陳夫圓，孫利平，朱遠(yuǎn)見，孟猛

骨肉瘤是一種好發(fā)于青少年或兒童的惡性骨腫瘤。雖然手術(shù)、化療和放療等常規(guī)治療方法使病人預(yù)后的生存率有所改善，但對(duì)多數(shù)已發(fā)生轉(zhuǎn)移病人的治療作用并不理想［1-2］。因此，如何有效地抑制腫瘤細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)移是治療骨肉瘤的重要策略。研究顯示，微小RNAs（microRNAs，miRNAs）可通過調(diào)控相關(guān)靶基因在骨肉瘤在內(nèi)的多種腫瘤的發(fā)生發(fā)展過程中發(fā)揮著致癌或抑癌作用［3-8］。微小RNA-490-3p（miR-490-3p）是miRNAs中的重要一員，被證實(shí)在結(jié)腸癌、胃癌和肝癌等多種腫瘤組織或細(xì)胞中異常低表達(dá)，且可通過調(diào)控細(xì)胞增殖、侵襲、遷移和凋亡等過程發(fā)揮著重要的抑癌作用［9-11］。已有研究指出，miR-490-3p在骨肉瘤組織中表達(dá)下調(diào)，且其表達(dá)水平與遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移、臨床晚期、整體生存率和無復(fù)發(fā)生存率顯著相關(guān)［12］；而上調(diào)其表達(dá)可通過靶向調(diào)控高遷移率族蛋白A2（HMGA2）表達(dá)抑制癌細(xì)胞增殖并誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡［13］；然而，其對(duì)骨肉瘤細(xì)胞侵襲和遷移的作用并不明確。因此，本研究于2019年9月至2020年4月進(jìn)行體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)，觀察miR-490-3p對(duì)骨肉瘤MG63細(xì)胞侵襲和遷移的影響，旨在探究miR-490-3p在骨肉瘤轉(zhuǎn)移中的作用及其可能機(jī)制，以期為骨肉瘤的治療提供分子靶點(diǎn)。

