劉澤岸 孫 琳

(浙江省水利水電勘測(cè)設(shè)計(jì)院有限公司,浙江 杭州 310002)

近年來,西北地區(qū)城市化不斷加快,城鎮(zhèn)居民集中的地區(qū)有大量含氮污水排放到水體中,城市河流的水環(huán)境污染日益嚴(yán)峻[1]。河流作為城市形成與發(fā)展過程中的資源和環(huán)境的重要載體[2],現(xiàn)今在飲用水工程[3]、工業(yè)用水[4]、農(nóng)業(yè)灌溉[5]及景觀娛樂[6]等方面都起到重要作用。因此,城市河流環(huán)境和生態(tài)問題的日益突出將在一定程度上影響城市的發(fā)展[7-8]。而微生物對(duì)外界環(huán)境變化較為敏感,微生物的研究已經(jīng)廣泛應(yīng)用到水體污染治理、污染土壤修復(fù)等工程中[9-12]。微生物可以通過同化和異化作用來降解污染物[13],減少污染物的積累,有助于維持水生態(tài)系統(tǒng)的穩(wěn)定。

當(dāng)前關(guān)于城市水體微生物群落的研究仍以湖泊為主[14-16],對(duì)于河流微生物的研究相對(duì)較少[17-19]。如萬(wàn)甜等[20]采用高通量測(cè)序技術(shù)對(duì)渭河流域微生物群落多樣性進(jìn)行了分析;袁博等[21]研究了灞河流域溶解性有機(jī)質(zhì)(DOM)的熒光光譜特征及其對(duì)細(xì)菌組成的影響;王佳等[22]通過聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)—變形梯度凝膠電泳(DGGE)技術(shù)對(duì)豐水期、平水期和枯水期的渾河底泥微生物進(jìn)行了指紋圖譜分析。對(duì)于城市河流水體中微生物的研究則更少。張崇淼等[23]通過細(xì)菌培養(yǎng)技術(shù)、PCR檢測(cè)和DGGE分析技術(shù),對(duì)城市河流浐灞河中的異氧菌耐藥率、四環(huán)素抗性基因進(jìn)行了研究。本研究基于Illumina MiSeq高通量測(cè)序技術(shù)獲取浐灞河生態(tài)區(qū)水體中微生物信息,分析城市河流的微生物群落結(jié)構(gòu)的空間分布規(guī)律和多樣性;通過冗余分析 (RDA)探究微生物群落與環(huán)境因子之間的相關(guān)關(guān)系。這對(duì)流域水生態(tài)系統(tǒng)健康發(fā)展具有重要意義,為西安城市河流的污染治理、微生物生態(tài)修復(fù)及水環(huán)境健康發(fā)展提供理論支撐和依據(jù)。

1 方 法

1.1 研究區(qū)域概況

浐灞河生態(tài)區(qū)位于浐灞河的城市段,地處西安市城區(qū)東部,南起浐河繞城高速,北至灞河入渭口,區(qū)域地勢(shì)為南高北低,由人為修筑橡膠壩、人工護(hù)坡等方式,形成城市淺水河流。浐河與灞河作為主要水體,連接秦嶺和渭河,是西安市生態(tài)敏感的地帶,其水生態(tài)的變化產(chǎn)生的影響輻射巨大[24]。研究區(qū)域內(nèi)分布兩處污水處理廠,其中西安市第三污水處理廠位于浐河桃花潭處,西安市第五污水處理廠位于灞河下游,其出水口均在河道沿岸,出水匯入河流;區(qū)域內(nèi)共分布22座橡膠壩,其中灞河段10座,浐河段12座,通過橡膠壩嚴(yán)格控制浐灞河水位和流量,在營(yíng)造城市水景觀、維護(hù)城市水安全等方面起到重要作用。

