焦俊萍，鮑軍強，王志偉，田書娟

(河北醫(yī)科大學第一醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科，河北省腦老化與認知重點實驗室，河北 石家莊 050031)

缺血性腦中風是導致患者死亡和殘疾的主要原因，為患者、家庭及社會帶來了沉重的負擔[1]。依達拉奉是一種強抗氧化劑和羥自由基清除劑，能有效通過血腦屏障，減輕腦水腫，并抑制延遲神經(jīng)元死亡。右莰醇是γ-氨基丁酸A型受體(γ-aminobutyric acid type a receptor，GABAa)受體有效的正向激動劑，右莰醇在大鼠試驗中通過抑制促炎因子的產(chǎn)生對大鼠永久性腦缺血有神經(jīng)保護作用。研究證實二者結合具有協(xié)同作用，作為一種新型的神經(jīng)保護劑，可能有更好的臨床治療效果。多項國際研究已證實了阿替普酶靜脈溶栓的有效性及安全性，但溶栓后的再灌注損傷及出血風險，仍然是目前研究的重點。本研究通過靜脈溶栓后加用依達拉奉右莰醇，明確其減輕缺血再灌注損傷、調(diào)節(jié)免疫炎癥及保護血腦屏障的機制。

1 資料與方法

1.1一般資料 選取2019年9月—2020年9月河北醫(yī)科大學第一醫(yī)院急性缺血性腦卒中靜脈溶栓患者95例。按照治療方案不同分為2組，阿替普酶組40例，男性18例，女性22例，平均年齡(62.1±14.7)歲，高血壓25例，糖尿病17例，心房顫動5例；阿替普酶+依達拉奉右莰醇組55例,男性26例，女性29例，平均年齡(59.1±14.5)歲，高血壓27例，糖尿病22例，心房顫動8例。2組一般資料比較差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，具有可比性。

納入標準：年齡≥18歲；診斷為急性腦梗死；美國國立衛(wèi)生研究院中風量表(National Institutes of Health Stroke Scale，NIHSS)得分4～24分，運動障礙總分≥2分。排除標準：顱內(nèi)出血(包括腦實質出血、腦室內(nèi)出血、蛛網(wǎng)膜下腔出血、硬膜下/外血腫等)；既往顱內(nèi)出血史；近3個月有嚴重頭顱外傷史或卒中史；顱內(nèi)腫瘤、巨大顱內(nèi)動脈瘤；近期(3個月)有顱內(nèi)或椎管內(nèi)手術；近2周內(nèi)有大型外科手術；近3周內(nèi)有胃腸或泌尿系統(tǒng)出血；活動性內(nèi)臟出血；主動脈弓夾層；近1周內(nèi)有在不易壓迫止血部位的動脈穿刺；血壓升高：收縮壓≥180 mmHg(1 mmHg=0.133 kPa)，或舒張壓≥100 mmHg；急性出血傾向，包括血小板計數(shù)低于100×109/L或其他情況；24 h內(nèi)接受過低分子肝素治療；口服抗凝劑且國際標準化比值>1.7或凝血酶原時間>15 s；48 h內(nèi)使用凝血酶抑制劑或Xa因子抑制劑；血糖>22.22 mmol/L；頭顱電子計算機斷層掃描或磁共振成像提示大面積梗死(梗死面積>1/3大腦中動脈供血區(qū))；嚴重的肝、腎及心臟疾患；對阿替普酶、依達拉奉右莰醇過敏。

本研究經(jīng)過醫(yī)院倫理委員會批準，所有患者及家屬均知情同意且簽署知情同意書。

1.2方法

1.2.1給藥方法 阿替普酶為0.9 mg/kg，其中10%在最初1 min內(nèi)通過快速靜脈注射給藥，剩余的90%在1 h內(nèi)靜脈輸液。依達拉奉右莰醇為15 mL，2次/d，使用時加到100 mL生理鹽水中稀釋后靜脈滴注，30 min內(nèi)滴完。治療時間為14 d。

1.2.2觀察指標 終點事件為發(fā)病后14 d的NIHSS評分改善率，90 d的改良Rankin量表評分(Modified Rankin Scale，mRS)≤1的比例，治療后36 h內(nèi)癥狀性顱內(nèi)出血(symptomatic intracranial hemorrhage，sICH)的發(fā)生率。分析應用右旋莰醇的時間(<12 h、12～24 h、>24～48 h)、NIHSS評分(0～9、10～20、>20)、TOAST分型(大動脈粥樣硬化型、心源性栓塞型、小動脈閉塞型)等因素與90 d時mRS≤1的患者比例[No.(%)of mRS scores of ≤1，No.(%)of mRS≤1]的關系。

1.2.3實驗室檢查 入院時、14 d后采集2組患者的血清，黃嘌呤氧化酶測定超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)水平，流式細胞學法測定白細胞介素6(interleukin-6，IL-6)、腫瘤壞死因子α(tumor necrosis factor-α，TNF-α)、CD4陰性T淋巴細胞(CD4-negative T-lymphocytes，CD4-T)+CD8陰性T淋巴細胞(CD8-negative T-lymphocytes，CD8-T)細胞的水平，并計算CD4-T+CD8-T所占的百分比，聯(lián)免疫吸附測定法檢測基質金屬蛋白酶9(matrix metalloproteinase-9，MMP-9)的表達水平。