1 材料與方法

1.1 主要試劑與儀器人骨肉瘤細(xì)胞株MG63購于中科院上海細(xì)胞庫，miR-490-3p模擬物（miR-490-3p mimics）、miR-490-3p抑制劑（anti-miR-490-3p）及其相應(yīng)的模擬物陰性對(duì)照miR-NC、抑制劑陰性對(duì)照（anti-miR-NC）和PCR引物購于上海吉瑪公司。RPMI-1640培養(yǎng)基購于美國Hyclone公司，Transwell小室購于美國Costor公司，胰蛋白酶和胎牛血清購于美國Gibco公司，cDNA第一鏈合成試劑盒購于美國Thermo公司，LipofectamineTM2000轉(zhuǎn)染試劑購于美國Invitrogen公司，雙熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)試劑盒購于美國Promega公司，兔抗人β-肌動(dòng)蛋白（β-actin）單克隆抗體購于北京中杉金橋公司，兔抗人FK506相關(guān)蛋白14（FKBP14）、基質(zhì)金屬蛋白酶-2（MMP-2）多克隆抗體購于美國Abcam公司，鼠抗人鈣黏蛋白E（E-cadherin）單克隆抗體和Twist多克隆抗體購于美國Santa Cruz公司。人FKBP1基因ORF全長cDNA克隆表達(dá)載體及其空載體對(duì)照購于北京義翹神州科技有限公司。二氧化碳培養(yǎng)箱，美國Thermo公司；PCR儀，美國MJ Research公司；凝膠成像系統(tǒng)，美國BioRad公司；光學(xué)顯微鏡和熒光顯微鏡，日本Olympus公司。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)、分組與轉(zhuǎn)染以含10%胎牛血清、100 U/mL鏈霉素和100 U/mL鏈霉素的RPMI-1640完全培養(yǎng)基于5%二氧化碳、37℃和飽和濕度的細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)常規(guī)培養(yǎng)，待細(xì)胞貼壁生長至90%時(shí)，采用0.25%胰蛋白酶消化傳代。將生長狀況良好的指數(shù)期MG63細(xì)胞分為對(duì)照組（未處理）、miR-NC組（轉(zhuǎn)染miR-NC）和miR-490-3p組（轉(zhuǎn)染miR-490-3p mimics）。當(dāng)細(xì)胞匯合度達(dá)70%時(shí)，參照轉(zhuǎn)染試劑LipofectamineTM2000說明書步驟將miR-490-3p mimics及miR-NC根據(jù)實(shí)驗(yàn)分組轉(zhuǎn)染至MG63細(xì)胞中。轉(zhuǎn)染48 h后收集細(xì)胞進(jìn)行后續(xù)miR-490-3p表達(dá)檢測(cè)、侵襲和遷移實(shí)驗(yàn)檢測(cè)以及MMP-2、E-cadherin、上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化因子Twist轉(zhuǎn)錄因子（Twist）蛋白檢測(cè)。實(shí)驗(yàn)后期另設(shè)miR-490-3p+pcDNA組（共轉(zhuǎn)染miR-490-3p mimics和空載體對(duì)照）、miR-490-3p+FKBP14組（共轉(zhuǎn)染miR-490-3p mimics和FKBP14表達(dá)載體），參照上述方法轉(zhuǎn)染48 h后，收集對(duì)照組、模擬物陰性對(duì)照（miR-NC）組、miR-490-3p模擬物（miR-490-3p）組、miR-490-3p模擬物+空載體對(duì)照（miR-490-3p+pcDNA）組和miR-490-3p模擬物+FKBP14表達(dá)載體（miR-490-3p+FKBP14）組細(xì)胞進(jìn)行侵襲和遷移實(shí)驗(yàn)以及MMP-2、E-cadherin、Twist、FKBP14蛋白檢測(cè)。

1.3 實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)miR-490-3p的表達(dá)收集“1.2”中轉(zhuǎn)染48 h后的待測(cè)細(xì)胞，加入1mL Trizol試劑提取總RNA，并對(duì)RNA的濃度進(jìn)行檢測(cè)。再按照cDNA第一鏈合成試劑盒說明書將RNA逆轉(zhuǎn)錄合成單鏈cDNA，將1 μL cDNA作為模板，加入Maxima SYBR Green qPCR Master Mix 10 μL、濃度為10 μmol PCR正反引物各0.5 μL和雙蒸水8 μL制成20 μL PCR反應(yīng)體系，上PCR儀，并設(shè)定反應(yīng)程序?yàn)?5℃、3 min（1個(gè)循環(huán)），95℃、30 s，58℃、30 s，72℃、30 s（共40個(gè)循環(huán)），待循環(huán)結(jié)束后記錄數(shù)據(jù)，以U6為內(nèi)參基因，2-ΔΔCt法計(jì)算miR-490-3p的表達(dá)水平。

1.4 Transwell小室法檢測(cè)細(xì)胞侵襲和遷移收集“1.2”中轉(zhuǎn)染48 h后的細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞密度為1×105個(gè)/毫升。實(shí)驗(yàn)前提前1 d將Transwell小室放入24孔板內(nèi)，加入100 μL稀釋的Matrigel基質(zhì)膠（無血清培養(yǎng)基稀釋）室溫下充分凝固。次日，取細(xì)胞懸液200 μL加入到Transwell小室上層，并在小室下層加入500 μL含血清的培養(yǎng)基，每組設(shè)3個(gè)復(fù)孔。在細(xì)胞培養(yǎng)箱中常規(guī)培養(yǎng)24 h后，吸去上室液體并以棉簽小心擦去殘留的細(xì)胞，以4%多聚甲醛對(duì)下室細(xì)胞進(jìn)行固定30 min。去固定液后，以0.1%結(jié)晶紫染色15 min。去染色液后，在顯微鏡下隨機(jī)選取3個(gè)視野統(tǒng)計(jì)穿膜細(xì)胞數(shù)，結(jié)果以3個(gè)視野細(xì)胞數(shù)的均值表示侵襲細(xì)胞中。遷移實(shí)驗(yàn)中無需對(duì)Transwell小室鋪Matrigel基質(zhì)膠，其余步驟同侵襲實(shí)驗(yàn)。