1.2 采樣點(diǎn)布設(shè)與樣品采集

基于水質(zhì)監(jiān)測(cè)和河流采樣點(diǎn)的布設(shè)原則,結(jié)合浐灞河生態(tài)區(qū)的水環(huán)境現(xiàn)狀,對(duì)流域采樣點(diǎn)布置如圖1所示,以進(jìn)行水體樣本的水質(zhì)和微生物分析。分別于2019年2月和7月進(jìn)行冬、夏兩季采樣,采樣點(diǎn)自下游到上游依次是入渭口、第五污水處理廠出水口、浐灞交匯口、世博園、第三污水處理廠出水口、長(zhǎng)樂東路。其中,夏季時(shí)的長(zhǎng)樂東路點(diǎn)因施工原因未采集到。對(duì)冬季各采樣點(diǎn)依次記為A1、A2、…、A6;對(duì)夏季各采樣點(diǎn)記為B1、B2、…、B5。

圖1 采樣點(diǎn)示意圖

依據(jù)采水原則,在水淺處采水,以不泛起河流底層沉積物為準(zhǔn);在水深處應(yīng)在水面下50 cm處采水。在采集前先用采樣點(diǎn)水體潤(rùn)洗采水容器,在水面下30 cm處取1 000 mL水樣,用無(wú)菌聚乙烯瓶臨時(shí)保存在4 ℃以下的保溫箱中,直至運(yùn)送到實(shí)驗(yàn)室。

1.3 測(cè)定項(xiàng)目

1.3.1 水質(zhì)指標(biāo)測(cè)定

1.3.2 脫氧核糖核酸(DNA)的提取和高通量測(cè)序

取500 mL水樣,使用0.45 μm微孔濾膜對(duì)水樣抽濾,把獲得的水體微生物樣品儲(chǔ)存在-20 ℃環(huán)境下。測(cè)序具體流程如下:采用DNA提取試劑盒(FastDNA?Spin Kit for Soil)提取DNA時(shí),操作步驟按照試劑盒說明書進(jìn)行。使用質(zhì)量分?jǐn)?shù)為2%的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)提取DNA的質(zhì)量,并采用NanoDrop ND-2000超微量分光光度計(jì)對(duì)DNA進(jìn)行定量分析。PCR擴(kuò)增及其高通量測(cè)序采用特異引物為5’-GTGCCAGCMGCCGCGGTAA-3’和5’-CCGTCAATTCMTTTRAGTTT-3’,對(duì)16S rRNA基因的V4～V5區(qū)進(jìn)行擴(kuò)增[25]。PCR擴(kuò)增采用TransGen AP221CCGTC02:TransStart Fastpfu DNA Polymerase,即全部樣本按照正式實(shí)驗(yàn)條件進(jìn)行。將PCR擴(kuò)增產(chǎn)物混合后經(jīng)2%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)后,使用AXYGEN公司的凝膠回收試劑盒進(jìn)行回收。在PCR擴(kuò)增產(chǎn)物熒光定量后采用Illumina MiSeq PE250/PE300進(jìn)行高通量測(cè)序。用Illumina 公司的TruSeq Nano DNA LT Library Prep Kit制備測(cè)序文庫(kù):對(duì)獲得的擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行序列末端修復(fù),采用BECKMAN AMPure XP Beads,通過磁珠篩選,去除接頭自連片段,純化添加接頭后的文庫(kù)體系,使用2%瓊脂糖凝膠電泳對(duì)文庫(kù)做最終的片段選擇與純化。測(cè)序委托上海派森諾基因有限公司進(jìn)行,對(duì)原始序列進(jìn)行預(yù)處理,選取高質(zhì)量的操作分類單元(OTU)序列進(jìn)行分析。

1.4 數(shù)據(jù)分析和處理

采用Illumina MiSeq平臺(tái)對(duì)群落DNA片段進(jìn)行Paired-end (雙端)測(cè)序,原始雙端測(cè)序數(shù)據(jù)經(jīng)滑動(dòng)窗口法進(jìn)行質(zhì)量篩查,質(zhì)量合格后使用Flash軟件對(duì)樣品進(jìn)行reads配對(duì)連接。運(yùn)用Qiime軟件識(shí)別疑問序列,調(diào)用Usearch v5.2.236檢查并剔除嵌合體序列。

