李芳嬋，龐曉云，付吉利，陳 清，王蘇妃，魏博偉

（1.廣西中醫(yī)藥大學(xué)，南寧 530200；2.廣西壯瑤藥工程技術(shù)研究中心，南寧 530200；3.廣西中醫(yī)藥大學(xué)制藥廠，南寧 530000）

五味祛脂顆粒是廣西中醫(yī)藥大學(xué)擬開發(fā)的廣西壯族自治區(qū)（簡稱廣西）特色壯瑤藥保健食品，由廣西藤茶、決明子、葛根、荷葉、百合等藥食同源藥材組方，可通調(diào)龍路、火路，同時兼以扶正補虛，諸癥兼顧，相得益彰，具有清熱毒、祛濕毒、利水道的功效，通過調(diào)節(jié)機體的代謝機能，從而達到多靶點、多環(huán)節(jié)整體協(xié)調(diào)降血脂的作用。葛根素、二氫楊梅素及楊梅素分別是葛根、藤茶降脂的重要活性成分，本研究采用高效液相色譜法測定產(chǎn)品中葛根素、二氫楊梅素、楊梅素成分的含量，建立五味祛脂顆粒質(zhì)量控制方法，為控制產(chǎn)品的質(zhì)量提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 儀器

1260 InfinityⅡ型高效液相色譜儀（美國Agilent公司），Direct-Q 5UV型超純水機（廣西南寧市博美生物科技有限公司），KQ-500E型超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）。

1.2 試藥

五味祛脂顆粒，廣西中醫(yī)藥大學(xué)；楊梅素（PLC≥98.31%）、二氫楊梅素（HPLC≥99.57%），成都曼思特生物科技有限公司；葛根素，上海融禾醫(yī)藥科技有限公司；甲醇（色譜純）、乙腈（色譜純），賽默飛世爾科技有限公司；磷酸，成都金山化學(xué)試劑有限公司。

1.3 方法

1.3.1 色譜條件 色譜柱：Shim-pack C1（8250.0 mm×4.6 mm，5 μm）；流動相為乙腈（A）-0.1%磷酸水（B），梯 度 洗 脫 ：0～15 min，15%A→26%A；15～25 min，26%→50%；采用轉(zhuǎn)換波長測定，0～9 min，波長為250 nm，9～25 min，波長為285 nm；進樣量5 μL，柱溫30℃。

1.3.2 對照品溶液的制備 取葛根素、二氫楊梅素、楊梅素對照品適量，加入甲醇制成濃度為0.023 0、0.543 6、0.250 4 mg/mL的葛根素、二氫楊梅素、楊梅素混合對照品溶液。

1.3.3 供試品溶液的制備 取五味祛脂顆粒0.2 g，研細(xì)，過80目篩，精密稱定，置于錐形瓶中，精密加入甲醇20 mL，稱重，超聲提取30 min，補重，過濾，取續(xù)濾液過0.22 μm微孔濾膜，得到五味祛脂供試品溶液。

取缺藤茶陰性樣品0.2 g，精密稱定，同五味祛脂供試品溶液制備方法，制備缺藤茶陰性對照品溶液。

取缺葛根陰性樣品0.2 g，精密稱定，同五味祛脂供試品溶液制備方法，制備缺葛根陰性對照品溶液。

1.3.4 專屬性考察 分別精密吸取對照品溶液、供試品溶液和陰性樣品溶液各5 μL，按“1.3.1”色譜條件進樣，記錄峰面積。

1.3.5 標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制 分別吸取二氫楊梅素對照品溶液2、4、6、8、10、12 μL，按“1.3.1”色譜條件進樣測定，記錄峰面積。

1.3.6 穩(wěn)定性試驗 取五味祛脂顆粒0.2 g，精密稱定，按“1.3.3”方法制備供試品溶液，按“1.3.1”色譜條件分別于0、2、4、8、12、24 h進樣測定，記錄峰面積，計算RSD。

1.3.7 精密度試驗 取混合對照品溶液，按“1.3.1”色譜條件進樣測定，連續(xù)進樣6次，記錄峰面積，計算RSD。

1.3.8 重復(fù)性試驗 取五味祛脂顆粒0.2 g（6份），按“1.3.3”方法制備供試品溶液，按“1.3.1”色譜條件操作進樣，記錄峰面積，計算五味祛脂顆粒中葛根素、二氫楊梅素、楊梅素的含量和RSD。

1.3.9 加樣回收試驗 稱取6份五味祛脂顆粒各0.1 g，置于具塞錐形瓶中，以葛根素、二氫楊梅素、楊梅素濃度分別為0.062 0、0.298 8、0.140 0 mg/mL混合對照品溶液代替甲醇，按“1.3.3”方法制備供試品溶液，按“1.3.1”色譜條件進樣，記錄峰面積，計算加樣回收率，計算RSD。

1.3.10 樣品測定 精密稱取6批五味祛脂顆粒產(chǎn)品各0.2 g，按“1.3.3”方法制備供試品溶液，按“1.3.1”色譜條件操作，記錄峰面積。

2 結(jié)果與分析

2.1 專屬性考察

五味祛脂顆粒HPLC混合對照品、供試品溶液的HPLC色譜見圖1。陰性樣品在目標(biāo)成分色譜峰位置的峰面積與供試品目標(biāo)成分的峰面積之比＜5%，表明陰性樣品對檢測無干擾，該方法專屬性良好。

