杜 菲，鄭麗環(huán)，王 征，房健健，焦清海

(河北省邯鄲市第一醫(yī)院重癥醫(yī)學(xué)科，河北 邯鄲 056002)

急性腎損傷(acute kidney injury，AKI)在臨床上被認(rèn)為是3個(gè)月內(nèi)患者腎臟結(jié)構(gòu)、功能持續(xù)異常的一種危重癥，其所伴隨著短時(shí)間內(nèi)腎臟功能障礙，患者尿量降低，水電解質(zhì)失衡，臨床上多采用血液凈化對此類患者進(jìn)行治療，但其療效不一，患者預(yù)后不同[1-2]。目前隨著對AKI的不斷深入研究顯示，此病的發(fā)生與多種因素相互作用相關(guān)，其中微小RNA(micoRNA，miR)屬于一類長度大約為22nt的RNA，廣泛分布于多個(gè)腎臟、肝臟、肺等組織中，參與惡性腫瘤、腎臟疾病、心血管疾病等多種疾病的發(fā)生發(fā)展，在疾病診斷和療效評估中具有重要的意義[3-4]。基于上述背景，在本研究中分析miR家族成員微小RNA-142-3p(miR-142-3p)、微小RNA-216a(miR-216a)、微小RNA-107-5p(miR-107-5p)在ICU血液凈化AKI患者中的表達(dá)及對療效的評估價(jià)值，以分析是否可用于臨床AKI的診斷和行血液凈化治療療效的評估。

1 資料與方法

1.1一般資料 選取2020年1月—2021年1月我院ICU收治的行血液凈化治療的AKI患者132例作為AKI組，男性75例，女性57例，年齡26～68歲，平均(44.65±17.60)歲，病因：中毒29例，感染58例，外科術(shù)后45例。同期選取于我院行健康體檢的健康志愿者80例作為健康組，男性46例，女性34例，年齡25～70歲，平均(45.13±19.00)歲。2組在性別、年齡方面差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，具有可比性。見表1。

表1 2組一般資料比較

本研究所有相關(guān)事項(xiàng)研究對象及其家屬均知情同意，簽署了知情同意書，且經(jīng)醫(yī)院倫理委員會(huì)審核批準(zhǔn)。

1.2納入標(biāo)準(zhǔn)和排除標(biāo)準(zhǔn) 納入標(biāo)準(zhǔn)：AKI組患者均符合《急性腎損傷診斷與分類專家共識》[5]中對AKI的診斷標(biāo)準(zhǔn)，均行血液凈化治療。健康組既往無腎病史、血液凈化史，身體健康。排除標(biāo)準(zhǔn)：合并惡性腫瘤者；預(yù)計(jì)生存期<7 d者；妊娠期或者哺乳期婦女；精神、溝通障礙者。

1.3主要試劑及設(shè)備 cDNA模板(艾美捷科技有限公司)，SYB Green(廈門慧嘉生物科技有限公司)，蒸餾水(上海依赫生物科技有限公司)，Takara逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(武漢極捷生物科技有限公司)，PCR儀(賽默飛世爾科技(中國)有限公司)，血液凈化儀(費(fèi)森尤斯醫(yī)療集團(tuán))，濾器為Gambro Filtral12聚丙烯腈膜濾器(AN69，1.2 m2)。