對(duì)優(yōu)質(zhì)序列通過QIIME (http://qiime.org/ tutorials/index.html)進(jìn)行OTU劃分,獲得每個(gè)OTU所對(duì)應(yīng)的分類學(xué)信息。通過繪制稀釋曲線和計(jì)算用于Alpha多樣性統(tǒng)計(jì)。利用Canoco5.0軟件對(duì)微生物群落和環(huán)境因子開展主成分分析(PCA),分析樣本間的相似性與差異性,Origin9.1繪制豐度柱狀圖。

2 結(jié)果與討論

2.1 水質(zhì)狀況分析

表1為浐灞河生態(tài)區(qū)各采樣點(diǎn)在冬、夏兩季的理化指標(biāo)特征。冬季各采樣點(diǎn)WT在8.2～14.3 ℃,其中A2和A5采樣點(diǎn)作為污水處理廠出水口WT較高。根據(jù)《地表水環(huán)境質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)》(GB 3838—2002),各采樣點(diǎn)TN均低于Ⅴ類水標(biāo)準(zhǔn)。冬季各采樣點(diǎn)TP在0.131～0.558 mg/L,均值為0.297 mg/L,總體表現(xiàn)為Ⅳ類水標(biāo)準(zhǔn),其中A4和A6采樣點(diǎn)的TP表現(xiàn)為Ⅲ類水標(biāo)準(zhǔn),A1采樣點(diǎn)TP最高,為0.558 mg/L。夏季各采樣點(diǎn)TP為0.080～0.408 mg/L,均值為0.220 mg/L,總體表現(xiàn)為Ⅳ類水標(biāo)準(zhǔn),在B3和B4采樣點(diǎn)的濃度較低,為Ⅱ類水標(biāo)準(zhǔn),在B2采樣點(diǎn)最高,為0.408 mg/L。

冬、夏季浐灞河生態(tài)區(qū)水體理化指標(biāo)具有明顯的空間差異性。污水處理廠出水口附近各物理化學(xué)指標(biāo)均有異于其余采樣點(diǎn),具體表現(xiàn)為WT大多略高于受納水體,pH大多略低于其他采樣點(diǎn),DO含量略低于其他采樣點(diǎn)。此外,灞河上游水質(zhì)優(yōu)于下游,在浐河匯入后,灞河下游水質(zhì)變差;污水處理廠出水口的TN、TP、COD各污染指標(biāo)大多升高,是造成浐灞河生態(tài)區(qū)水體理化指標(biāo)空間差異性的主要因素。

由表1可以看出,采樣點(diǎn)水質(zhì)指標(biāo)劣于Ⅴ類水標(biāo)準(zhǔn),主要是TN嚴(yán)重超標(biāo)?？梢姷廴臼菍?dǎo)致浐灞河水質(zhì)較差的主要原因。國(guó)內(nèi)許多研究人員對(duì)浐灞河生態(tài)區(qū)水質(zhì)狀況進(jìn)行了調(diào)研和分析,孫佳樂[26]通過分析得出,兩個(gè)污水處理廠出水口處WT、營(yíng)養(yǎng)鹽濃度比浐灞河生態(tài)區(qū)段其他采樣點(diǎn)濃度高,且TN低于Ⅴ類水要求;陳紅[27]對(duì)灞河城市段水質(zhì)調(diào)研結(jié)果表明,TN在全年各采樣點(diǎn)均處于劣Ⅴ類水,為污染程度最高的指標(biāo)。通過分析國(guó)內(nèi)研究人員對(duì)浐灞河水環(huán)境狀況的調(diào)研成果,結(jié)合西安市實(shí)際情況,得出水質(zhì)污染的主要原因有以下幾個(gè)方面:作為城市河流,部分未達(dá)標(biāo)的工業(yè)和未處理的生活污水直接排入河道;地表徑流補(bǔ)償減少,河流自凈能力下降;上游工業(yè)生產(chǎn)混亂,砍伐無(wú)序,破壞地表徑流規(guī)律,間接污染水質(zhì)[28]。

表1 各采樣點(diǎn)理化指標(biāo)

可以通過采取以下防治措施改善河流水質(zhì):做好河流保護(hù)工作,上游河道兩側(cè)做好林木防護(hù),河流城市段建設(shè)護(hù)欄;嚴(yán)控污染排放問題,對(duì)于上下游工業(yè)和生活污水排放、污水處理廠排水,建立責(zé)任明確的規(guī)章并嚴(yán)格執(zhí)行。此外,除了傳統(tǒng)水質(zhì)防治措施外,微生物修復(fù)技術(shù)也應(yīng)得到廣泛應(yīng)用。

