牟 豪，余遠(yuǎn)迪，許國(guó)洋，楊 柳

(1.重慶市畜牧科學(xué)院，重慶 402460；2.重慶市獸用生物制品工程技術(shù)研究中心，重慶 402460)

山羊痘是由山羊痘病毒(goat pox virus，GTPV)引起的一種急性接觸性傳染病，患病羊表皮甚至黏膜出現(xiàn)典型的痘疹結(jié)節(jié)。該病嚴(yán)重影響動(dòng)物采食和生長(zhǎng)，造成生產(chǎn)力下降；羊毛和皮革質(zhì)量下降；甚至繼發(fā)感染，造成患病動(dòng)物死亡。該病分布廣泛，危害嚴(yán)重，給養(yǎng)羊業(yè)帶來(lái)巨大經(jīng)濟(jì)損失[1-3]，是養(yǎng)羊業(yè)重點(diǎn)防控的疫病之一，世界動(dòng)物衛(wèi)生組織(Office International Des Epizooties，OIE)將其列為A 類疫病。

預(yù)防該病最有效的方式是接種疫苗，國(guó)內(nèi)以GTPV AV41 株制作的疫苗廣泛用于山羊注射免疫，為防控山羊痘取得了良好效果。目前，GTPV 的分離和培養(yǎng)大多采用OFTu[4]、MDBK[5]、Vero[6]和Hela[7]等細(xì)胞，GTPV 還能在綿羊睪丸細(xì)胞中增殖[8]。值得注意的是，山羊睪丸原代細(xì)胞常用于培養(yǎng)GTPV[9]，原代培養(yǎng)細(xì)胞與體內(nèi)原組織在形態(tài)結(jié)構(gòu)和功能上相似性較大，其培養(yǎng)的病毒較敏感、病毒滴度較高[10]。因此，山羊睪丸原代細(xì)胞作為天然宿主細(xì)胞對(duì)GTPV 的增殖培養(yǎng)具有先天的優(yōu)勢(shì)，研究原代細(xì)胞對(duì)病毒的增殖特性十分必要。本試驗(yàn)以山羊睪丸細(xì)胞為宿主細(xì)胞、GTPV AV41 株為靶標(biāo)病毒，開(kāi)展病毒在不同日齡山羊原代睪丸細(xì)胞的傳代培養(yǎng)特性、GTPV 引起的細(xì)胞病變效應(yīng)以及在不同日齡細(xì)胞中的增殖效率比較等研究，以豐富山羊睪丸細(xì)胞培養(yǎng)GTPV 的相關(guān)資料。研究結(jié)果將豐富山羊睪丸細(xì)胞對(duì)GTPV 培養(yǎng)特性的相關(guān)材料，以篩選更適合GTPV 弱毒株培養(yǎng)的細(xì)胞，為山羊痘病毒的增殖培養(yǎng)及新型弱毒疫苗的研究提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)動(dòng)物及毒株

供試山羊分別為7 日齡和60 日齡健康雄性山羊各1 頭，未接種GTPV 疫苗，來(lái)源于重慶市大足某羊場(chǎng)。GTPV AV41 弱毒疫苗株由重慶市獸用生物制品工程技術(shù)研究中心保存。

1.2 試劑及儀器

胰酶、磷酸緩沖液、胎牛血清和DMEM 培養(yǎng)基均購(gòu)自Gibco 公司；青霉素和鏈霉素購(gòu)自Hyclone 公司；25 cm36 孔板和Alexa Fluor 488 Goat Anti-mouse IgG 購(gòu)自Thermo Fisher Scientific 公司；SYBR Green I 購(gòu)自寶生生物公司；小鼠P32 抗血清由重慶市畜牧科學(xué)院獸醫(yī)獸藥研究所保存。

1.3 細(xì)胞分離培養(yǎng)及最大傳代次數(shù)比較

無(wú)菌采取供試山羊睪丸組織，按照標(biāo)準(zhǔn)規(guī)程去除脂肪和包膜，剪碎、洗滌、消化和分散細(xì)胞，制成原代山羊睪丸細(xì)胞[11]。用含10%胎牛血清的DMEM 培養(yǎng)基作為生長(zhǎng)液，分別將處理好的細(xì)胞分裝到細(xì)胞培養(yǎng)瓶中，37 ℃培養(yǎng)，連續(xù)觀察其生長(zhǎng)情況，待長(zhǎng)滿單層后，分別按照常規(guī)方法進(jìn)行消化和傳代。