1.5 蛋白質(zhì)印跡法檢測(cè)MMP-2、E-cadherin、Twist和FKBP14蛋白的表達(dá)向待測(cè)細(xì)胞中加入通用蛋白裂解液于冰上裂解抽提總蛋白后，BCA法檢測(cè)總蛋蛋白濃度與純度。向蛋白樣品中加入1/4體積的5×上樣緩沖液于100℃中變性6 min。取蛋白樣品80 μg加入到SDS-PAGE凝膠孔中進(jìn)行電泳。電泳結(jié)束后，轉(zhuǎn)膜。將PVDF膜放入脫脂奶粉中封閉2 h。經(jīng)1×TBST溶液洗膜后，放入MMP-2（1∶800）、E-cadherin（1∶800）、Twis（t1∶1 000）、FKBP14（1∶1 000）和β-actin（1∶1 000）一抗工作液中，并于4℃下孵育過夜。次日，經(jīng)1×TBST溶液洗膜后，加入辣根過氧化酶標(biāo)記的二抗（1∶2 000）室溫孵育1 h。ECL顯影后，凝膠成像系統(tǒng)掃描，并以β-actin為內(nèi)參分析目的蛋白的表達(dá)水平。

1.6 熒光素酶實(shí)驗(yàn)測(cè)定miR-490-3p和FKBP14的靶向關(guān)系采用TargetScan、miRanda和miRBase三大生物信息學(xué)軟件預(yù)測(cè)到FKBP14的3’UTR存在能夠與miR-490-3p互補(bǔ)結(jié)合的位點(diǎn)，為了驗(yàn)證miR-490-3p與FKBP14是否存在靶向關(guān)系，構(gòu)建含F(xiàn)KBP14 3’UTR野生結(jié)構(gòu)（野生型FKBP14-WT）和FKBP14 3’UTR突變結(jié)構(gòu)（FKBP14-MUT）的FKBP14 3’UTR熒光數(shù)酶報(bào)告載體。按照轉(zhuǎn)染試劑說明書步驟 行miR-NC+FKBP14-WT、miR-490-3p（mimics）+FKBP14-WT、miR-NC+FKBP14-MUT、miR-490-3p（mimics）+FKBP14-MUT四組共轉(zhuǎn)染，在培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h后，收集各組細(xì)胞檢測(cè)其熒光素酶活性，具體步驟參照雙熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)試劑盒說明書。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以形式表示，采用SPSS 22.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，多組間比較使用單因素方差分析，組間多重比較采用SNK-q。miR-NC+FKBP14-WT組與miR-490-3p+FKBP14-WT組及miR-NC+FKBP14-MUT組 與miR-490-3p+FKBP14-MUT組 熒 光素酶活性比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 轉(zhuǎn)染miR-490-3p模擬物后MG63細(xì)胞中miR-490-3p表達(dá)升高與對(duì)照組1.02±0.10比較，miR-490-3p在miR-NC組細(xì)胞中的表達(dá)0.96±0.09未見明顯改變（P＞0.05），但在miR-490-3p組細(xì)胞中的表達(dá)水平3.68±0.37明顯升高（P＜0.05）。