2.2 微生物群落多樣性分析

微生物群落的多樣性,目前常用Alpha多樣性來描述,可以直觀反映不同環(huán)境微生物群落豐富度、多樣性和均勻度,包括豐富度指數(shù)(Chao1指數(shù)、ACE指數(shù),反映豐富度)和多樣性指數(shù)(Shannon-Wiener指數(shù)、Simpson指數(shù),反映多樣性和均勻度)。微生物Alpha多樣性統(tǒng)計(jì)結(jié)果見表2。

由表2可得,冬季各采樣點(diǎn)的Chao1指數(shù)和ACE指數(shù)最高的是采樣點(diǎn)A5,最低的是A1。兩個(gè)豐富度指數(shù)表現(xiàn)出的采樣點(diǎn)變化趨勢(shì)一致,均表現(xiàn)為A5>A2>A3>A6>A4>A1。Shannon-Wiener指數(shù)和Simpson指數(shù)最高的是采樣點(diǎn)A5,最低的是采樣點(diǎn)A2。各采樣點(diǎn)Shannon-Wiener指數(shù)大小順序依次為A5>A6>A4>A3>A1>A2,Simpson指數(shù)大小順序依次為A5>A6>A4>A1>A3>A2。

分析結(jié)果可知,A5采樣點(diǎn)作為第三污水處理廠出水口,采樣點(diǎn)豐富度、多樣性與均勻度在所有采樣點(diǎn)中最高;而A2采樣點(diǎn)豐富度指數(shù)較高,多樣性指數(shù)卻最低,表明物種較多,均勻度卻較差,可能的原因是污水處理廠出水導(dǎo)致出水口附近水體富營(yíng)養(yǎng)化嚴(yán)重,各類營(yíng)養(yǎng)鹽含量較高,為微生物提供了營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)。

由表2可得,夏季各采樣點(diǎn)的Chao1指數(shù)和ACE指數(shù)最高的是采樣點(diǎn)B2,最低的是采樣點(diǎn)B4。兩個(gè)豐富度指數(shù)趨勢(shì)一致,大小順序依次為B2>B5>B3>B1>B4。Shannon-Wiener指數(shù)和Simpson指數(shù)最低的均是采樣點(diǎn)B4。Shannon-Wiener指數(shù)最高的是采樣點(diǎn)B2,Simpson指數(shù)最高的是采樣點(diǎn)B3與B2。Shannon-Wiener指數(shù)大小順序依次為B2>B5>B3>B1>B4,Simpson指數(shù)大小順序依次為B3=B2>B5>B1>B4。

表2 Alpha多樣性統(tǒng)計(jì)結(jié)果

分析結(jié)果可知,夏季各采樣點(diǎn)微生物群落指數(shù)大小趨勢(shì)大體一致,均顯示在B2采樣點(diǎn),即第五污水處理廠出水口最大,意味著該點(diǎn)微生物群落豐富度、多樣性與均勻度在所有采樣點(diǎn)中最高,第三污水處理廠出水口采樣點(diǎn)次之,B4采樣點(diǎn)最小。

總體來看,夏季各采樣點(diǎn)微生物群落多樣性高于冬季,在同一季節(jié)微生物群落多樣性存在空間差異,污水處理廠出水口微生物群落多樣性相對(duì)更高，表明浐灞河生態(tài)區(qū)水體的微生物群落特征有顯著的時(shí)空差異。

2.3 微生物群落分布規(guī)律

冬、夏季各采樣點(diǎn)菌群在門水平上總體相似,但又存在差異。在冬季,變形菌門(Proteobacteria)在所有采樣點(diǎn)中相對(duì)豐度最高,為47.0%,是研究水域的代表菌門;其次是擬桿菌門(Bacteroidetes),其相對(duì)豐度為30.3%,在每個(gè)采樣點(diǎn)中僅次于變形菌門;藍(lán)藻門(Cyanobacteria)在A1、A3采樣點(diǎn)相對(duì)豐度較高;放線菌門(Actinobacteria)在各采樣點(diǎn)中都有分布,在A3、A4采樣點(diǎn)相對(duì)豐度較高;剩余菌門只分布于個(gè)別采樣點(diǎn)。放線菌門、藍(lán)藻門相對(duì)豐度分別為12.1%、5.2%。各采樣點(diǎn)中,A5采樣點(diǎn)物種門類最多即多樣性最好,A2采樣點(diǎn)門類最少,物種均勻度低。

