段天才，楊貴樹，蘇瓊珍，張海玲

（1.楚雄市動物疫病預(yù)防中心，云南 楚雄 675000；2.云南農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，云南 昆明 650201；3.楚雄市呂合鎮(zhèn)農(nóng)業(yè)農(nóng)村服務(wù)中心，云南 楚雄 675009；4.楚雄市東瓜鎮(zhèn)農(nóng)業(yè)農(nóng)村服務(wù)中心，云南 楚雄 675005）

0 引言

戊型肝炎這一疾病屬于一種自限性、急性疾病，是由戊型肝炎病毒感染導(dǎo)致。在1989年東京國際非甲非乙型肝炎學(xué)術(shù)會議上，正式定名為戊型肝炎（HE）[1]。戊型肝炎病毒（hepatitisEvirus，HEV）是一種經(jīng)腸道傳播的肝炎病毒，豬是主要的病毒儲庫[2]。我國豬場養(yǎng)殖中，存在較為復(fù)雜的戊肝病毒流行情雜，往往具備較高的感染率，且同一區(qū)域可能會存在不同基因型混合感染的情況。病毒會進(jìn)行基因重組，可以不斷遺傳進(jìn)化在防治上存在一定難度[3]。

我國許多地區(qū)已有豬HE流行的報道，目前云南省尚沒有文獻(xiàn)報道。將云南省楚雄地區(qū)主要規(guī)?；i場及屠宰廠的豬作為研究對象，通過血清學(xué)調(diào)查分析的方式，了解豬戊型肝炎的流行情況，掌握云南省楚雄地區(qū)是否有該病的存在及其流行分布情況，為深入開展云南省楚雄地區(qū)豬HE的病毒分離、分子流行病學(xué)調(diào)查、傳播途徑、發(fā)病機(jī)制研究及建立相應(yīng)的檢測和防制技術(shù)奠定基礎(chǔ)[4-8]。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 被檢血清來源

2015年6月至2016年4月，隨機(jī)選擇云南省楚雄地區(qū)幾個大型屠宰場和養(yǎng)殖場，采集血液樣品，共計307份。置于37 ℃溫箱1 h，3 000 r/min室溫離心10 min，取上清，置于--20℃冰箱中凍存待檢，樣品采集情況見表1。

表1 血清樣本采集情況

1.1.2 儀器材料

1.5 mL離心管、高速離心機(jī)、低溫冰箱、移液槍、恒溫培養(yǎng)箱、洗板機(jī)（BioTekElx50TM）、酶標(biāo)儀（BioTekElx800TM），由云南農(nóng)業(yè)大學(xué)動物醫(yī)學(xué)實(shí)驗教學(xué)中心提供。

1.1.3 檢測試劑盒

檢測過程中，應(yīng)用到的方法是酶聯(lián)免疫法，試劑盒是在北京萬泰生物藥業(yè)股份有限公司購買的豬戊型肝炎病毒IgG抗體診斷試劑盒。

1.2 試驗方法

將試劑盒平衡至室溫約30 min。選擇50 mL濃縮洗滌液（20×），通過蒸餾水進(jìn)行稀釋，使其變?yōu)? 000 mL，以備后續(xù)使用。通過微孔板按照順序進(jìn)行樣品編號，設(shè)置3個陰性對照孔、2個陽性對照孔、1個空白對照孔，其中，空白對照空中無需添加酶標(biāo)試劑與樣品。所有孔中加入100 μL樣品稀釋液，隨后將待檢樣品及10 μL的隱性對照與陽性對照，通過輕微振蕩后，使其混合均勻。封板后，將其放置于溫度為37 ℃的環(huán)境中，半小時后，將封板膜去掉，利用洗板機(jī)進(jìn)行洗滌，通常要洗5遍，最后一次應(yīng)盡量減少其中水分。除空白孔外，所有對照孔均應(yīng)加入100 μL的酶標(biāo)二抗。同樣，通過封板膜進(jìn)行封板處理，將其放置在37 ℃環(huán)境中，放置半小時后，將封板膜揭掉，用洗板機(jī)進(jìn)行5遍洗滌，盡量將其中水分排干。將顯色劑A、B放如各孔中，加入量均為50 μL，并振蕩均勻，放置于37 ℃避光環(huán)境下，顯色15 min。將50 μL終止液加入到每個孔洞中，搖晃均勻，通過450 nm/630 nm酶標(biāo)儀雙波長，進(jìn)行各孔A值測定。

