鄧 麗，李 杰，劉保國(guó)，杭柏林，3

(1.河南科技學(xué)院動(dòng)物科技學(xué)院，新鄉(xiāng) 453003；2.新鄉(xiāng)市農(nóng)業(yè)農(nóng)村局畜產(chǎn)品質(zhì)量監(jiān)測(cè)檢驗(yàn)中心，新鄉(xiāng) 453003；3.揚(yáng)州大學(xué)獸醫(yī)學(xué)院，教育部禽類預(yù)防醫(yī)學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇省動(dòng)物預(yù)防醫(yī)學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，揚(yáng)州 225009)

抗生素是一把“雙刃劍”，在對(duì)人類健康和動(dòng)物養(yǎng)殖行業(yè)作出巨大貢獻(xiàn)的同時(shí)也誘導(dǎo)細(xì)菌產(chǎn)生耐藥性，增加治療難度，同時(shí)其固有的副作用亦危害人與動(dòng)物的健康[1]。動(dòng)物養(yǎng)殖行業(yè)中抗生素的使用量巨大，且獸用抗生素的不合理使用較為常見，極易導(dǎo)致病原菌耐藥。而耐藥性可通過食物鏈直接或間接地傳遞給人類[2-3]，從而威脅人類健康。規(guī)范動(dòng)物養(yǎng)殖過程中抗生素的合理使用是解決耐藥性傳播的一種重要措施。因此，世界各國(guó)逐漸采取不同措施遏制細(xì)菌耐藥。其中一個(gè)重要措施就是禁止在飼料中添加任何抗生素[4-5]。為保障動(dòng)物高效健康養(yǎng)殖，可使用抗生素替代物[6]?？股靥娲镉泻芏喾N類，其中抗菌肽被認(rèn)為是抗生素的最佳替代物。

抗菌肽(antimicrobial peptides,AMPs)是生物機(jī)體先天免疫系統(tǒng)的重要組成部分，具有廣譜抗“菌”(包括細(xì)菌、真菌、病毒、寄生蟲)、免疫調(diào)節(jié)、抗腫瘤等多種生物學(xué)活性[7]。天然抗菌肽存在生物活性低、毒性大、穩(wěn)定性差、不易獲得、應(yīng)用成本高等缺陷，限制了其轉(zhuǎn)化應(yīng)用[8-10]。隨著生物技術(shù)的發(fā)展，分子設(shè)計(jì)和優(yōu)化策略為開發(fā)新型抗菌肽提供了理論基礎(chǔ)[10]。血紅蛋白降解后的某些片段具有抗菌活性，被稱之為血紅蛋白源殺菌肽(hemocidins)[11]。來(lái)自牛血紅蛋白的殺菌肽已有許多，但多是通過酶解后分離鑒定或直接從體內(nèi)或血液中分離鑒定的，還沒有以其氨基酸序列為基礎(chǔ)直接進(jìn)行分析得到的抗菌肽。兩親性α-螺旋結(jié)構(gòu)被認(rèn)為是陽(yáng)離子型抗菌肽發(fā)揮抗菌作用的重要基礎(chǔ)。本研究根據(jù)抗菌肽的這一結(jié)構(gòu)-功能理論，從牛血紅蛋白β亞基中初步篩選了一個(gè)可能為血紅蛋白源殺菌肽的新片段，并以其為基礎(chǔ)，采用氨基酸替換方法設(shè)計(jì)了3條新多肽，測(cè)定其抗菌活性，評(píng)價(jià)其穩(wěn)定性和溶血性，以期為研究和開發(fā)新型抗菌肽提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 設(shè)計(jì)多肽的人工合成 本研究設(shè)計(jì)的多肽均由18個(gè)氨基酸殘基構(gòu)成，由無(wú)錫亞肽生物科技有限公司合成，通過高效液相色譜進(jìn)行純化，純度高于95%。