1.3統(tǒng)計學方法 應用SPSS 23.0統(tǒng)計軟件分析數(shù)據(jù)。計量資料比較采用獨立樣本的t檢驗和配對t檢驗，計數(shù)資料比較采用χ2檢驗，等級資料比較采用秩和檢驗。P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結 果

2.12組一般資料比較 2組NIHSS評分、TOAST分型、開始用藥時間及血清SOD、IL-6、TNF-α、MMP-9水平、CD4-T+CD8-T的計數(shù)以及其所占比例結果差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，見表1。

表1 2組一般資料比較

2.22組臨床療效比較 2組14 d時NIHSS評分改善率差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，90 d時mRS≤1比例分別為45%和67%，阿替普酶+依達拉奉右莰醇組更高，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。阿替普酶+依達拉奉右莰醇治療后36 h 內(nèi)sICH的發(fā)生率為1.8%，低于國際卒中溶栓登記處溶栓安全執(zhí)行組織(Safe Implementation of Treatmems in Stroke，International Stroke Thrombolysis Registry,SITS-ISTR)結果(2.2%)，差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，見表2。

表2 2組臨床療效比較

2.32組治療前后SOD、IL-6、TNF-α、MMP-9水平比較 治療前，2組的SOD、IL-6、TNF-α、MMP-9水平比較差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)；治療后，2組SOD、IL-6、TNF-α、MMP-9水平均低于治療前，rt-PA+依達拉奉右莰醇組SOD、IL-6、TNF-α、MMP-9水平低于rt-PA組，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，見表3。

表3 2組治療前后SOD、IL-6、TNF-α、MMP-9水平比較

2.42組的流式細胞學指標比較 治療前，2組血清中CD4-T+CD8-T的計數(shù)及其所占比例差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)；治療后，2組血清中CD4-T+CD8-T的計數(shù)及其所占比例均低于治療前，且靜脈溶栓+依達拉奉右莰醇組低于靜脈溶栓組，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，見表4，圖1。

圖1 2組治療前后流式細胞學檢測結果展示

表4 2組的流式細胞學指標比較

2.5多因素 Logistic 回歸分析結果 以治療第90天mRS評分≤1分為因變量(否=0，是=1)，以NIHSS評分(<1分=0，≥1分=1)、TOAST分型(不明原因分型=0，明確分型=1)、依達拉奉右莰醇的開始用藥時間(>48 h=0，≤48 h=1)對相關危險因素行Logestic回歸分析，結果顯示終點事件與入院的NIHSS評分、依達拉奉右莰醇的開始用藥時間有相關性(P<0.05)，見表5。

表5 治療第90天mRS評分≤1分的比例多因素回歸分析

2.6對不同的影響因素進行亞組分析 阿替普酶組mRS評分≤1分患者18例，阿替普酶+右旋莰醇組37例，2組在NIHSS評分和TOAST分型的患者分布中差異無統(tǒng)計學意義(P<0.05)，見表6。

