劉 寧，張柏林 ，郝美林，宋培勇，周 鴻，黃姍姍，秦仁海，馮華華

(遵義師范學院 生物與農業(yè)科技學院，貴州 遵義 523006)

長順綠殼蛋雞2009 年被列入地方遺傳資源保護品種[1]，是貴州省優(yōu)良地方蛋肉兼用型品種，具有體型緊湊、蛋質量較小(約45 g/枚)、產蛋率較低(35%～45%)等特點。其所產雞蛋具有殼綠、蛋白質含量高、氨基酸組成豐富等優(yōu)點，具有較高的經濟價值，深受消費者喜愛[2]。

茶多酚(tea polyphenols，TP)是茶葉中具有保健作用的主要成分，是茶中多酚類物質的總稱，包括兒茶素類(黃烷醇類)、黃酮類和黃酮醇類等成分，約占綠茶干質量的 30%～42%[3-4]。研究表明：TP 具有抗氧化及改善畜禽產品品質等功能[5]。前期研究發(fā)現：在長順綠殼蛋雞日糧中添加400 mg/kg TP 能顯著提高血漿抗氧化性能[6]。有關TP 對機體脂質及膽固醇影響的研究表明：TP 能夠顯著降低人和其他動物肝臟及外周組織中的脂質水平，有效降低高血脂病的發(fā)生率[7-8]。在蛋雞日糧中添加TP 能夠降低雞蛋中的膽固醇含量[9-10]。然而，蛋雞通過外源性途徑吸收膽固醇的量極低，主要是內源性合成[11]。肝臟是機體合成膽固醇的主要部位，其合成量約占機體膽固醇合成總量的75%以上，蛋雞每天合成約300 mg膽固醇，且大部分存在于蛋黃中，以產蛋的形式排出[12]。但到目前為止，有關TP 添加對長順綠殼蛋雞肝臟膽固醇合成及脂質代謝影響的研究還較少。本研究以長順綠殼蛋雞為研究對象，飼喂含有不同水平的TP 日糧，研究TP 對血清脂質指標、蛋黃膽固醇含量及肝臟脂質代謝相關基因表達的影響，以期為長順綠殼蛋雞低膽固醇蛋生產提供技術參考。

1 材料與方法

1.1 試驗設計及飼養(yǎng)管理

選擇180 日齡的長順綠殼蛋雞240 羽，隨機分為對照組(飼喂基礎日糧)、200 mg/kg TP 組和400 mg/kg TP 組(分別在飼喂基礎日糧的基礎上添加200 和400 mg/kg TP)，每組10 個重復，每個重復8 羽。TP 由遵義陸圣康源科技開發(fā)有限責任公司提供(純度≥95%)，添加量參照何柳青[10]的研究。預飼期為7 d，正試期為56 d。在整個飼養(yǎng)期間，所有雞只自由采食和飲水。具體日糧配方及營養(yǎng)成分見表1。

表1 基礎日糧組成及營養(yǎng)水平(風干基礎)Tab.1 Diet composition and nutrient level (air-dry basis)

1.2 血清采集

宰殺前(正式試驗期第55 天)所有雞只進行空腹處理(宰前12 h 斷料不斷水)。每個重復隨機選擇1 羽進行翅下靜脈采血至10 mL 離心管中，傾斜放置4 h 后4 ℃、3 000 r/min 冷凍離心10 min，然后收集血清并保存于-20 ℃冰箱待測。

1.3 蛋清及蛋黃收集

試驗結束前1 d，每個處理選擇10 枚蛋，用蛋清分離器分離蛋清和蛋黃，分別收集至10 mL離心管中，-20 ℃條件下保存待測。

1.4 肝臟樣品收集

翅下靜脈采血完畢后將雞只立即宰殺，打開腹腔，采集肝臟樣品約5 g 至5 mL 凍存管中，保存于液氮中待測。

1.5 測定指標與方法

1.5.1 血清脂質指標

血清總膽固醇(total cholesterol，TC)、甘油三酯(triglyceride，TG)、高密度脂蛋白膽固醇(highdensity lipoprotein cholesterol，HDL-C)和低密度脂蛋白膽固醇(low density lipoprotein cholesterol，LDL-C)含量采用購自南京建成生物工程研究所的商品化試劑盒測定，方法參照說明書。