2.2 上調(diào)miR-490-3p抑制MG63細(xì)胞侵襲和遷移與對(duì)照組（76.52±6.00、97.85±6.45）比較，miR-490-3p組中侵襲細(xì)胞數(shù)和遷移細(xì)胞數(shù)（73.48±5.35、98.02±5.84）均 明 顯 增 多（P＜0.05）；但miR-NC組（73.48±5.35、98.02±5.84）和對(duì)照組相比數(shù)量差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。三組侵襲細(xì)胞數(shù)與遷移細(xì)胞數(shù)比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=76.42、94.45，均P＜0.001），見圖1。

2.3 上調(diào)miR-490-3p抑制MG63細(xì)胞中E-cadherin、MMP-2、Twist和FKBP14蛋白的表達(dá)與對(duì)照組比較，miR-490-3p組細(xì)胞中MMP-2、Twist和FKBP14蛋白的表達(dá)水平明顯降低，而E-cadherin蛋白的表達(dá)水平明顯升高（P＜0.05），但miR-NC組與對(duì)照組比較未見明顯改變（P＞0.05）。見圖2，表1。

圖2 蛋白質(zhì)印跡法檢測(cè)E-cadherin、MMP-2、Twist和FKBP14蛋白的表達(dá)

表1 各組細(xì)胞中E-cadherin、MMP-2、Twist和FKBP14蛋白的表達(dá)水平/

表1 各組細(xì)胞中E-cadherin、MMP-2、Twist和FKBP14蛋白的表達(dá)水平/

注：E-cadherin為鈣黏蛋白E，MMP-2為基質(zhì)金屬蛋白酶-2，Twist為上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化因子Twist轉(zhuǎn)錄因子，F(xiàn)KBP14為FK506相關(guān)蛋白14，miR-NC為模擬物陰性對(duì)照，miR-490-3p為miR-490-3p模擬物。①與對(duì)照組比較，P＜0.05。

組別對(duì)照組miR-NC miR-490-3p F值P值重復(fù)次數(shù)333 E-cadherin 0.12±0.03 0.13±0.02 0.46±0.03①153.14＜0.001 MMP-2 0.76±0.05 0.78±0.06 0.38±0.03①65.31＜0.001 Twist 0.72±0.06 0.74±0.05 0.33±0.03①68.70＜0.001 FKBP14 0.68±0.04 0.73±0.06 0.27±0.03①93.98＜0.001

2.4 FKBP14是miR-490-3p潛在靶基因FKBP14 3'UTR與miR-490-3p存在互補(bǔ)的結(jié)合位點(diǎn)。與miR-NC+FKBP14-WT組比較，miR-490-3p+FKBP14-WT組細(xì)胞的熒光素酶活性明顯降低（0.34±0.03比1.02±0.06，t=17.56，P＜0.05），但miR-NC+FKBP14-MUT組 和miR-490-3p+FKBP14-MUT組 細(xì) 胞 的 熒 光素酶活性未見顯著差異（0.97±0.06比0.99±0.07，t=0.38，P=0.726）。FKBP14引物序列為5'UACCACGACAUGAGACCAGGUUA3'，miR-490-3p引物序列為3'GUCGUACCUCAGGAGGUCCAAC5'，結(jié)合位點(diǎn)為319-326 of FKBP14 3'UTR。

2.5 上調(diào)FKBP14表達(dá)逆轉(zhuǎn)miR-490-3p對(duì)MG63細(xì)胞侵襲和遷移的抑制作用與對(duì)照組比較，miR-490-3p組中侵襲細(xì)胞數(shù)、遷移細(xì)胞數(shù)和FKBP14、MMP-2、Twist蛋白的表達(dá)水平明顯降低，E-cadherin蛋白的表達(dá)水平明顯升高（P＜0.05）；而miR-NC組與miR-490-3p組之間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；與miR-490-3p組比較，miR-490-3p+FKBP14組中侵襲細(xì)胞數(shù)、遷移細(xì)胞數(shù)和FKBP14、MMP-2、Twist蛋白的表達(dá)水平明顯升高，E-cadherin蛋白的表達(dá)水平明顯降低（P＜0.05），但miR-490-3p組與miR-490-3p+pcDNA組之間上述指標(biāo)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。見圖3，表2。