表6 2組NIHSS評分及TOAST分型比較

3 討 論

急性缺血性腦卒中的早期識別、緊急介入治療以及在專門的腦卒中中心進行治療可以顯著降低腦卒中相關的發(fā)病率和病死率[1]。靜脈溶栓治療是目前國際指南廣泛推薦的首選急救方法[2]。但研究證實tPA加重內(nèi)皮損傷，增加中性粒細胞和T細胞的黏附和遷移，這與出血轉化有關[3]。腦缺血再灌注能夠使瀕臨死亡的腦細胞恢復生機，促使梗死癥狀得到改善[4]，但同時會使缺血細胞的損傷程度加強，導致腦缺血再灌注損傷的發(fā)生，對多個系統(tǒng)和器官造成損害。腦血流中斷后，氧和葡萄糖供應不足，導致細胞離子穩(wěn)態(tài)失衡，神經(jīng)元和膠質細胞去極化。電壓依賴性Ca2+通道被激活，增加神經(jīng)元中活性氧(reactive oxygen species,ROS)的形成。同時，神經(jīng)元質膜上Na+/K+/ATP酶的破壞導致離子失衡，導致腦水腫。由于缺血缺氧進一步加劇腦組織pH值的下降，酸中毒促進細胞死亡。自由基可介導線粒體損傷，增加線粒體腫脹和通透性，激活基質金屬蛋白酶，通過降解膠原和層聯(lián)蛋白基底層破壞血腦屏障。內(nèi)皮細胞通透性屏障破壞，導致通透性增加，促炎基因表達，炎癥介質釋放，內(nèi)皮細胞表面黏附分子(如細胞間黏附分子1、p選擇素)激活內(nèi)皮細胞，使其具有血栓形成和促炎作用。白細胞浸潤腦實質是由選擇素、免疫球蛋白和整合素介導的。中性粒細胞是滲透性腦缺血中最早出現(xiàn)顯著上調(diào)的白細胞亞型，此類細胞聚集并釋放炎癥介質，如誘導型一氧化氮合酶和基質金屬蛋白酶，加重腦血流阻塞，促進血腦屏障損傷[5]。缺血損傷引發(fā)的眾多事件中，值得注意的是氧化應激、白細胞聚集和血腦屏障的破壞[6]。同時越來越多的證據(jù)表明，在腦缺血損傷后發(fā)生的病理生理變化中，免疫系統(tǒng)發(fā)揮著復雜的功能[7]。免疫細胞不僅參與神經(jīng)炎癥過程，而且在維持中樞神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi)穩(wěn)態(tài)上發(fā)揮一定作用[8]。腦梗死后周圍小膠質細胞迅速被激活并可持續(xù)數(shù)周，標志物CD11b、CD45和Iba1上調(diào)。隨著活化，小膠質細胞的表型發(fā)生變化，可簡單分為促炎型和抗炎型，分別為M1型和M2型。一般認為，在急性期(1 d內(nèi))，小膠質細胞的增殖和活化會引起對中樞神經(jīng)系統(tǒng)有害的強烈炎癥反應，而在慢性期(發(fā)病后數(shù)天)，小膠質細胞可產(chǎn)生多種保護性細胞因子，如神經(jīng)營養(yǎng)因子胰島素樣生長因子1(insulin like growth factor 1,IGF1)、這有助于缺血性損傷后的神經(jīng)修復和存活[9]。腦梗死急性期T細胞可以通過多種途徑影響炎癥反應，如調(diào)節(jié)免疫反應、免疫細胞相互作用、調(diào)節(jié)神經(jīng)生成和血管生成等[10]。在慢性期，抗原呈遞啟動針對大腦的適應性免疫反應，這可能是后遺癥的基礎[11]，臨床研究顯示，原位癌后T淋巴細胞池的分化向促炎亞群傾斜[12]。CD3+CD4-CD8-T細胞(雙陰性T細胞；DNTs)在調(diào)節(jié)外周免疫和炎癥的相關疾病中有多種功能。然而，DNTs腦免疫和炎癥反應。阻斷這條通路后，DNTs介導的神經(jīng)炎癥收到抑制，從而改善了腦梗死的預后，確定了DNTs在腦梗死的關鍵作用，也表明這個獨特的群體是缺血性腦卒中治療的靶點[13-16]。

氧自由基清除劑依達拉奉已被證明可以通過抑制神經(jīng)毒性、慢性炎癥和調(diào)節(jié)內(nèi)皮和神經(jīng)元蛋白的表達，減輕缺血性卒中中神經(jīng)元和內(nèi)皮細胞的損傷。在缺血/再灌注損傷中，右莰醇已被證實通過多種分子途徑，如減少活性氧的生成、抑制NO和NO合酶途徑，抑制炎癥過程和caspase相關細胞凋亡，達到神經(jīng)保護作用。此外，其高滲透性可以幫助其他藥劑容易穿透血腦屏障，從而更有效地發(fā)揮作用。一項納入1 665例多中心臨床試驗研究證實，依達拉奉右莰醇組在第90天功能良好預后(mRS評分≤1)的患者比例顯著高于依達拉奉組[17-19]。且臨床試驗證實其安全性高[20]。本研究通過阿替普酶與依達拉奉右莰醇聯(lián)用，第90天mRS評分≤1的患者比例優(yōu)于阿替普酶組。依達拉奉右莰醇組有1例出現(xiàn)溶栓后出血，發(fā)生在溶栓后24 h內(nèi)，且癥狀較前加重，但患者預后較好，14 d時mRS評分為1分。有1例胸部CT證實的左肋腰部皮下血腫，后期血液吸收良好，6例輕微的牙齦出血。多因素回歸分析顯示，第90天mRS評分≤1的患者比例與患者NIHSS評分、依達拉奉右莰醇用藥時間有關，與TOAST分型無顯著相關性，需要臨床更多樣本研究證實。依達拉奉右莰醇+阿替普酶組治前后，能增加SOD濃度，降低IL-6、TNF-α和MMP-9以及DNTs的水平，較阿替普酶組效果更明顯，說明其改善臨床癥狀及降低顱內(nèi)出血風險與抗氧化、抗炎、保護血腦屏障、調(diào)節(jié)免疫反應的機制密切相關。通過亞組分析，對于NIHSS評分在10～20分、TOAST分型為LAA的患者，48 h內(nèi)聯(lián)合應用依達拉奉右莰醇效果更好。本研究探討依達拉奉右莰醇改善預后的影響因素，并探討了其在調(diào)節(jié)免疫、預防溶栓后出血或者梗死后出血方面的作用及機制，期待遠期更大樣本量的前瞻性研究。

綜上所述，依達拉奉右莰醇可通過抗氧化、抗炎、保護血腦屏障、調(diào)節(jié)免疫反應的機制，減輕rt-PA靜脈溶栓后的腦缺血再灌注損傷，發(fā)揮顯著的神經(jīng)保護作用，且越早應用改善預后越顯著。