1.5.2 蛋清總巰基含量及羰基含量測定

采用購自南京建成生物工程研究所的商品化試劑盒測定蛋清中總巰基及羰基含量，方法參照說明書。

1.5.3 蛋黃TC 含量的測定

參照RODJAN 等[13]的方法并稍作修改。利用磁力攪拌器將蛋黃攪勻，稱取蛋黃液0.25 g 置于盛有10 mL 2% KOH 乙醇溶液中離心，然后在50 ℃水浴中孵育2 h；將冷卻后的混合物加入蒸餾水5 mL，冷卻至室溫后進行渦旋混勻，將分離得到的上清液加入正己烷10 mL，渦旋2 min 至分離，重復提取2 次；將收集到的正己烷相轉移至另一個50 mL 的離心管中，取混合正己烷餾分20 mL 于旋轉蒸發(fā)器中干燥，用2 mL 正己烷重組；隨后加入乙酸，在硫酸亞鐵中飽和，并用濃硫酸滴定。將TC 標準品[ 購自生工生物工程(上海)股份有限公司 ]用甲醇配制成1 mg/mL 的溶液，將不同體積的TC 標準溶液(0.5～5.0 mL)與測定樣品進行同樣處理，并繪制標準曲線。將上述制備的測定樣本反應10 min 后測定490 nm 處的光密度值，并依據標準曲線計算蛋黃TC 含量。

1.5.4 熒光定量PCR

利用熒光定量PCR 法對肝臟腺苷單磷酸活化蛋白激酶(adenosine monophosphate activated protein，AMPK)、乙酰輔酶A 羧化酶(acetyl CoA carboxylase，ACC)、β-羥-β-甲基戊二酸單酰輔酶A 還原酶(β-hydroxy-β-methylglutaric acid monoacyl coenzyme A reductase，HMGR)、膽固醇-7-羥化酶(cholesterol-7-hydroxylase，CYP7A1)和低密度脂蛋白受體(low density lipoprotein receptor，LDLR) mRNA 表達水平進行測定。稱取冷凍肝臟約18 mg，加入預冷的RNAiso Plus 試劑1 mL，均漿30 s 后提取RNA，并用微量分光光度計測定RNA 濃度。采用反轉錄試劑盒將提取的RNA反轉錄為cDNA，熒光定量PCR 程序為：95 ℃預變性30 s，1 個循環(huán)；95 ℃延伸5 s，40 個循環(huán)；60 ℃ 退火34 s，1 個循環(huán)。內參基因為βactin；引物序列見表2。采用2-ΔΔCt法測定目的基因的表達[14]，所有樣品均測定3 次。

表2 引物序列Tab.2 Sequences of primers

1.6 數據處理

采用SPSS 20.0 的單因素方差分析(ANOVA)進行數據處理，采用Duncan’s 多重比較對數據進行顯著性分析。結果均以“平均值±標準差”表示。

2 結果與分析

2.1 日糧添加茶多酚(TP)對血清脂質代謝指標的影響

由表3 可知：400 mg/kg TP 組蛋雞血清TC、TG 和LDL-C 含量顯著低于對照組(P＜0.05)，HDLC 含量顯著高于對照組(P＜0.05)，但LDL-C/HDL-C 與對照組無顯著差異(P＞0.05)；200 mg/kg TP對上述指標均無顯著影響(P＞0.05)，且200 和400 mg/kg TP 組之間的各血清脂質代謝指標均無顯著差異(P＞0.05)。

表3 日糧添加茶多酚(TP)對長順綠殼蛋雞血清脂質代謝指標的影響Tab.3 Effects of tea polyphenols (TP) supplementation on indexes of lipid metabolism in serum of Changshun green-shell laying hens

2.2 日糧添加茶多酚(TP)對蛋清總巰基及羰基含量的影響

由圖1 可知：400 mg/kg TP 組蛋雞蛋清羰基含量顯著低于對照組(P＜0.05)，蛋清總巰基含量顯著高于對照組(P＜0.05)；與對照組相比，添加200 mg/kg TP 對蛋清總巰基和羰基含量均無顯著影響(P＞0.05)；與200 mg/kg TP 組相比，400 mg/kg TP 組蛋雞蛋清羰基含量顯著降低(P＜0.05)，而蛋清總巰基含量無顯著差異(P＞0.05)。

圖1 日糧添加茶多酚(TP)對長順綠殼蛋雞蛋清羰基和總巰基含量的影響Fig.1 Effects of tea polyphenols (TP) supplementation on the contents of carbonyl and total sulfhydryl in egg white of Changshun green-shell laying hens

2.3 日糧添加茶多酚(TP)對蛋黃TC 含量的影響

由圖2 可知：200 和400 mg/kg TP 組蛋雞蛋黃TC 含量均顯著低于對照組(P＜0.05)，且400 mg/kg TP 組蛋雞蛋黃TC 含量顯著低于200 mg/kg TP 組(P＜0.05)。

