水雙水源調(diào)度。棘洪灘水庫(kù)是引黃濟(jì)青工程中唯一的調(diào)蓄水庫(kù)，并且是亞洲最大的平原圍壩型水庫(kù)，為青島市提供90%以上居民生活用水，是青島市最重要的飲用水水源地。目前關(guān)于棘洪灘水庫(kù)的研究主要集中在浮游生物群落動(dòng)態(tài)[5]和氮磷營(yíng)養(yǎng)鹽[6]等方面，對(duì)細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)研究較少。相對(duì)于其他季節(jié)，春季棘洪灘水庫(kù)水體理化因子變化明顯，外源性氮營(yíng)養(yǎng)鹽增加，總磷濃度低[7-8]，浮游植物優(yōu)勢(shì)類(lèi)群演變復(fù)雜，部分進(jìn)入休眠或死亡狀態(tài)[9]，微生物種類(lèi)少，易受環(huán)境影響。因此分析春季棘洪灘水體細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)及影響因素更為重要。

本研究以棘洪灘水庫(kù)為研究對(duì)象，對(duì)春季進(jìn)水口和出水口斷面進(jìn)行采樣，分析細(xì)菌群落的α多樣性和β多樣性變化，研究細(xì)菌群落在門(mén)和屬水平的組成，探討細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)與環(huán)境因子的相關(guān)性。

1 材料與方法

1.1 區(qū)域概況

棘洪灘水庫(kù)位于青島市城陽(yáng)區(qū)(36°21′N(xiāo)，120°13′E)，總面積為14 km2，設(shè)計(jì)水位高度14.2 m，圍壩長(zhǎng)14.3 km，總?cè)萘?.46億m3。

1.2 樣品的采集

在棘洪灘水庫(kù)泵站前進(jìn)水口和水庫(kù)出水口設(shè)置采樣點(diǎn)，見(jiàn)圖1。采集水面以下0.5 m和5.0 m處水樣各1 L，混合后代表該采樣點(diǎn)的水樣。采樣時(shí)間為2021年3—5月每月25日10：00—12：00。每月采集進(jìn)水口和出水口樣品各1組，共計(jì)6組，分別標(biāo)記為In-Mar(3月進(jìn)水口)、Out-Mar(3月出水口)、In-Apr(4月進(jìn)水口)、Out-Apr(4月出水口)、In-May(5月進(jìn)水口)、Out-May(5月出水口)。使用滅菌聚甲基丙烯酸甲酯取樣器采集水樣，用滅菌聚四氟乙烯塑料瓶在1 h內(nèi)運(yùn)回實(shí)驗(yàn)室，通過(guò)0.22 μm混合纖維濾膜抽濾，濾膜用無(wú)菌離心管于-80 ℃保存。

圖1 棘洪灘水庫(kù)采樣點(diǎn)位置示意圖

1.3 環(huán)境因子測(cè)定

溫度、pH、溶解氧(DO)分別使用溫度計(jì)、pH計(jì)(HQ40d，美國(guó)哈希)和DO儀(HQ30d，美國(guó)哈希)現(xiàn)場(chǎng)直接測(cè)定。硝態(tài)氮采用紫外分光光度法測(cè)定；亞硝態(tài)氮采用N-(1-萘基)-乙二胺分光光度法測(cè)定；氨氮采用納氏試劑分光光度法測(cè)定；總氮(TN)采用堿性過(guò)硫酸鉀消解紫外分光光度法測(cè)定；總磷(TP)采用過(guò)硫酸鉀消解鉬銻抗比色法測(cè)定；硫酸鹽采用鉻酸鋇光度法測(cè)定；化學(xué)需氧量(COD)采用重鉻酸鹽法測(cè)定[10]。所有理化指標(biāo)均做3組平行。

1.4 細(xì)菌多樣性分析

將濾膜送至上海某生物醫(yī)藥科技有限公司進(jìn)行脫氧核糖核酸(DNA)提取及16S rRNA基因高通量測(cè)序，測(cè)序片段為16S rRNA基因的V3～V4段，引物序列為338F(5’-ACTCCTACGGGAGGCAGCAG-3’)和806R(5’-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3’)，測(cè)序平臺(tái)為Illumina MiSeq。