1.4方法

1.4.1miR-142-3p、miR-216a、miR-107-5p檢測方法 抽取健康組、AKI組血液凈化治療前1 d、治療3 d后清晨空腹靜脈血，采用實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)法測定miR-142-3p、miR-216a、miR-107-5p表達(dá)量，提取外周血RNA，使用Takara逆轉(zhuǎn)錄試劑盒行逆轉(zhuǎn)錄處理后獲得cDNA，采用Primer5.0軟件設(shè)計(jì)引物序列，啟動(dòng)PCR儀，反應(yīng)體系：0.4 μL上下游引物、1 μL cDNA模板、10 μL SYB Green，加蒸餾水至20 μL。反應(yīng)條件：95 ℃預(yù)變性1 s、95 ℃ 5 s、60 ℃ 31 s，共進(jìn)行40個(gè)循環(huán)，以β-actin作為內(nèi)參，采用2-△△Ct方法計(jì)算出miR-142-3p、miR-216a、miR-107-5p表達(dá)量，Ct=Ct(miRNA)-Ct(內(nèi)參β-actin)。miR-142-3p上游引物序列：5′-GGGTGTAGTGTTTCCTACT-3′，下游引物序列：5′-CAGTGCGTGTCGTGGAGT-3′；miR-216a上游引物序列：5′-ATCCAGTGCGTGTCGTG-3′，下游引物序列：5′-TGCTTAATCTCAGCTGGCA-3′miR-107-5p上游引物序列：5′-GGAGCAGCATTG-TACAGG-3′，下游引物序列：5′-CAGTGCGTGT-CGTGGA-3′；內(nèi)參β-actin引物序列：上游：5′-CTGGCACCACACCTTCTACAATGAGC-3′，下游：5′-GAGGATCTTCATGAGGTA-GTCAGT-3′。

1.4.2臨床療效評價(jià) 參照《急性腎損傷診斷與分類專家共識》[5]評價(jià)ICU AKI患者行血液凈化(連續(xù)性靜脈-靜脈血液濾過模式，連續(xù)治療36 h停止12 h，然后再治療24 h)的療效，分為治愈、好轉(zhuǎn)、無效三個(gè)等級，治愈：患者內(nèi)生肌酐清除率(80～120 mL/min)及血肌酐(45～205 μmol/L)水平基本恢復(fù)正常，尿量恢復(fù)至正常量。好轉(zhuǎn)：患者內(nèi)生肌酐清除率及血肌酐較前少改善，最少改善10%以上，尿量較前明顯增多。無效：患者內(nèi)生肌酐清除率及血肌酐較前無明顯改善，甚至惡化，持續(xù)無尿或少尿。治療有效例數(shù)=治愈例數(shù)+好轉(zhuǎn)例數(shù)，其余為治療無效。

1.4.3預(yù)后隨訪 對患者行為期30 d的隨訪，統(tǒng)計(jì)預(yù)后死亡、存活情況，分析miR-142-3p、miR-216a、miR-107-5p在死亡、存活患者中的表達(dá)情況。

1.5統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 應(yīng)用SPSS 26.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析處理。計(jì)量資料采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)和配對t檢驗(yàn)。計(jì)數(shù)資料比較采用χ2檢驗(yàn)；相關(guān)性采用Pearson相關(guān)性分析；采用ROC曲線分析miR-142-3p、miR-216a、miR-107-5p對ICU AKI患者行血液凈化治療療效的評估價(jià)值。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1miR-142-3p、miR-216a、miR-107-5p在健康組、AKI組中的表達(dá)對比 與健康組相比，AKI組miR-142-3p、miR-107-5p表達(dá)升高，miR-216a表達(dá)降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見表2。

表2 miR-142-3p、miR-216a、miR-107-5p在健康組、AKI組中的表達(dá)比較

2.2miR-142-3p、miR-216a、miR-107-5p在AKI組患者行血液透析治療前后表達(dá)對比 與治療前相比，治療后AKI組患者miR-142-3p、miR-107-5p表達(dá)升高，miR-216a表達(dá)降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見表3。

表3 miR-142-3p、miR-216a、miR-107-5p在AKI組患者行血液透析治療前后表達(dá)比較

2.3miR-142-3p、miR-216a、miR-107-5p與AKI組患者臨床療效的關(guān)系 根據(jù)治療是否有效分為治療有效組110例，治療無效組22例。與治療有效組相比，miR-142-3p、miR-107-5p在治療無效組表達(dá)升高，miR-216a在治療無效組中表達(dá)降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見表4。