圖2 日糧添加茶多酚(TP)對長順綠殼蛋雞蛋黃膽固醇含量的影響Fig.2 Effects of tea polyphenols (TP) supplementation on the contents of cholesterol in egg yolk of Changshun green-shell laying hens

2.4 日糧添加茶多酚(TP)對肝臟脂質代謝相關基因表達的影響

由圖3 可知：與對照組相比，200 和400 mg/kg TP 組蛋雞肝臟ACC、HMGR及CYP7A1mRNA表達水平均顯著降低 (P＜0.05)，而AMPK及LDLRmRNA 表達水平均顯著增加 (P＜0.05)；與200 mg/kg TP 組相比，400 mg/kg TP 組肝臟ACC、HMGR及CYP7A1mRNA 表達水平顯著降低(P＜0.05)，但AMPK及LDLRmRNA 表達水平顯著升高 (P＜0.05)。

圖3 日糧添加茶多酚(TP)對長順綠殼蛋雞肝臟脂質代謝相關基因表達的影響Fig.3 Effects of tea polyphenols (TP) supplementation on the mRNA expressions of relative genes of lipid metabolism in liver of Changshun green-shell laying hens

3 討論

3.1 日糧添加茶多酚(TP)對血清脂質指標的影響

血清TC、TG、LDL-C 及HDL-C 是反映機體脂質代謝狀態(tài)的重要指標。研究表明：LDLC 是循環(huán)TC 的主要載體，是引起動脈粥樣硬化的血脂高危因素，可導致心血管疾病的發(fā)展[15]；相反地，HDL-C 參與脂質從外周組織轉移到肝臟進行分解代謝[16]，引導多余的TC 排出血漿，從而有助于降低心血管疾病的風險。本研究發(fā)現：添加400 mg/kg TP 可顯著降低長順綠殼蛋雞血清LDL-C 含量，顯著增加血清HDL-C 含量。何俊金等[17]和HUANG 等[18]等研究也均表明：添加綠茶多酚能顯著增加蛋雞血清HDL-C 含量，降低血清LDL-C 含量。以上結果提示：TP 添加有利于降低蛋雞體內脂質積累。有研究表明：日糧添加高劑量TP (600 和800 mg/kg)可顯著降低蛋雞血清HDL-C 含量，這可能意味著高劑量TP 添加對蛋雞機體代謝產生了副作用[17]。本研究還發(fā)現：添加TP 可降低蛋雞血清TC 及TG 含量。與此相似，WANG 等[9]在羅曼粉蛋雞日糧中添加不同劑量TP，結果發(fā)現：日糧添加300 mg/kg TP 可顯著降低蛋雞血清TC 及TG 含量。此外，HUANG等[18]研究表明：灌服100 mg/kg TP 可顯著降低肉雞血清TG 及TC 含量。以上結果提示：日糧添加TP 有利于降低蛋雞血清脂質水平。

3.2 日糧添加茶多酚(TP)對蛋清羰基及總巰基含量的影響

哈夫單位是衡量雞蛋蛋白品質的重要指標。課題組前期研究表明：添加400 mg/kg TP 可顯著增加雞蛋的哈夫單位[7]。雞蛋蛋清約含80%的蛋白質，是良好的蛋白來源[19]。隨著蛋雞產蛋日齡的增加，活性氧含量增加，蛋白質受活性氧攻擊的概率增加，蛋白質被氧化[20]，引起其結構改變，從而使得羰基含量增加，巰基含量降低[21]。蛋白質羰基和巰基是衡量蛋白質氧化的重要指標[22]。本研究表明：日糧添加400 mg/kg TP 可顯著降低蛋雞蛋清羰基含量，顯著增加巰基含量。汪小紅[19]以64 周齡海蘭褐蛋雞為試驗對象，在其日糧中添加200 mg/kg TP，結果發(fā)現：添加TP可增加蛋清巰基含量，降低羰基含量；王曉翠[22]的研究也表明：日糧添加200 mg/kg 綠茶多酚能夠顯著增加蛋清巰基含量，降低蛋清羰基含量。這可能是由于添加TP 能夠降低蛋白氧化，改善蛋雞的抗氧化防御體系，進而改善蛋雞氧化/抗氧化體系。此外，TP 可與蛋白質形成多酚—蛋白質復合物以增加蛋白質的抗氧化性能，從而保護細胞和組織免受蛋白氧化損傷[20,22]。