1.1.2 測(cè)試菌株 奇異變形桿菌臨床株[12]和大腸桿菌臨床株[13]均從臨床病豬腸道中分離并鑒定；雞白痢沙門菌CVCC1791和大腸桿菌AE1均由林州市中農(nóng)穎泰生物肽有限公司惠贈(zèng)；大腸桿菌CVCC1568、豬霍亂沙門菌CVCC3776、雞白痢沙門菌CVCC533、綠膿假單胞菌CVCC2087和金黃色葡萄球菌CVCC6538均購(gòu)自中國(guó)獸醫(yī)微生物菌種保藏管理中心；大腸桿菌CMCC44103購(gòu)自中國(guó)醫(yī)學(xué)細(xì)菌保藏管理中心；大腸桿菌CVCC8099、金黃色葡萄球菌ATCC 25923、白色念珠菌ATCC 10231均由河南科技學(xué)院動(dòng)物檢疫實(shí)驗(yàn)室惠贈(zèng)。

1.1.3 主要試劑及儀器 胰酪大豆胨液體(TSB)培養(yǎng)基購(gòu)自青島海博生物技術(shù)有限公司；硫酸銅和氯化鈣均購(gòu)自天津市致遠(yuǎn)化學(xué)試劑有限公司；磷酸鹽緩沖液(PBS，pH 7.2)購(gòu)自北京索萊寶生物科技有限公司；濃鹽酸、氫氧化鈉、三氯化鐵、氯化鈉、氯化鉀、氯化鎂均購(gòu)自國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

pH計(jì)(型號(hào)：PHS-3C)購(gòu)自上海儀電科學(xué)儀器股份有限公司；酶標(biāo)分析儀(型號(hào)：INFINITEPRO)購(gòu)自Tecan公司；恒溫培養(yǎng)箱(型號(hào)：GNP-9270)購(gòu)自上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司；高壓蒸汽滅菌器(型號(hào)：LDZX-30KAS)購(gòu)自上海申安醫(yī)療器械廠；純水儀(型號(hào)：ZYTEST-I-10T/20T)購(gòu)自四川卓越水處理設(shè)備有限公司。

1.2 方法

1.2.1 多肽的設(shè)計(jì)及其生物信息學(xué)分析 將牛血紅蛋白β亞基的氨基酸序列輸入HeliQuest在線工具(https:∥heliquest.ipmc.cnrs.fr/)，運(yùn)行后得到許多18個(gè)氨基酸殘基構(gòu)成的多肽及其螺旋輪、帶電荷數(shù)、總疏水率和疏水力矩等相關(guān)信息，根據(jù)“兩親性、帶正電荷和α-螺旋”的特征進(jìn)行多肽篩選；利用APD3數(shù)據(jù)庫(kù)(https:∥aps.unmc.edu/)對(duì)設(shè)計(jì)多肽與庫(kù)內(nèi)收集的抗菌肽進(jìn)行相似性分析；利用ProtParam在線工具(https:∥web.expasy.org/protparam/)分析多肽的理化性質(zhì)；利用SOPMA在線工具(http:∥npsa-prabi.ibcp.fr/cgi-bin/npsa_automat.pl?page=npsa_sopma.html)分析多肽二級(jí)結(jié)構(gòu)；利用PEP-FOLD3在線工具(https:∥mobyle.rpbs.univ-paris-diderot.fr/cgi-bin/portal.py#forms::PEP-FOLD3)對(duì)多肽進(jìn)行3D作圖；利用HeliQuest在線工具繪制改造多肽的螺旋輪模型，計(jì)算其疏水力矩。

1.2.2 抑菌活性分析 通過測(cè)定最小抑菌濃度(minimum inhibitory concentrations，MIC)來(lái)反映多肽的抑菌活性。當(dāng)MIC≤400 μg/mL時(shí)，認(rèn)為多肽有抑菌活性。將不同菌株用TSB培養(yǎng)基于37 ℃過夜培養(yǎng)，轉(zhuǎn)接種后繼續(xù)培養(yǎng)3～5 h，10 000 r/min離心5 min，用滅菌PBS(pH 7.2)洗滌3次，用TBS培養(yǎng)基將細(xì)菌濃度調(diào)整至2×106CFU/mL，取菌液加入96孔板中，100 μL/孔。同時(shí)用TSB培養(yǎng)基倍比稀釋設(shè)計(jì)多肽，取不同稀釋度的多肽加入96孔板的對(duì)應(yīng)孔中，100 μL/孔。混勻后，置于37 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h。以沒有菌體生長(zhǎng)的最高稀釋度的多肽濃度為抑制該菌生長(zhǎng)的MIC。肉眼觀察孔中溶液，如渾濁，則有菌體生長(zhǎng)；如澄清，則沒有菌體生長(zhǎng)。