1.3 結(jié)果判定

陰性對照孔A值不可超過0.1，若通過實(shí)際測量發(fā)現(xiàn)存在A值超過0.1的孔，應(yīng)將該孔舍棄，如果大于0.1的孔超過1個，應(yīng)重復(fù)實(shí)驗。陽性對照孔A值不應(yīng)低于0.8，若有兩孔A值在0.8下，則需要重復(fù)實(shí)驗。

臨界值計算中，需要求得陰性對照孔A值均值，隨后加上0.16，得出的數(shù)則為臨界值。若樣品A值≥臨界值，說明抗體反應(yīng)陽性，相反，則說明抗體反應(yīng)陰性。

1.4 統(tǒng)計學(xué)處理

利用SPSS統(tǒng)計學(xué)軟件，進(jìn)行所有數(shù)據(jù)的統(tǒng)計學(xué)分析。

2 結(jié)果與分析

（1）在所檢測的307份血清樣品中，共有173份陽性血清，總體陽性率為56.35%。表明豬戊型肝炎在云南楚雄地區(qū)的流行較嚴(yán)重，檢測結(jié)果見表2。

表2 樣品中HEV-IgG抗體的診斷結(jié)果

（2）在所檢測的307份血清樣品中，129份采自育肥豬，81份呈陽性，陽性率為62.79%，73份采自仔豬，21份呈陽性，陽性率為28.77%。表明育肥豬戊肝感染率高于仔豬戊肝感染率。育肥豬與仔豬的戊肝感染在統(tǒng)計學(xué)上存在顯著性差異（P＜0.05），檢測結(jié)果見表3。

表3 不同年齡段豬血清樣品HEV-IgG抗體診斷結(jié)果

（3）在所檢測的307份血清樣品中，88份采自母豬，62份呈陽性，陽性率為70.45%，17份采自公豬，9份呈陽性，陽性率為52.94%。表明性別對抗體水平測定值有影響，母豬的戊肝感染率顯著高于公豬的感染率（P＜0.05），檢測結(jié)果見表4。

表4 母豬、公豬血清樣品HEV-IgG抗體診斷結(jié)果

（4）在所檢測的307份血清樣品中，有178份來自各個養(yǎng)殖場，檢測陽性率為51.68%，129份來自屠宰場，檢測陽性率為62.79%。結(jié)果發(fā)現(xiàn)屠宰場豬比養(yǎng)殖場豬出現(xiàn)較高的血清抗體陽性率，檢測結(jié)果見表5。

表5 不同場所豬血清樣品HEV-IgG抗體診斷結(jié)果

3 討論

（1）戊型肝炎暴發(fā)流行的主要傳播途徑是經(jīng)水傳播，因為飲用了沒有經(jīng)過煮沸的河水，導(dǎo)致該疾病的流行，接觸污水可能是維持感染HEV的重要危險因素[9]。

（2）統(tǒng)計學(xué)分析表明云南省楚雄地區(qū)豬HEVIgG陽性率與年齡呈顯著相關(guān)，本研究中育肥豬陽性率要高于仔豬的，這與國內(nèi)報道不同年齡段表現(xiàn)出不同的HEV-lgG陽性率，3月齡以上豬戊肝血清抗體陽性率要高于3月齡以下豬的陽性率的結(jié)果相一致[10]。統(tǒng)計學(xué)分析也表明母豬的戊肝感染率顯著高于公豬的感染率（P＜0.05）。屠宰場豬比養(yǎng)殖場豬出現(xiàn)較高的血清抗體陽性率。目前，國內(nèi)外文獻(xiàn)對不同種用豬戊肝感染率差異未見報道，統(tǒng)計學(xué)分析的結(jié)果是由于豬感染戊肝后不同種用豬自身產(chǎn)生抗體的差異還是統(tǒng)計樣品數(shù)量大小差異因素造成還有待進(jìn)一步探索[11-12]。相關(guān)報道中顯示，如果豬場存在良好的飼養(yǎng)條件，則不會存在較高的戊型肝炎病毒感染率，研究中發(fā)現(xiàn)云南省楚雄地區(qū)豬存在較高的戊型肝炎病毒陽性率[13]。

4 結(jié)束語

關(guān)于云南省流行HE的基因型情況，還有待于進(jìn)行病毒學(xué)鑒定。實(shí)驗主要應(yīng)用到的是酶聯(lián)免疫吸附測定法，在此基礎(chǔ)上，調(diào)查該地區(qū)大型豬場及屠宰場的戊型肝炎病毒流行情況，了解豬HE在楚雄地區(qū)的發(fā)生流行情況及其流行規(guī)律，探索有效的防制方法，對建立公共衛(wèi)生防疫措施具有重要科學(xué)意義和應(yīng)用價值。