3.3 日糧添加茶多酚(TP)對蛋黃TC 的影響

雞蛋中脂質含量高達30%，且蛋黃中TC 含量達195～230 mg[23]。過量食用雞蛋會增加中老年人和糖尿病患者血液中的TC 水平，從而增加患心血管疾病的風險[24-25]。研究證實：天然多酚、兒茶素和黃酮醇可清除活性氧并螯合金屬離子，從而降低雞蛋的TC 含量[26]。本研究表明：日糧添加200 和400 mg/kg TP 可顯著降低長順綠殼蛋雞蛋黃TC 含量。已有研究表明：日糧添加3%綠茶粉可顯著降低蛋黃TC 含量[27]。何柳青[10]以44 周齡綠殼蛋雞為對象，分別在其日糧中添加0、200 和400 mg/kg TP，結果發(fā)現：日糧添加200 和400 mg/kg TP 能顯著降低蛋黃TC 含量，這可能是由于TP 可減少極低密度脂蛋白進入卵母細胞的數量，以此降低蛋黃TC 含量[10]，但具體的機制還有待于進一步研究。

3.4 日糧添加茶多酚(TP)對肝臟脂質代謝相關基因表達的影響

AMPK 是蛋白激酶信號級聯通路的下游組成部分，是感知細胞內能量狀態(tài)的關鍵因素，是生物體能量代謝調控的關鍵因子[28]。研究表明：AMPK 可調控ACC 和HMGR 的表達從而抑制肝臟TC 的合成[29]。本研究表明：添加TP 可顯著增加肝臟AMPKmRNA 的表達水平，但顯著降低ACCmRNA 的表達水平。BANERJEE 等[30]研 究表明：灌服綠茶提取物可顯著增加小鼠肝臟AMPK 蛋白的表達水平；黃進寶[29]研究表明：灌服TP 可顯著增加肉雞AMPKmRNA 表達水平；陳曉春等[31]研究表明：日糧中添加0.6%洛伐他汀(HMGR 抑制劑)可顯著提高蛋雞肝臟AMPK酶活性，而降低ACC 酶活性，且顯著降低雞蛋中TC 含量。以上研究結果提示：添加TP 可能通過增加肝臟的AMPKmRNA 表達而降低ACCmRNA 表達，進而影響蛋黃TC 含量。

肝臟和卵巢是蛋雞合成TC 的場所，其中，肝臟合成的TC 量占機體TC 合成總量的75%以上，是蛋雞合成TC 的主要場所[12]。HMGR 是內源性TC 合成的重要限速酶，當TC 吸收增加時，HMGR 表達降低，進而導致內源性TC 合成下降[32]。本研究表明：添加TP 可顯著降低肝臟HMGRmRNA 的表達水平，說明添加TP 有利于降低肝臟TC 的合成。已有研究表明：抑制肝臟TC 合成可以降低雞蛋TC 含量[33]，這與本研究中TP 添加降低蛋黃中TC 含量的結果一致，但TP 抑制HMGRmRNA 表達的機制還有待于進一步研究。

多數學者認為：LDLR、HMGR 和CYP7A1在肝臟TC 合成、運輸及分泌中發(fā)揮重要作用[34]。LDLR 還廣泛分布于肝細胞表面，負責細胞和血漿中LDL-C 的運輸和清除[15]。有研究表明：飲食誘導的TC 合成抑制與肝臟HMGR 表達水平的降低有關，并可能激活肝臟LDLR 表達增加，進而促進LDL-C 的清除[34-35]。本研究表明：添加TP可顯著增加肝臟LDLRmRNA 的表達水平，這可能是由于添加TP 可降低肝臟TC 的內源性合成，促進LDL-C 的清除，進而降低雞蛋中的TC 含量。肝臟中TC 轉化為膽汁酸，最終通過糞便排出體外，是機體清除多余TC 最主要的方式[36]。CYP7A1 是肝臟中TC 轉化為膽汁酸的限速酶，參與維持機體TC 代謝的平衡[37]，但本研究中添加TP 可顯著降低肝臟CYP7A1mRNA 的表達水平，這可能意味著肝臟TC 分解代謝水平的下降，也可能是對添加TP 使得蛋雞肝臟TC 合成下降結果的反饋，從而維持體內TC 含量的動態(tài)平衡[38]。

4 結論

日糧添加400 mg/kg 茶多酚可增強長順綠殼蛋雞蛋清的抗氧化性，降低蛋黃總膽固醇含量，有利于改善血清及肝臟脂質代謝。