1.4 不同日齡山羊原代睪丸細(xì)胞的生長(zhǎng)效率

待山羊原代睪丸細(xì)胞傳至第2 代時(shí)，通過(guò)長(zhǎng)時(shí)間動(dòng)態(tài)細(xì)胞成像及數(shù)據(jù)分析系統(tǒng)，每隔6 h 在固定點(diǎn)采集1 次細(xì)胞圖像，通過(guò)軟件分析得出每個(gè)時(shí)間點(diǎn)細(xì)胞的生長(zhǎng)融合度。

1.5 觀察GTPV 引起的細(xì)胞病變

選擇生長(zhǎng)良好的山羊睪丸單層細(xì)胞，分別按照細(xì)胞培養(yǎng)液的10%接種GTPV，感染2 h 后棄病毒液，用PBS 洗2 遍，加入細(xì)胞維持液，37 ℃培養(yǎng)，同時(shí)設(shè)置陰性對(duì)照；通過(guò)長(zhǎng)時(shí)間動(dòng)態(tài)細(xì)胞成像及數(shù)據(jù)分析系統(tǒng)每隔6 h 在固定位置采集1 次細(xì)胞圖片，連續(xù)觀察細(xì)胞病變情況。

1.6 間接免疫熒光比較GTPV 增殖效率

將7 日齡和60 日齡山羊原代細(xì)胞分別鋪板6 孔板且內(nèi)置爬片，按1.5 節(jié)方法取山羊痘病毒感染細(xì)胞，并于感染3 d 后棄去細(xì)胞上清，用PBS液清洗3 次；向每孔加入預(yù)冷的4%多聚甲醛組織固定液，4 ℃固定15 min，棄去固定液，用PBS 液清洗3 次；再加入5%脫脂奶粉500 μL，室溫封閉1 h，用PBS 清洗3 次。加入按照1∶200倍稀釋的小鼠P32 抗血清，37 ℃孵育1 h，棄抗體，用PBST 洗3 次，每次5 min；避光加入1 000倍稀釋的Alexa Fluor 488 Goat Anti-mouse IgG 1 mL，37 ℃避光孵育45 min，棄去孔內(nèi)液體，用PBST 洗滌3 次，每次5 min，置于熒光顯微鏡下觀察[12]。同時(shí)設(shè)置陽(yáng)性血清、陰性血清和PBS 組作為對(duì)照。

1.7 熒光定量PCR 研究山羊痘病毒的增殖效率

選擇生長(zhǎng)良好的7 日齡和60 日齡山羊原代睪丸單層細(xì)胞，分別按照細(xì)胞培養(yǎng)液的10%接種GTPV，感染 2 h 后棄去病毒液，用PBS 洗2 遍；加入細(xì)胞維持液，37 ℃培養(yǎng)，在細(xì)胞接毒48、72 和96 h 時(shí)收獲病毒液。同時(shí)設(shè)置陰性對(duì)照。每個(gè)病毒樣本取病毒液200 μL 用于提取病毒DNA，采用熒光定量PCR 方法擴(kuò)增山羊痘病毒P32基因，上游引物為：TGTTATTATGTTTGATCCCGTTC；下游引物為：GTAAAATCATATAAGGTGCGACAA[13]。設(shè)置10 μL 的初始反應(yīng)體系，包括上、下游引物各0.2 μL，SYBR Green I 5 μL，模板1 μL，nuclease-free H2O 3.6 μL。反應(yīng)程序?yàn)椋?5 ℃預(yù)變性15 min，94 ℃變性30 s，55 ℃退火60 s，72 ℃延伸60 s，30 個(gè)循環(huán)，72 ℃延伸10 min。每個(gè)樣品設(shè)置3 個(gè)重復(fù)，計(jì)算平均Ct 值并根據(jù)課題組前期建立的標(biāo)準(zhǔn)曲線方程(y=-4.083x+43.147)計(jì)算病毒拷貝數(shù)。