表4 miR-142-3p、miR-216a、miR-107-5p與AKI組患者臨床療效的關(guān)系

2.4miR-142-3p、miR-216a、miR-107-5p與AKI組患者預(yù)后的關(guān)系 與存活患者相比，miR-142-3p、miR-107-5p在死亡患者中表達(dá)升高，miR-216a在死亡患者中表達(dá)降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見表5。

表5 miR-142-3p、miR-216a、miR-107-5p與AKI組患者預(yù)后的關(guān)系

2.5ROC曲線分析miR-142-3p、miR-216a、miR-107-5p對ICU血液凈化AKI患者療效的評估價(jià)值 ROC曲線分析顯示，miR-142-3p、miR-216a、miR-107-5p對ICU血液凈化AKI患者療效的評估價(jià)值均較高(P<0.05)。見圖1，表6。

圖1 miR-142-3p、miR-216a、miR-107-5p評估ICU血液凈化AKI患者療效的ROC曲線

表6 ROC曲線分析miR-142-3p、miR-216a、miR-107-5p對ICU血液凈化AKI患者療效的評估價(jià)值

3 討 論

目前臨床上對于AKI的逐漸深入發(fā)現(xiàn)，此病的發(fā)生所伴隨著多種細(xì)胞因子的改變，屬于一個(gè)多因素共同作用的結(jié)果，目前臨床上對于此病的治療多以血液凈化手段為主[6-8]。但研究顯示，AKI患者行血液凈化療效不一，因此尋找有效評估患者臨床療效的指標(biāo)，以早期預(yù)測其作用效果，及早行針對性的措施干預(yù)，對提高血液凈化療效具有重要的意義[9-10]。miR是近年來受到臨床廣泛關(guān)注的非編碼小分子RNA，其不僅在肝臟、腎臟等多種昂起中發(fā)揮著重要的生物學(xué)作用，也能釋放進(jìn)入至血液循環(huán)中，研究認(rèn)為，miR在血液中的穩(wěn)定性較強(qiáng)，且其化學(xué)結(jié)構(gòu)較為簡單，在循環(huán)系統(tǒng)中使用miRNA作為生物標(biāo)志物的性能明顯優(yōu)于其他血清標(biāo)志物[11-13]。

miR-142-3p、miR-216a、miR-107-5p均屬于miRNA家族成員，臨床研究顯示，miR-142-3p可介導(dǎo)局部炎癥反應(yīng)，參與炎癥類疾病的發(fā)生，如膿毒癥、腎損傷等[14]。研究認(rèn)為miR-142-3p具有較強(qiáng)的促炎活性，其廣泛分布于多種臟器組織中，參與多種炎癥性疾病的發(fā)生進(jìn)展，且其自身可經(jīng)進(jìn)入至血液循環(huán)，誘導(dǎo)瀑布式的炎癥級聯(lián)反應(yīng)[15-16]。胡曉寧等[17]在其研究中分析膿毒癥所致的AKI傷患者miR-142-3p的表達(dá)情況，其研究結(jié)果顯示，miR-142-3p的AKI中表達(dá)升高，參與此病的發(fā)生發(fā)展，可用于此病預(yù)后病死的預(yù)測，此結(jié)果與本研究中認(rèn)為與健康人相比，AKI患者miR-142-3p表達(dá)升高的研究結(jié)果保持一致，分析其原因可能與AKI發(fā)生后患者機(jī)體處于高度炎癥級聯(lián)狀態(tài)，而炎癥級聯(lián)狀態(tài)促進(jìn)miR-142-3p表達(dá)，使其表達(dá)量升高相關(guān)，且對于其與患者行血液凈化治療的關(guān)系，本研究結(jié)果顯示，其表達(dá)高低與血液凈化療效相關(guān)，對于血液凈化療效理想的患者來說其表達(dá)量降低，且預(yù)后存活的患者表達(dá)降低更為顯著，分析其原因可能與血液凈化清除機(jī)體內(nèi)毒素，抑制局部炎癥反應(yīng)，抑制患者疾病進(jìn)一步進(jìn)展，存活患者疾病明顯得到改善，進(jìn)而抑制miR-142-3p表達(dá)相關(guān)。