在夏季,變形菌門在所有采樣點(diǎn)相對(duì)豐度最高,為50.7%;其次是放線菌門,相對(duì)豐度為20.9%,除在B1采樣點(diǎn)相對(duì)豐度略低,在其余采樣點(diǎn)中相對(duì)豐度僅次于變形菌門;藍(lán)藻門相對(duì)豐度在B1采樣點(diǎn)相對(duì)豐度僅次于變形菌門,在所有采樣點(diǎn)中最高,相對(duì)豐度呈下游大于上游趨勢(shì);厚壁菌門(Firmicutes)主要分布在B4、B5采樣點(diǎn),其他采樣點(diǎn)相對(duì)豐度很低或無(wú);擬桿菌門在各采樣點(diǎn)分布相似但相對(duì)豐度較小;其他菌門在不同采樣點(diǎn)相對(duì)豐度分布差異較大。除了變形菌門外,放線菌門、藍(lán)藻門、厚壁菌門的相對(duì)豐度分別為20.9%、14.3%、6.0%。

由圖2可總結(jié)出，冬、夏兩季門水平菌群以變形菌門、藍(lán)藻門、擬桿菌門和放線菌門等優(yōu)勢(shì)細(xì)菌為主。已有眾多學(xué)者發(fā)現(xiàn)它們廣泛分布于淡水水域中[29-30]，存在顯著的季節(jié)性差異,菌群組成與相對(duì)豐度都有明顯變化。在冬季與夏季的菌群組成中,變形菌門相對(duì)豐度均最大,且大多夏季大于冬季。變形菌門包含的部分菌屬有利于水質(zhì)凈化(如氧化氨的亞硝化單胞菌屬)。此外,變形菌門也包括很多病原菌(如霍亂弧菌、沙門氏菌、幽門螺桿菌等),在具有凈化水質(zhì)功能的同時(shí)也存在致病風(fēng)險(xiǎn);放線菌門夏季的相對(duì)豐度大于冬季,季節(jié)之間相對(duì)豐度變化幅度明顯,它是一類革蘭氏陽(yáng)性細(xì)菌,在污水的處理等方面也有廣泛的用途;藍(lán)藻門在冬季與夏季均出現(xiàn)在菌群中,相對(duì)豐度夏季大于冬季;擬桿菌門相對(duì)豐度冬季大于夏季,其在冬季是主要菌群，相對(duì)豐度在各采樣點(diǎn)均很大,夏季相對(duì)豐度大大降低,很多擬桿菌綱的菌種生活在人或者動(dòng)物的腸道中,有些時(shí)候成為病原菌[31-34]。

圖2 冬、夏季各采樣點(diǎn)門水平微生物群落結(jié)構(gòu)分布

2.4 微生物群落相似性分析

通過R軟件,對(duì)屬水平的微生物群落結(jié)構(gòu)進(jìn)行PCA分析。冬、夏季微生物群落PCA分析結(jié)果見圖3。

圖3 冬、夏季菌群PCA分析

由圖3 (a)可知,PCA第一主成分(PC1)對(duì)各樣本物種差異解釋率為57.76%,第二主成分(PC2)對(duì)各物種差異解釋率迅速下降為27.33%,共占85.09%,說明能夠充分表達(dá)微生物群落實(shí)際的差異性和相似性。此外,A2游離于各采樣點(diǎn)之外,可能是第五污水處理廠的出水影響該點(diǎn)微生物群落結(jié)構(gòu),導(dǎo)致該點(diǎn)并不與相鄰采樣點(diǎn)聚集。