1.5 數(shù)據(jù)分析

通過(guò)美吉生物云平臺(tái)對(duì)DNA測(cè)序數(shù)據(jù)進(jìn)行優(yōu)化處理，剔除嵌合體重復(fù)序列和沒(méi)有重復(fù)的單序列，得到優(yōu)質(zhì)的樣品序列后進(jìn)行生物信息統(tǒng)計(jì)分析。將獲得的優(yōu)質(zhì)序列以相似度97%進(jìn)行歸并和可操作分類(lèi)單元(OTU)聚類(lèi)，選取豐度最高的序列為該OTU的代表序列。通過(guò)美吉生物云平臺(tái)計(jì)算種群豐富度指數(shù)(Chao1指數(shù)、ACE指數(shù))和群落多樣性指數(shù)(Shannon指數(shù)、Simpson指數(shù))。對(duì)OTU進(jìn)行組間差異性分析獲得在門(mén)和屬水平的細(xì)菌豐度和組成。主成分分析(PCA)和層次聚類(lèi)分析均通過(guò)美吉生物云平臺(tái)進(jìn)行，冗余分析(RDA)采用軟件Canoco 5.0進(jìn)行。

2 結(jié)果與討論

2.1 水質(zhì)分析結(jié)果

進(jìn)出口水質(zhì)理化指標(biāo)見(jiàn)表1。水體呈弱堿性，DO、COD、氨氮、TP均滿(mǎn)足《地表水環(huán)境質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)》(GB 3838—2002)Ⅰ類(lèi)水要求，硫酸鹽滿(mǎn)足GB 3838—2002集中式生活飲用水補(bǔ)充標(biāo)準(zhǔn)。TN接近GB 3838—2002 Ⅴ類(lèi)水限值，硝態(tài)氮滿(mǎn)足《生活飲用水水源水質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)》(CJ 3020—93)要求。

表1 水樣的理化性質(zhì)

3—5月為水庫(kù)引水期，外源性氮磷營(yíng)養(yǎng)鹽增加，平均水溫較低，浮游植物死亡或進(jìn)入休眠狀態(tài)，會(huì)降低硝態(tài)氮及TP消耗量，并且冬季水體湍流度小，水體中懸浮物減少，磷酸鹽不易被吸附于懸浮物上[11]，水體中硝態(tài)氮和TP含量較高。

2.2 樣品的測(cè)序結(jié)果及細(xì)菌群落多樣性分析

水樣的測(cè)序結(jié)果見(jiàn)表2，6組水樣中最高有效序列為39 523條，最低有效序列為34 495條，覆蓋度為99.43%～99.66%，測(cè)序深度能基本反映樣品的細(xì)菌群落組成。

表2 樣品的測(cè)序結(jié)果及群落α多樣性指數(shù)

6組水樣共包含150個(gè)OTU，特有OTU數(shù)量分別為40(In-Mar)、28(Out-Mar)、72(In-Apr)、19(Out-Apr)、47(In-May)、77(Out-May)個(gè)。篩選掉豐度值低于測(cè)序總量0.001%的OTU，共分類(lèi)出1 349個(gè)OTU，包含34個(gè)門(mén)、81個(gè)綱、199個(gè)目、323個(gè)科和524個(gè)屬。

樣品α多樣性指數(shù)見(jiàn)表2，ACE指數(shù)和Chao1指數(shù)表現(xiàn)為In-Apr>Out-Apr>Out-May>In-May>In-Mar>Out-Mar，3月和4月細(xì)菌群落豐富度出水口低于進(jìn)水口，5月呈現(xiàn)相反態(tài)勢(shì)?？傮w表現(xiàn)為4月最高，3月最低。Shannon指數(shù)表現(xiàn)為Out-May>In-Apr>In-May>Out-Apr>Out-Mar>In-Mar，Simpson指數(shù)表現(xiàn)為Out-May

β多樣性用于分析不同樣品間細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)的差異性，屬水平的PCA結(jié)果見(jiàn)圖2，PC1和PC2對(duì)細(xì)菌群落組成差異的解釋度分別為54.16%和18.25%。在PC1維度上，同一月份進(jìn)水口與出水口細(xì)菌群落組成相似度較高。在PC2維度上，In-Apr和Out-May細(xì)菌群落組成相似，In-Mar、Out-Mar、Out-Apr和In-May細(xì)菌群落組成相似。

圖2 細(xì)菌群落PCA

層次聚類(lèi)分析結(jié)果表明，In-Mar與Out-Mar、In-Apr與Out-Apr和In-May與Out-May的層次距離較小，即同一月份進(jìn)水口與出水口細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)組成相似，不同月份之間細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)組成差異明顯，與PCA結(jié)果基本一致?？傮w而言，3月進(jìn)水口和出水口細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)相似性最高，4月進(jìn)水口和出水口細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)相似性最低。

2.3 細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)