miR-216a屬于miRNA家族成員成員之一，其定位于基因組2p16.1，臨床研究已經(jīng)證實(shí)其參與機(jī)體多種生物學(xué)過程，包括細(xì)胞生物學(xué)行為、組織損傷、局部炎癥反應(yīng)等[18-20]。目前臨床上對于miR-216a的研究主要致力于惡性腫瘤，研究認(rèn)為其具有抑癌的作用，關(guān)于miR-216a與AKI關(guān)系的研究較少，僅有萬笑笑[21]在其研究中認(rèn)為miR-216a與腎小管上皮細(xì)胞AKI相關(guān)，其過表達(dá)可抑制AKI，因此本研究根據(jù)上述研究推測miR-216a在表達(dá)較低的狀態(tài)下參與AKI的發(fā)生發(fā)展，結(jié)果顯示，與健康人相比，AKI患者miR-216a表達(dá)明顯降低，此結(jié)果與上述研究結(jié)果保持一致。本研究進(jìn)一步分析患者經(jīng)血液凈化治療上述指標(biāo)的變化，結(jié)果顯示，治療有效和預(yù)后存活的患者miR-216a表達(dá)明顯升高，但并未進(jìn)一步分析其具體作用機(jī)制，因此上述研究結(jié)果還需后續(xù)研究進(jìn)一步分析驗(yàn)證，以期望miR-216a成為臨床上AKI患者血液凈化療效的評估指標(biāo)。

miR-107-5p屬于miR-107的一種表現(xiàn)形式，miR-107在序列上具有高度保守性，其在肌肉組織、胰腺組織、腎組織等多種組織以及癌細(xì)胞中表達(dá)升高，目前已經(jīng)在臨床上被證實(shí)，miR-107參與子宮內(nèi)膜癌、非小細(xì)胞肺癌、急性主動(dòng)脈分裂等多種疾病的發(fā)生發(fā)展[22-24]。本研究分析miR-107-5p在AKI中的表達(dá)情況，結(jié)果顯示，miR-107-5p在AKI中表達(dá)升高，其明顯高于健康人，說明其參與此病的發(fā)生，與魏薇等[25]研究結(jié)果中認(rèn)為miR-107-5p在膿毒癥所致的AKI中表達(dá)升高的結(jié)果一致，進(jìn)一步證實(shí)了miR-107-5p與AKI的關(guān)系，分析其原因可能與miR-107-5p誘導(dǎo)局部炎癥反應(yīng)而促進(jìn)疾病的發(fā)生相關(guān)。且對于血液凈化療效理想、預(yù)后存活的患者來說其表達(dá)量升高，分析其原因可能于血液凈化清除機(jī)體內(nèi)毒素，抑制局部炎癥反應(yīng)相關(guān)。

雖然本研究分析了miR-142-3p、miR-216a、miR-107-5p在ICU血液凈化AKI患者中的表達(dá)及對療效的評估價(jià)值，但并未深入探究具體的作用機(jī)制，因此還需后續(xù)研究進(jìn)一步探索，以明確其機(jī)制，早期評估患者臨床療效，改善預(yù)后。

綜上所述，本研究顯示，AKI發(fā)生后存在miRNA表達(dá)變化異常情況，其中miR-142-3p、miR-107-5p高表達(dá)，miR-216a低表達(dá)，且對于血液凈化治療無效的患者來說上述變化更為顯著，提示著臨床上可根據(jù)上述指標(biāo)變化評估臨床療效，以根據(jù)評估結(jié)果行針對性措施干預(yù)，降低治療無效率，改善患者預(yù)后。