趙琦慧 李法云 吝美霞 石 潤(rùn)

(1.上海應(yīng)用技術(shù)大學(xué)生態(tài)技術(shù)與工程學(xué)院，上海 201418；2.上海城市路域生態(tài)工程技術(shù)研究中心，上海 201418；3.美麗中國(guó)與生態(tài)文明研究院(上海高校智庫(kù))，上海 201418；4.湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)資源環(huán)境學(xué)院，湖南 長(zhǎng)沙 410128)

在我國(guó)長(zhǎng)三角、珠三角和環(huán)渤海區(qū)域石化產(chǎn)業(yè)分布密集，形成了三大石化產(chǎn)業(yè)集群。石化產(chǎn)業(yè)可導(dǎo)致大量多環(huán)芳烴(PAHs)排放[1]。據(jù)報(bào)道，排入環(huán)境的PAHs大部分進(jìn)入到土壤環(huán)境中[2-5]。因此，受PAHs污染土壤迫切需要有效修復(fù)。

植物-微生物聯(lián)合修復(fù)技術(shù)可以綜合植物修復(fù)與微生物修復(fù)的優(yōu)點(diǎn)[6-8]。有研究將睪丸酮叢毛單胞菌(Comamonastestosteroni)與羊草(Leymuschinensis)聯(lián)合修復(fù)PAHs污染土壤，發(fā)現(xiàn)睪丸酮叢毛單胞菌可以在降解后期顯著提高菲的降解效率，但對(duì)萘和苯并芘的降解效率只有小幅提高[9]。另有研究表明，固定化技術(shù)可能會(huì)提高微生物的環(huán)境適應(yīng)能力，抵抗環(huán)境毒性，從而可能會(huì)對(duì)污染物的降解效率有所提高[10-11]。

本研究系統(tǒng)地研究了油菜(Brassicarapavar.chinensis(L.) Kitam.)種子(包括包衣和不包衣)和石油烴降解菌單一或聯(lián)合修復(fù)對(duì)PAHs污染土壤的影響，并考慮了種子載體固定化降解菌，以期為構(gòu)建植物與微生物共修復(fù)體系提供更多支撐和依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

清潔土壤采自上海應(yīng)用技術(shù)大學(xué)植物園，pH為6.65。PAHs污染土壤采自遼河油田，pH為8.92，PAHs質(zhì)量濃度為308.69 mg/kg。采集的土壤去除石塊、動(dòng)物殘?bào)w和植物根系等雜質(zhì)后過2 mm篩，備用。

作為填充材料的生物質(zhì)炭由黃花菜秸稈在 500 ℃下炭化1 h后過0.075 mm篩制備得到。油菜種子來(lái)自湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)。包含假單胞菌(Pseudomonasadaceae)、芽孢桿菌(Bacillus)、微球菌(Micrococcus)、乳桿菌(Lactobacillus)、假絲酵母(Candida)、產(chǎn)堿桿菌(Alcaligenes)的石油烴復(fù)合菌劑來(lái)自安徽全民環(huán)?？萍加邢薰?。蚯蚓糞有機(jī)肥來(lái)自上海溫興生物工程有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)

種子載體固定化降解菌制備：以10 g/L海藻酸鈉(SA)作為包埋劑、20 g/L CaCl2作為交聯(lián)劑、100 mg/L萘乙酸(NAA)作為生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑、10 g/L聚乙烯醇(PVA)作為保水劑、5 g/L生物質(zhì)炭作為填充材料形成混合膠狀液體；將混合膠狀液體與復(fù)合菌劑均勻混合；經(jīng)次氯酸鈉消毒的油菜種子包埋在其中，用吸管吸取包埋種子滴入CaCl2溶液，在冰水浴中固定2 h，形成種子載體固定化降解菌。若不加復(fù)合菌劑形成的就是包衣種子。

清潔土壤與污染土壤混合配制成PAHs質(zhì)量濃度為44.29 mg/kg的實(shí)驗(yàn)土壤。稱取600 g實(shí)驗(yàn)土壤于花盆(高12 cm、直徑13 cm)中，調(diào)節(jié)土壤含水率為60%，放置于上海應(yīng)用技術(shù)大學(xué)植物園玻璃溫室。實(shí)驗(yàn)設(shè)置5個(gè)處理，T1種植油菜包衣種子，T2在土壤中只接種復(fù)合菌劑，T3種植油菜包衣種子并在土壤中接種復(fù)合菌劑，T4接種油菜種子載體固定化降解菌，T5種植油菜種子并接種復(fù)合菌劑，所有實(shí)驗(yàn)組均施用土壤質(zhì)量分?jǐn)?shù)5%的蚯蚓糞有機(jī)肥，不進(jìn)行任何處理的實(shí)驗(yàn)土壤作為對(duì)照處理(見表1)。第50天收取植物，并采集實(shí)驗(yàn)土壤，風(fēng)干過篩供污染物含量分析。