圖1 五味祛脂顆粒混合對照品溶液、供試品溶液的HPLC色譜

2.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制

以質(zhì)量為橫坐標(biāo)（x），峰面積為縱坐標(biāo)（y），建立線性回歸方程。其線性范圍、標(biāo)準(zhǔn)曲線和相關(guān)系數(shù)詳見表1。由表1可知，葛根素、二氫楊梅素、楊梅素分別在0.023 0～0.138 0、1.087 2～6.523 2、0.500 8～3.004 8 μg水平上線性良好。

表1 五味祛脂顆粒3種成分的標(biāo)準(zhǔn)曲線和相關(guān)系數(shù)

2.3 穩(wěn)定性試驗

經(jīng)測定，葛根素、二氫楊梅素和楊梅素峰面積的RSD分別為2.297%、0.703%、0.635%，表明供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.4 精密度試驗

經(jīng)測定，葛根素、二氫楊梅素和楊梅素峰面積的RSD分別為1.350%、0.121%、0.145%，表明儀器精密度良好。

2.5 重復(fù)性試驗

經(jīng)檢驗，葛根素含量的RSD為3.811%；二氫楊梅素含量的RSD為3.567%；楊梅素含量的RSD為2.253%，表明該方法重復(fù)性良好。

2.6 加樣回收試驗

加樣回收試驗結(jié)果見表2。葛根素、二氫楊梅素、楊梅素的平均回收率分別為102.7%、101.1%、99.7%，RSD分別為2.56%、2.21%、0.78%，說明該方法回收率符合要求。

表2 加樣回收試驗結(jié)果

2.7 樣品測定

樣品測定結(jié)果見表3。從表3可以看出，6批五味祛脂顆粒中，葛根素、二氫楊梅素、楊梅素的平均含量分別為1.67、76.43、27.81 mg/g?？紤]到藥材的復(fù)雜性，限度按平均值下調(diào)20%，暫定五味祛脂顆粒中葛根素、二氫楊梅素、楊梅素含量不得少于1.34、61.14、22.25 mg/g。

表3 6批五味祛脂顆粒測定結(jié)果 （單位：mg/g）

3 小結(jié)與討論

3.1 含量測定指標(biāo)的選擇

藤茶含有豐富的多酚和黃酮類物質(zhì)，其中黃酮類的二氫楊梅素含量最高，是藤茶保健作用的重要物質(zhì)基礎(chǔ)［1-3］。二氫楊梅素能降低動物血脂，改善脂代謝紊亂，增強機體抗氧化能力，減輕高脂肪對肝細(xì)胞的損傷作用，其作用機制可能是二氫楊梅素激活SIRT1-AMPK通路，抑制脂質(zhì)合成，促進脂質(zhì)分解或與促進WAT棕色化有關(guān)［4-8］。楊梅素也是藤茶的活性成分，楊梅素的促脂解作用可能是通過激活PKCMEK/ERK信號通路，增加該通路中p-HSL的表達量來實現(xiàn)的，并可能對cAMP/PKA信號通路中相關(guān)因子的活性有一定的抑制作用［9］。葛根主要化學(xué)成分有葛根素、葛根素木糖甙、大豆黃酮和大豆黃酮甙等，其中葛根素為其重要的活性化學(xué)物，能有效降低大鼠血清中甘油三脂、膽固醇、低密度脂蛋白含量而明顯升高HDL含量，與HDL-C/TC相比，具有明顯的降脂作用［10，11］。胡彥武等［12］研究發(fā)現(xiàn)，葛根素可顯著調(diào)節(jié)AS大鼠血脂水平，顯著降低血清炎癥因子水平，其作用機制可能與抑制MAPK信號通路激活有關(guān)。因此，本研究選擇二氫楊梅素、楊梅素、葛根素含量測定作為五味祛脂顆粒含量測定指標(biāo)，為五味祛脂顆粒研發(fā)及質(zhì)量控制提供研究基礎(chǔ)。

3.2 色譜條件選擇

波長選擇：采用二極管陣列檢測對樣品進行測定，發(fā)現(xiàn)二氫楊梅素和楊梅素最大吸收波長為285 nm，葛根素最大吸收波長為250 nm，故選擇0～9 min檢測波長為250 nm，9～25 min檢測波長為285 nm。柱溫選擇：考察了柱溫25、30、35℃對樣品檢測的影響，在25℃時，二氫楊梅素的峰型不好；30、35℃時，峰型較好，但根據(jù)柱效與柱溫間的關(guān)系，選擇較低的柱溫可得到較高的柱效，本試驗選擇柱溫為30℃。流動相選擇：考察了乙腈-水、甲醇-水、乙腈-0.1%磷酸、乙腈-0.2%磷酸等流動相，選擇乙腈-水、甲醇-水為流動相時峰型不好，拖尾現(xiàn)象嚴(yán)重，乙腈-0.1%磷酸，乙腈-0.2%磷酸為流動相時分離度良好，峰對稱性較好，但高濃度的磷酸對管路和柱子損傷較大，故選擇乙腈-0.1%磷酸為流動相。

3.3 小結(jié)

本方法穩(wěn)定性強、重復(fù)性好、準(zhǔn)確度高，可以作為五味祛脂顆粒葛根素、二氫楊梅素、楊梅素含量測定的方法。通過6批五味祛脂顆粒含量的測定，結(jié)果表明，五味祛脂顆粒中葛根素、二氫楊梅素、楊梅素含量不得少于1.34、61.14、22.25 mg/g。