門(mén)水平細(xì)菌群落組成如圖3所示，所有樣品共檢出34個(gè)門(mén),6組樣品分別為20(In-Mar)、25(Out-Mar)、30(In-Apr)、30(Out-Apr)、28(In-May)、27(Out-May)個(gè)菌門(mén)。其中放線(xiàn)菌門(mén)、變形菌門(mén)、擬桿菌門(mén)和藍(lán)細(xì)菌門(mén)為優(yōu)勢(shì)菌門(mén)。放線(xiàn)菌門(mén)表現(xiàn)為In-Mar(39.84%)Out-May(34.66%)，擬桿菌門(mén)表現(xiàn)為In-Mar(12.22%)Out-Mar(26.22%)、In-Apr(23.67%)>Out-Apr(20.38%)、In-May(27.08%)>Out-May(23.67%)，藍(lán)細(xì)菌門(mén)表現(xiàn)為In-Mar(17.58%)>Out-Mar(4.29%)、In-Apr(16.96%)>Out-Apr(6.33%)、In-May(0.83%)>Out-May(0.64%)，表明變形菌門(mén)和藍(lán)細(xì)菌門(mén)在整個(gè)春季主要來(lái)自引水的外源性貢獻(xiàn)。5月進(jìn)水口厚壁菌門(mén)明顯增多，出水口疣微菌門(mén)和浮霉菌門(mén)明顯增多。

圖3 門(mén)水平結(jié)構(gòu)組成

樣品中共檢出524個(gè)菌屬，相對(duì)豐度較高的部分菌屬見(jiàn)表3，其中In-Mar相對(duì)豐度最高的菌屬為hgcI_clade、孢魚(yú)菌科未知屬、綠彎菌屬；Out-Mar相對(duì)豐度最高的菌屬為hgcI_clade、孢魚(yú)菌科未知屬、CL500-29_marine_group和多核桿菌屬；In-Apr相對(duì)豐度最高的菌屬為hgcI_clade、CL500-29_marine_group、綠彎菌屬和藍(lán)細(xì)菌屬；Out-Apr相對(duì)豐度最高的菌屬為hgcI_clade、CL500-29_marine_group、棲湖菌屬和孢魚(yú)菌科未知屬；In-May相對(duì)豐度最高的菌屬為hgcI_clade、CL500-29_marine_group和孢魚(yú)菌科未知屬；Out-May豐度最高的菌屬為hgcI_clade、CL500-29_marine_group和棲湖菌屬。

表3 屬水平上細(xì)菌的相對(duì)豐度

2.4 環(huán)境因子與細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)相關(guān)性分析

利用Canoco 5.0軟件，對(duì)相對(duì)豐度大于1%的優(yōu)勢(shì)菌屬與pH、DO等10個(gè)環(huán)境因子進(jìn)行RDA。優(yōu)勢(shì)菌屬主要受DO和COD的影響，其中DO與黃桿菌屬和綠彎菌屬呈正相關(guān)，與hgcI_clade、CL500-29_marine_group、沉積物桿狀菌屬和紅育菌屬呈負(fù)相關(guān)；COD與CL500-29_marine_group、綠彎菌屬、沉積物桿狀菌屬和分枝桿菌屬呈正相關(guān)，與hgcI_clade和紅育菌屬呈負(fù)相關(guān)。

3 討 論

棘洪灘水庫(kù)TN大于0.2 mg/L，TP在0.01 mg/L左右，TN是其富營(yíng)養(yǎng)化的關(guān)鍵因素。外界氮磷營(yíng)養(yǎng)鹽的輸入會(huì)促進(jìn)浮游生物繁殖，導(dǎo)致水質(zhì)變差[12]。黃河干流氨氮污染嚴(yán)重[13]，引水可能是棘洪灘氮營(yíng)養(yǎng)鹽的主要輸入源。棘洪灘水庫(kù)TP輸出依靠出水?dāng)y帶和底泥吸收，董國(guó)棟等[14]通過(guò)構(gòu)建棘洪灘水庫(kù)TP變化模型，發(fā)現(xiàn)在3—8月TP平均沉降速率為負(fù)值，證明春季磷主要來(lái)源于引水。

α多樣性分析中，Chao1指數(shù)越大表示細(xì)菌群落豐富度越高，Shannon和Simpson指數(shù)越高代表微生物群落多樣性和均一性越好。3月和4月出水口細(xì)菌群落豐富度均低于進(jìn)水口，這與棘洪灘水庫(kù)水流緩慢，細(xì)菌大量繁殖有關(guān)[15]。3月引水河道溫度較低，導(dǎo)致進(jìn)水口細(xì)菌多樣性低于出水口[16]，而Shannon指數(shù)最大值和Simpson指數(shù)最小值出現(xiàn)在Out-May，即5月出水口細(xì)菌多樣性最高，可能與水庫(kù)內(nèi)部受人類(lèi)影響較小有關(guān)。在屬水平上，5月綠彎菌屬和藍(lán)細(xì)菌屬相對(duì)豐度與3、4月有較大差異，綠彎菌屬屬于兼性厭氧菌，能夠進(jìn)行光合作用參與有機(jī)物的降解。而藍(lán)細(xì)菌屬相對(duì)豐度減少與5月COD濃度升高有關(guān)[17]，也可能與藍(lán)細(xì)菌屬能夠在缺氧環(huán)境利用亞硝酸鹽作為電子受體進(jìn)行厭氧生長(zhǎng)有關(guān)[18]。