2 結(jié)果與分析

2.1 細(xì)胞培養(yǎng)特性

由圖1 可知：2 個(gè)日齡的細(xì)胞在培養(yǎng)24、72 和120 h 的細(xì)胞形態(tài)無(wú)明顯差異，均呈不規(guī)則的多邊形。通常情況下，2 個(gè)日齡的細(xì)胞在2～3 d后長(zhǎng)至致密單層細(xì)胞，細(xì)胞邊界清晰；繼續(xù)培養(yǎng)至120 h，細(xì)胞出現(xiàn)老化脫落的現(xiàn)象。為了解2 種原代細(xì)胞的最大傳代次數(shù)，將2 個(gè)日齡的細(xì)胞分別連續(xù)傳代，隨著傳代次數(shù)的增加，細(xì)胞分裂能力下降，生長(zhǎng)速度減緩；傳至6～7 代后，2 個(gè)日齡的山羊睪丸細(xì)胞已無(wú)法長(zhǎng)滿至單層。

圖1 7 日齡和60 日齡山羊原代睪丸細(xì)胞的形態(tài)Fig.1 Morphology of 7-day-old and 60-day-old goat testicular cells

2.2 不同日齡的山羊原代睪丸細(xì)胞生長(zhǎng)曲線

由圖2 可知：7 日齡山羊原代睪丸細(xì)胞的生長(zhǎng)速率稍高于60 日齡的原代睪丸細(xì)胞，兩者的細(xì)胞融合度均在約42 h 達(dá)到最大，分別為94.2%和89.0%；42 h 后，由于細(xì)胞老化造成細(xì)胞脫落，導(dǎo)致細(xì)胞融合度減小。

圖2 不同日齡的山羊原代睪丸細(xì)胞的生長(zhǎng)曲線Fig.2 Growth curve of goat primary testicular cells in different ages

2.3 GTPV 疫苗株接種后的細(xì)胞形態(tài)

GTPV 疫苗株在7 日齡和60 日齡的原代山羊睪丸細(xì)胞均能產(chǎn)生細(xì)胞病變，但是發(fā)生病變的時(shí)間以及病變特征存在差異。由圖3 可知：7 日齡細(xì)胞在接種GTPV 84 h 后，細(xì)胞病變率達(dá)到90%以上，細(xì)胞形態(tài)呈現(xiàn)不規(guī)則的形狀，細(xì)胞間質(zhì)變大，脫落，出現(xiàn)明顯的交織拉網(wǎng)現(xiàn)象；接種90 h 后細(xì)胞間質(zhì)進(jìn)一步變大，脫落。由圖4 可知：60 日齡的細(xì)胞在接種GTPV 84 h 后也出現(xiàn)明顯的細(xì)胞病變，細(xì)胞變圓，細(xì)胞間出現(xiàn)明顯的聚團(tuán)，但與7 日齡細(xì)胞相比，細(xì)胞間交織拉網(wǎng)現(xiàn)象明顯減少；到90 h 時(shí)，細(xì)胞出現(xiàn)交織拉網(wǎng)和脫落的現(xiàn)象?？梢?jiàn)，60 日齡細(xì)胞相較于7 日齡細(xì)胞出現(xiàn)細(xì)胞圓縮、交織拉網(wǎng)和脫落現(xiàn)象的時(shí)間均較晚。

圖3 7 日齡山羊原代睪丸細(xì)胞接種GTPV 疫苗株后的細(xì)胞形態(tài)Fig.3 Morphology of 7-day-old goat testicular primary cells infected by GTPV

圖4 60 日齡山羊原代睪丸細(xì)胞接種GTPV 疫苗株后的細(xì)胞形態(tài)Fig.4 Morphology of 60-day-old goat testicular primary cells infected by GTPV

2.4 山羊痘病毒的增殖效率

由圖5 可知：60 日齡細(xì)胞的熒光信號(hào)多于7日齡細(xì)胞，初步判定山羊痘病毒的增殖效率在60日齡的原代山羊睪丸細(xì)胞中較高。由圖6 可知：7日齡羊睪丸細(xì)胞感染GTPV 疫苗株48、72 和96 h后，3 個(gè)重復(fù)的平均Ct 值為29.0、28.2 和27.1，病毒拷貝數(shù)分別為2 884、5 128 和8 912 copies/μL；60日齡羊睪丸細(xì)胞感染GTPV 疫苗株48、72 和96 h后，3 個(gè)重復(fù)的平均Ct 值為30.2、28.9 和26.7，病毒拷貝數(shù)分別為1 622、3 090 和10 715 copies/μL。

圖5 山羊痘病毒的增殖效率Fig.5 Comparison of propagation efficiency of GTPV

圖6 GTPV 在2 個(gè)日齡細(xì)胞上的增殖效率比較Fig.6 Comparison of propagation efficiency of GTPV in different ages goat testicular cells