由圖3 (b)可知,PC1對(duì)各樣本物種差異解釋率為62.16%,PC2對(duì)各物種差異解釋率迅速下降為17.84%,共占80.00%,說明能夠充分表達(dá)微生物群落實(shí)際的差異與相似性。B4獨(dú)自游離于其他采樣點(diǎn)之外,表明在夏季,浐灞河生態(tài)區(qū)段上游與下游菌群結(jié)構(gòu)差異明顯。

2.5 微生物群落與環(huán)境因子相關(guān)性分析

本研究基于Canoco5.0軟件,選取相對(duì)豐度較高的細(xì)菌門分類水平進(jìn)行微生物群落與環(huán)境因子之間的相關(guān)性分析,7個(gè)環(huán)境因子共解釋了80.10%的物種變化信息，如圖4所示。從環(huán)境因子的向量長(zhǎng)度可以看出:大部分環(huán)境因子對(duì)物種的分布影響較大,其中WT最大，為35.20%,pH、DO次之，分別為15.80%、9.30%。將物種向量與環(huán)境因子向量結(jié)合分析:藍(lán)藻門與WT、pH、DO呈正相關(guān),與TP、TN、氨氮、COD呈負(fù)相關(guān);浮霉菌門與WT、COD呈正相關(guān),與TP、TN、氨氮、pH、DO呈負(fù)相關(guān);變形菌門、放線菌門、厚壁菌門與WT、COD呈正相關(guān),與TP、TN、氨氮、pH、DO呈負(fù)相關(guān);綠彎菌門與WT、COD、TP、TN、氨氮呈正相關(guān),與pH、DO呈負(fù)相關(guān);擬桿菌門、疣微菌門與TP、TN、氨氮、pH、DO呈正相關(guān),與WT、COD呈負(fù)相關(guān)。7個(gè)環(huán)境因子只有WT(P=0.004)、pH(P=0.019)和DO(P=0.042)達(dá)到了顯著性水平,而其他環(huán)境因子未達(dá)到顯著性水平,表明水體的WT、pH以及DO是影響冬、夏兩季生態(tài)區(qū)段水體微生物群落結(jié)構(gòu)變化的關(guān)鍵環(huán)境因子,它們的影響比TN、TP等化學(xué)指標(biāo)更顯著。

圖4 物種—環(huán)境因子RDA

3 結(jié) 論

(1) 浐灞河生態(tài)區(qū)水質(zhì)污染因子主要為TN,灞河上游水質(zhì)優(yōu)于下游,在浐河匯入后,灞河下游水質(zhì)變得更差,污水處理廠出水口處水質(zhì)最差。

(2) 利用Illumina MiSeq高通量測(cè)序技術(shù),對(duì)浐灞河生態(tài)區(qū)6個(gè)采樣點(diǎn)冬、夏季節(jié)水樣進(jìn)行測(cè)序,得出冬季兩個(gè)豐富度指數(shù)均表現(xiàn)為A5>A2>A3>A6>A4>A1,兩個(gè)多樣性指數(shù)均為A5最高、A2最低;夏季各采樣點(diǎn)微生物群落指數(shù)大小趨勢(shì)大體一致。夏季各采樣點(diǎn)微生物群落多樣性總體高于冬季,在同一季節(jié)微生物群落多樣性存在空間差異,污水處理廠出水口微生物群落多樣性相對(duì)更高。浐灞河生態(tài)區(qū)水體的微生物群落呈現(xiàn)顯著的時(shí)空差異特征。

(3) 在夏季,變形菌門的相對(duì)豐度最高,為50.7%,其次為放線菌門,相對(duì)豐度為20.9%;在冬季,變形菌門的相對(duì)豐度最高,為47.0%,其次為擬桿菌門,相對(duì)豐度為30.3%。

(4) 微生物群落與環(huán)境因子之間的相關(guān)性分析結(jié)果顯示,7個(gè)環(huán)境因子只有WT(P=0.004)、pH(P=0.019)和DO(P=0.042)達(dá)到了顯著性水平,表明WT、pH以及DO是影響冬、夏兩季生態(tài)區(qū)段水體微生物群落結(jié)構(gòu)變化的關(guān)鍵環(huán)境因子,這些相關(guān)性關(guān)系解釋了浐灞河水質(zhì)分布規(guī)律。