PARULEKAR等[19]通過(guò)對(duì)湖泊水體微生物群落結(jié)構(gòu)組成分析，發(fā)現(xiàn)放線(xiàn)菌門(mén)、變形菌門(mén)、擬桿菌門(mén)和藍(lán)細(xì)菌門(mén)是水體中優(yōu)勢(shì)度較大的菌門(mén)，與本研究結(jié)果基本一致。棘洪灘水庫(kù)引水河道途徑濱州、濰坊和青島等農(nóng)田地區(qū)，其菌門(mén)相對(duì)豐度可能受到農(nóng)田影響。變形菌門(mén)和放線(xiàn)菌門(mén)是典型淡水菌[20]，已有研究表明，變形菌門(mén)能夠參與脫氮除磷過(guò)程，在有機(jī)物降解中也發(fā)揮著一定的作用[21]。Out-Mar、Out-Apr和Out-May與In-Mar、In-Apr和In-May相比TN含量較低，可能與藍(lán)細(xì)菌門(mén)有固氮能力有關(guān)[22]。擬桿菌門(mén)在脫氮和有機(jī)物降解過(guò)程中起一定作用。李建柱等[23]等在對(duì)水體微生物群落研究中發(fā)現(xiàn)hgcI_clade、CL500-29_marine_group和綠彎菌屬是水體的優(yōu)勢(shì)菌屬，與本研究結(jié)果基本一致。hgcI_clade相對(duì)豐度隨溫度升高而明顯增大，與水質(zhì)變好以及其能夠利用低濃度有機(jī)碳有關(guān)[24-25]。CL500-29_marine_group能夠利用含碳有機(jī)物改善水質(zhì)[26]。綠彎菌屬屬于兼性厭氧菌，可參與脫氮除磷過(guò)程[27]。此外，樣品中還檢測(cè)出黃桿菌屬，可能與水庫(kù)中魚(yú)類(lèi)活動(dòng)有關(guān)。

RDA結(jié)果表明，DO和COD為影響細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)的主要環(huán)境因子，與WEI等[28]和ZHANG等[29]研究結(jié)果一致。其中CL500-29_marine_group和紅育菌屬均與亞硝態(tài)氮、TP呈負(fù)相關(guān)，紅育菌屬和CL500-29_marine_group均在氮循環(huán)過(guò)程中起到一定作用[30]。COD與CL500-29_marine_group呈正相關(guān)，可能與CL500-29_marine_group能夠利用COD進(jìn)行生長(zhǎng)繁殖有關(guān)[31]，hgcI_clade與TN呈負(fù)相關(guān)，可能與hgcI_clade能夠利用含氮有機(jī)物進(jìn)行異養(yǎng)有關(guān)[32]。DO與綠彎菌屬呈正相關(guān)，這與綠彎菌屬能在高DO的出水口脫氮和去除COD作用有關(guān)[33]。黃桿菌屬與亞硝態(tài)氮呈負(fù)相關(guān)，黃桿菌屬屬于反硝化菌，在富營(yíng)養(yǎng)的水體中能夠?qū)喯鯌B(tài)氮最終轉(zhuǎn)化為氮?dú)?。黃桿菌屬與pH呈正相關(guān)，說(shuō)明它更適應(yīng)高pH環(huán)境。TP、TN與多核桿菌屬呈正相關(guān)，說(shuō)明多核桿菌屬更適應(yīng)高TP和TN環(huán)境[34]。

4 結(jié) 論

(1) 棘洪灘水庫(kù)中氮磷營(yíng)養(yǎng)鹽主要來(lái)源于進(jìn)水，α多樣性表現(xiàn)為細(xì)菌群落豐富度4月進(jìn)水口最高，3月出水口最低；細(xì)菌群落多樣性5月出水口最高，3月進(jìn)水口最低；β多樣性表現(xiàn)為3月進(jìn)水口和出水口細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)相似性最高，4月進(jìn)水口和出水口細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)相似性最低。

(2) 門(mén)水平上，放線(xiàn)菌門(mén)占比最大，3月到5月擬桿菌門(mén)相對(duì)豐度均表現(xiàn)為進(jìn)水口低于出水口，藍(lán)細(xì)菌門(mén)相對(duì)豐度呈相反態(tài)勢(shì)；屬水平上，hgcI_clade相對(duì)豐度最高，其次是CL500-29_marine_group、綠彎菌屬和孢魚(yú)菌科未知屬。

(3) DO、COD是影響棘洪灘水庫(kù)細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)的主要環(huán)境因子。