表2 各組侵襲細(xì)胞數(shù)、遷移細(xì)胞數(shù)和FK506相關(guān)蛋白14、上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化因子Twist轉(zhuǎn)錄因子、基質(zhì)金屬蛋白酶-2和鈣黏蛋白E蛋白表達(dá)水平/

表2 各組侵襲細(xì)胞數(shù)、遷移細(xì)胞數(shù)和FK506相關(guān)蛋白14、上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化因子Twist轉(zhuǎn)錄因子、基質(zhì)金屬蛋白酶-2和鈣黏蛋白E蛋白表達(dá)水平/

注：FKBP14為FK506相關(guān)蛋白14，Twist為上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化因子Twist轉(zhuǎn)錄因子，MMP-2為基質(zhì)金屬蛋白酶-2，E-cadherin為鈣黏蛋白E。①與miR-NC組比較，P＜0.05。②與miR-490-3p+pcDNA組比較，P＜0.05。

組別Control miR-NC miR-490-3p miR-490-3p+pcDNA miR-490-3p+FKBP14 F值P值重復(fù)次數(shù)33333侵襲細(xì)胞數(shù)78.64±5.56 75.55±5.18 34.43±2.15①35.05±2.36 63.58±4.13②81.44＜0.001遷移細(xì)胞數(shù)102.25±5.54 99.73±6.25 48.38±3.43①50.15±3.62 87.68±6.54②76.59＜0.001 FKBP14 0.65±0.05 0.67±0.04 0.24±0.03①0.26±0.03 0.48±0.04②84.50＜0.001 Twist 0.66±0.04 0.68±0.05 0.21±0.03①0.22±0.03 0.38±0.03②116.03＜0.001 MMP-2 0.83±0.06 0.80±0.05 0.42±0.03①0.38±0.04 0.54±0.04②65.12＜0.001 E-cadherin 0.16±0.03 0.14±0.02 0.45±0.03①0.48±0.03 0.18±0.03②105.83＜0.001

圖3 蛋白質(zhì)印跡法檢測(cè)FKBP14、Twist、MMP-2和E-cadherin蛋白的表達(dá)

3 討論

本研究成功上調(diào)骨肉瘤MG63細(xì)胞中miR-490-3p表達(dá)后發(fā)現(xiàn)，MG63細(xì)胞侵襲和遷移能力明顯受到抑制。miR-490-3p是一種進(jìn)化上高度保守的miRNA，定位于人17號(hào)染色體上；被證實(shí)可通過調(diào)控相關(guān)靶基因在腫瘤惡性轉(zhuǎn)移過程中發(fā)揮著重要的抑制作用［14］。Kang等［15］在食管鱗狀細(xì)胞癌研究指出，上調(diào)miR-490-3p表達(dá)可通過靶向調(diào)控HMGA2抑制腫瘤細(xì)胞的侵襲、遷移和上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化。Fan、Zhang［16］研究指出，miR-490-3p在前列腺癌PCa細(xì)胞中表達(dá)下調(diào)，下調(diào)其表達(dá)可靶向調(diào)控HDAC2促進(jìn)癌細(xì)胞的侵襲和遷移。本研究結(jié)果在骨肉瘤中進(jìn)一步證實(shí)miR-490-3p抗腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)移的作用。這提示，miR-490-3p可能在骨肉瘤惡性轉(zhuǎn)移過程中發(fā)揮著重要的抑制作用。