3 討論

本研究分析了GTPV 感染7 日齡和60 日齡山羊原代睪丸細(xì)胞的細(xì)胞病變效應(yīng)以及增殖特性，結(jié)果表明：7 日齡和60 日齡山羊睪丸細(xì)胞的形態(tài)均呈不規(guī)則多邊形，與楊璐等[14]分離到的2 日齡原代山羊睪丸細(xì)胞形態(tài)相似；但不同日齡細(xì)胞的生長(zhǎng)速率和最大傳代次數(shù)等無(wú)明顯差異，與唐娜等[8]對(duì)綿羊原代睪丸細(xì)胞的研究結(jié)果相似。本研究結(jié)果為選擇60 日齡山羊睪丸制備原代細(xì)胞提供了數(shù)據(jù)支撐。在接種GTPV 后，細(xì)胞都在90 h 內(nèi)產(chǎn)生了細(xì)胞病變，最后脫落，與李有文等[15]在綿羊睪丸細(xì)胞中接種GTPV 后產(chǎn)生細(xì)胞病變現(xiàn)象的時(shí)間相似；60 日齡山羊睪丸細(xì)胞接種GTPV 后產(chǎn)生的細(xì)胞病變過(guò)程與周建勝等[16]對(duì)3 月齡綿羊原代睪丸細(xì)胞接種GTPV 后產(chǎn)生的細(xì)胞病變特征非常相似，同樣經(jīng)歷了細(xì)胞圓縮、脫落形成空斑和細(xì)胞堆積呈葡萄串狀的過(guò)程。此外，本研究不同日齡細(xì)胞產(chǎn)生細(xì)胞病變的特征有所差別，7 日齡細(xì)胞主要產(chǎn)生明顯的交織拉網(wǎng)現(xiàn)象，60 日齡細(xì)胞主要產(chǎn)生細(xì)胞聚團(tuán)，這可能是由于7 日齡細(xì)胞比60 日齡細(xì)胞對(duì)GTPV 更敏感，在感染病毒后細(xì)胞迅速發(fā)生病變，細(xì)胞緊密連接變?nèi)?，產(chǎn)生交織拉網(wǎng)現(xiàn)象。

從間接免疫熒光的結(jié)果初步判斷：GTPV 在60 日齡細(xì)胞中的增殖效率比在7 日齡細(xì)胞中高。熒光定量PCR 的檢測(cè)結(jié)果顯示：病毒拷貝數(shù)隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)而增加，但是60 日齡細(xì)胞在96 h的增殖效率高于7 日齡細(xì)胞，與間接免疫熒光試驗(yàn)的結(jié)果一致。結(jié)合2 個(gè)日齡細(xì)胞感染病毒后的培養(yǎng)特性來(lái)看，產(chǎn)生該結(jié)果的原因可能是7 日齡細(xì)胞比60 日齡細(xì)胞對(duì)GTPV 更敏感，病毒增殖引起7 日齡細(xì)胞發(fā)生嚴(yán)重病變，導(dǎo)致細(xì)胞更容易脫落。從藏綿羊羔羊細(xì)胞增齡性變化特征來(lái)看，3 月齡前，綿羊羔羊細(xì)胞處于胚胎型向成熟型過(guò)渡的時(shí)期，隨著日齡增加，細(xì)胞的局部分泌性顆粒為細(xì)胞提供結(jié)構(gòu)支持[17]。由此推測(cè)，7 日齡細(xì)胞自身成熟度不及60 日齡細(xì)胞，最終導(dǎo)致病毒的增殖效率低于60 日齡細(xì)胞，即GTPV 更適合采用60 日齡山羊睪丸細(xì)胞進(jìn)行增殖。該結(jié)果表明：相對(duì)于7 日齡山羊睪丸原代細(xì)胞，選擇更成熟的60 日齡山羊睪丸原代細(xì)胞有利于GTPV 增殖。然而，除7 日齡和60 日齡細(xì)胞外，是否還存在最適于GTPV 增殖培養(yǎng)的其他年齡段的山羊睪丸原代細(xì)胞，將是需要進(jìn)一步研究的重點(diǎn)。

4 結(jié)論

7 日齡和60 日齡山羊睪丸細(xì)胞均能在感染GTPV 后發(fā)生細(xì)胞病變，但60 日齡細(xì)胞的增殖效率高于7 日齡細(xì)胞。本研究結(jié)果對(duì)山羊痘病毒弱毒疫苗株的培養(yǎng)有一定的指導(dǎo)作用。