表1 實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)的不同處理

1.3 測(cè)定指標(biāo)及方法

植物生理生長(zhǎng)指標(biāo)：油菜收獲前測(cè)量葉長(zhǎng)、葉寬；用LI-6400便攜式光合作用測(cè)量系統(tǒng)測(cè)定光合速率和蒸騰速率；在葉片上取直徑為1 cm的圓片3片，在95%(體積分?jǐn)?shù))乙醇中避光浸泡至完全脫色(一般24 h)，分別在470、646、663 nm用分光光度法測(cè)定類胡蘿卜素、葉綠素a、葉綠素b含量。油菜收獲后用蒸餾水洗凈，擦干后稱生物量，同時(shí)測(cè)量根長(zhǎng)、莖長(zhǎng)。

土壤pH的測(cè)定：稱取10.0 g風(fēng)干土壤于50 mL離心管中，加入25 mL蒸餾水，以180 r/min振蕩5 min后用pH計(jì)測(cè)定上清液pH。

PAHs的提取和分析參照《土壤和沉積物 多環(huán)芳烴的測(cè)定 氣相色譜—質(zhì)譜法》(HJ 805—2016)，索氏提取土壤中的PAHs后過硅酸鎂小柱凈化，用Agilent 7890B/5977B氣相色譜—質(zhì)譜聯(lián)用儀測(cè)定PAHs成分和含量。

1.4 數(shù)據(jù)分析方法

采用SPSS 16.0進(jìn)行單因素方差分析(P<0.05)，顯著性檢驗(yàn)采用鄧肯(Duncan)法，數(shù)據(jù)用不同小寫字母標(biāo)注表示差異顯著，用相同小寫字母標(biāo)注表示差異不顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 油菜的生理生長(zhǎng)情況

從表2比較T5和T3發(fā)現(xiàn)，T3比T5生物量顯著增加了21.62%，說明包衣處理后的種子從包衣材料中可以獲得更多營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，外殼保護(hù)又減少了污染物對(duì)其毒害作用，而T3比T5根長(zhǎng)顯著減少了13.48%，進(jìn)一步說明未包衣的種子需要伸長(zhǎng)根長(zhǎng)來(lái)獲取更多營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)。T3與T1相比，接種復(fù)合菌劑后由于對(duì)污染物的降解作用使得葉長(zhǎng)、葉寬、莖長(zhǎng)、根長(zhǎng)和生物量都有所增加。比較T4和T3發(fā)現(xiàn)，將降解菌固定化處理后，葉長(zhǎng)、葉寬、莖長(zhǎng)和生物量顯著減少。

表2 油菜的根莖葉生長(zhǎng)情況

由圖1可知，無(wú)論是光合速率還是蒸騰速率都是T3最大。有機(jī)污染物對(duì)植物具有抑制效應(yīng)，接種降解菌后由于降解菌可以降解PAHs，因此光合速率、蒸騰速率明顯提升了，并且種子包衣處理后的植株光合速率與蒸騰速率高于裸露種子發(fā)育的植株，說明包衣處理有利于種子萌發(fā)及植株的生長(zhǎng)發(fā)育，但將降解菌固定化會(huì)影響降解菌效果發(fā)揮。

圖1 油菜的光合速率和蒸騰速率

種子包衣處理的油菜較裸露種子發(fā)育的植株色素含量有所提升，但固定化與否似乎對(duì)色素的影響不大(見表3)。

表3 油菜色素質(zhì)量濃度

2.2 實(shí)驗(yàn)土壤pH差異

由圖2可見，收取植物后對(duì)照組實(shí)驗(yàn)土壤的pH最高，這是因?yàn)槲廴就寥啦勺赃|河油田石油，本身pH較高，為8.92。其余處理的pH相對(duì)對(duì)照組均有降低，其中T2無(wú)植物實(shí)驗(yàn)土壤的pH高于其他有植物實(shí)驗(yàn)土壤，而T1、T3、T4和T5實(shí)驗(yàn)土壤pH較CK分別顯著降低了1.86%、1.61%、2.60%、1.73%，這是因?yàn)橛筒说母禃?huì)分泌有機(jī)酸和腐殖質(zhì)類物質(zhì)，可以降低土壤pH。此外，添加降解菌和有機(jī)肥也可能改善土壤鹽堿環(huán)境，使得土壤pH較自然降解情況下降低。