為了探討miR-490-3p抑制MG63細(xì)胞轉(zhuǎn)移的分子機(jī)制，本研究采用蛋白質(zhì)印跡法檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，上調(diào)miR-490-3p表達(dá)后可使MG63細(xì)胞中MMP-2和Twist表達(dá)降低，而E-cadherin表達(dá)升高。MMP-2是基質(zhì)金屬蛋白酶家族成員，可降解細(xì)胞外基質(zhì)中的膠原蛋白，在骨肉瘤細(xì)胞侵襲和遷移過程中發(fā)揮著重要作用［17-18］；上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化是賦予細(xì)胞侵襲和遷移能力的生物學(xué)過程，而E-cadherin是重要的上皮標(biāo)志物，Twist是細(xì)胞發(fā)生上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化的重要誘導(dǎo)因子，主要功能是抑制E-cadherin表達(dá)［19］。E-cadherin和Twist均在骨肉瘤組織中異常表達(dá)，在腫瘤細(xì)胞侵襲和轉(zhuǎn)移過程中發(fā)揮著重要作用［20-21］。結(jié)果提示，miR-490-3p可能通過抑制MG63細(xì)胞上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化進(jìn)而減弱癌細(xì)胞侵襲和遷移。

另外，本研究還發(fā)現(xiàn)，miR-490-3p表達(dá)上調(diào)還可以引起MG63細(xì)胞中FKBP14表達(dá)降低。FKBP14是FK506結(jié)合蛋白家族成員，具有受體信號(hào)傳導(dǎo)、激酶活性和蛋白折疊等多種生物功能，其在胃癌和卵巢癌等多種腫瘤中異常高表達(dá)，可通過調(diào)控細(xì)胞侵襲、遷移等過程促進(jìn)腫瘤的發(fā)生發(fā)展［22-23］。同時(shí)，本研究采用生物信息學(xué)軟件預(yù)測(cè)發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)KBP14 3’UTR區(qū)域存在能夠與miR-490-3p互補(bǔ)的結(jié)合位點(diǎn)。雙熒光素酶實(shí)驗(yàn)證實(shí)，F(xiàn)KBP14是miR-490-3p的潛在靶基因。Huang等［24］和Wang等［25］研究證實(shí)FKBP14在骨肉瘤組織和細(xì)胞系中過度表達(dá)，其表達(dá)水平與腫瘤轉(zhuǎn)移、復(fù)發(fā)和不良生存時(shí)間等有關(guān)；可通過促進(jìn)癌細(xì)胞侵襲和粘附等在骨肉瘤的惡性進(jìn)展中發(fā)揮著積極作用。本研究轉(zhuǎn)染FKBP14表達(dá)質(zhì)粒成功上調(diào)FKBP14表達(dá)后發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)KBP14可逆轉(zhuǎn)miR-490-3p對(duì)MG63細(xì)胞侵襲、遷移以及FKBP14、Twist、MMP-2和E-cadherin蛋白表達(dá)的調(diào)控作用。這提示，miR-490-3p可通過靶向調(diào)控FKBP14表達(dá)抑制骨肉瘤MG63細(xì)胞侵襲和遷移。

本研究首次通過體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)探究了上調(diào)miR-490-3p可靶向抑制FKBP14的表達(dá)降低骨肉瘤細(xì)胞的遷移和侵襲能力，miR-490-3p/FKBP14軸可能為骨肉瘤的治療提供了潛在的分子靶標(biāo)。但本研究?jī)H在細(xì)胞層面進(jìn)行了探究，且miR-490-3p/FKBP14軸下游信號(hào)通路對(duì)骨肉瘤轉(zhuǎn)移的影響也還未進(jìn)行探究，因此，本研究接下來將進(jìn)一步通過動(dòng)物實(shí)驗(yàn)在體內(nèi)驗(yàn)證miR-490-3p/FKBP14軸在骨肉瘤發(fā)生發(fā)展中的作用，并深入探究其下游信號(hào)通路對(duì)骨肉瘤發(fā)生發(fā)展的影響，為深入了解骨肉瘤發(fā)生發(fā)展的機(jī)制及其治療靶點(diǎn)的選擇提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。