圖2 實(shí)驗(yàn)土壤pH

2.3 對(duì)PAHs的去除效果

由表4可見，實(shí)驗(yàn)組的總PAHs都低于對(duì)照組，特別是T3、T4、T5聯(lián)合修復(fù)的3個(gè)處理與對(duì)照組相比差異顯著，T3殘留的總PAHs質(zhì)量濃度最低，為(3.88±0.61) mg/kg，比CK降低了55.25%。其中，各組低環(huán)PAHs質(zhì)量濃度為1.99～4.61 mg/kg，高環(huán)PAHs為1.70～4.06 mg/kg。T1、T2和T5表現(xiàn)為高環(huán)PAHs含量大于低環(huán)PAHs，其余處理均表現(xiàn)為低環(huán)PAHs含量大于高環(huán)PAHs。在T1中，由于油菜對(duì)PAHs的吸收作用，與CK相比低環(huán)PAHs降低了53.14%，高環(huán)PAHs降低了22.66%。T2只接種了降解菌，該降解菌表現(xiàn)出對(duì)低環(huán)和高環(huán)PAHs相似的去除效果，其中低環(huán)PAHs比CK降低了19.09%，而高環(huán)PAHs降低了17.98%。T3既種植油菜也接種降解菌，低環(huán)和高環(huán)PAHs含量較對(duì)照都大幅降低，其中低環(huán)降低了52.71%，高環(huán)降低了58.13%。由此可以看出，油菜的種植對(duì)低環(huán)PAHs去除作用較明顯，接種降解菌可以更好地去除高環(huán)PAHs，植物與微生物之間起到相互促進(jìn)、互為補(bǔ)充的作用。T4經(jīng)油菜種子載體固定化降解菌處理后，PAHs的含量相比T3反而又有所增加，不過T3～T5殘留的總PAHs濃度差異不大。

表4 實(shí)驗(yàn)土壤中殘留的PAHs質(zhì)量濃度1)

3 討 論

本研究比較了植物與微生物單一或聯(lián)合去除污染土壤中PAHs的效果。首先，土壤中的PAHs在自然條件下也會(huì)通過風(fēng)化、揮發(fā)、光降解和微生物降解等作用而去除[12]。植物修復(fù)和微生物修復(fù)都能提升PAHs的去除率。油菜單獨(dú)處理主要對(duì)2～3環(huán)的低環(huán)PAHs效果較好，這是因?yàn)橹参飳?duì)小分子物質(zhì)的吸收效果更好。有研究表明，植物根系吸收并傳輸?shù)降厣喜糠值腜AHs多為低環(huán)PAHs，高環(huán)PAHs因水溶性低，不易被植物吸收，更很難通過木質(zhì)部向上運(yùn)輸[13]。已有研究表明，除植物吸收PAHs外，聯(lián)合微生物修復(fù)往往能促進(jìn)植物生長(zhǎng)和提高PAHs的去除[14]。游離降解菌對(duì)植物生長(zhǎng)表現(xiàn)出促進(jìn)作用，在植物葉長(zhǎng)、葉寬、根長(zhǎng)和莖長(zhǎng)上都有體現(xiàn)[15]。但將降解菌固定化處理后，油菜的生理生長(zhǎng)表現(xiàn)變差，可能的原因是降解菌突破包衣與外界土壤接觸可能會(huì)延緩，因此在同樣的修復(fù)周期內(nèi)植物生長(zhǎng)就延遲，導(dǎo)致收獲的生物量減少；另一可能的原因是，降解菌包埋在種子載體的包衣內(nèi)，凝膠無(wú)法及時(shí)轉(zhuǎn)運(yùn)代謝產(chǎn)物，導(dǎo)致大量幼苗根系分泌物和降解菌代謝廢物積累，使得植物生長(zhǎng)受到抑制[16-17]。

將油菜與降解菌聯(lián)合起來(lái)后，土壤中PAHs(無(wú)論是低環(huán)還是高環(huán))含量都出現(xiàn)大幅下降，可見植物聯(lián)合微生修復(fù)可以結(jié)合植物吸收與微生物降解的優(yōu)點(diǎn)，既發(fā)揮了植物根系對(duì)污染物的吸收作用，又利用了根際微生物與植物根系的共生作用，可提高降解菌的降解效果，因此去除效果好[18]。油菜聯(lián)合降解菌修復(fù)的T3、T4和T5處理對(duì)PAHs去除效果均優(yōu)于單一修復(fù)，其中油菜包衣種子種植并接種復(fù)合菌劑的處理效果最佳，將降解菌固定化后，去除效果反而下降，這同樣可能是因?yàn)槟z包衣對(duì)降解菌利用有機(jī)污染物形成了障礙。

4 結(jié) 論

(1) 油菜包衣種子較未包衣種子的植株生物量增加，葉寬和莖長(zhǎng)增長(zhǎng)，色素含量增多，光合速率加快。

(2) 油菜聯(lián)合降解菌可以互相促進(jìn)、互為補(bǔ)充，從而顯著提高生物量和光合速率等，對(duì)PAHs的降解效果增強(qiáng)，并可改善土壤pH，但將降解菌固定化的效果不如讓降解菌游離化。

(3) 油菜對(duì)低環(huán)PAHs去除效果較好，主要是吸收作用；而降解菌可以更好地通過降解作用去除高環(huán)PAHs。