1.2.3 穩(wěn)定性分析 在TSB培養(yǎng)基中加入瓊脂糖，使其濃度為2%，滅菌，冷卻至50 ℃左右時(shí)，加入按1.2.2中配制的大腸桿菌CVCC8099菌液，使菌液終濃度為1×106CFU/mL，混勻，立即倒平板，凝固，打孔，封底，備用。將篩選出的有抑菌活性的抗菌肽進(jìn)行不同處理，加入平板的相應(yīng)孔中，20 μL/孔，靜置3 h，置于37 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，取出，用直尺測(cè)量抑菌圈直徑。

1.2.3.1 熱穩(wěn)定性分析 將抗菌肽溶液分別置于0、20、40、60、80和100 ℃處理15 min，測(cè)定抗菌肽的抗菌活性。

1.2.3.2 鹽離子穩(wěn)定性分析 將抗菌肽置于不同鹽離子溶液(1×PBS、150 mmol/L NaCl、5 mmol/L KCl、1 mmol/L MgCl2、5 mmol/L CaCl2、4 μmol/L FeCl3、25 μmol/L CuSO4)中處理15 min，然后測(cè)定抗菌肽的抗菌活性。

1.2.3.3 酸堿穩(wěn)定性分析 將抗菌肽溶液置于pH 4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0和10.0的TSB培養(yǎng)基中處理15 min，測(cè)定抗菌肽的抗菌活性。

1.2.3.4 反復(fù)凍融穩(wěn)定性分析 將抗菌肽溶液反復(fù)凍融4、6、8、10、12、14次，測(cè)定抗菌肽的抗菌活性。

1.2.4 溶血性分析 無(wú)菌采集健康大耳白母兔(3月齡左右，約1.5 kg，購(gòu)自新鄉(xiāng)市洪門鎮(zhèn)菜市場(chǎng))血液，用3.8%檸檬酸鈉溶液抗凝，3 000 r/min離心10 min，沉淀用滅菌PBS緩沖液(pH 7.2)洗滌3次，配制成1%兔紅細(xì)胞懸液，加入滅菌離心管中，100 μL/管。將抗菌肽用滅菌PBS(pH 7.2)進(jìn)行倍比稀釋，不同濃度的抗菌肽溶液加入相應(yīng)離心管中，100 μL/管。將離心管置于37 ℃作用1 h，3 000 r/min離心5 min，取上層液體加入相應(yīng)的96孔板中，用酶標(biāo)分析儀于波長(zhǎng)540 nm處測(cè)定各孔溶液的吸光度值(D540 nm值)。用1% Triton X-100作為陽(yáng)性對(duì)照，用PBS緩沖液作為陰性對(duì)照。

溶血率(%)=(D540 nm肽-D540 nm陰性對(duì)照)/(D540 nm陽(yáng)性對(duì)照-D540 nm陰性對(duì)照)×100%

2 結(jié) 果

2.1 多肽的一級(jí)結(jié)構(gòu)

在牛血紅蛋白β亞基中篩選了1條多肽，然后采用氨基酸替換方法新設(shè)計(jì)了3條多肽。設(shè)計(jì)多肽的氨基酸序列見表1。其中YKK-18是牛血紅蛋白β亞基中第64-81位氨基酸殘基構(gòu)成的多肽，有18個(gè)氨基酸殘基，而DLK-3、LJ-1和LJ-2是替換了YKK-18序列中部分氨基酸后得到的多肽，分別替換了8、7和15個(gè)氨基酸。

表1 設(shè)計(jì)多肽的一級(jí)結(jié)構(gòu)

2.2 多肽的相似性分析

將設(shè)計(jì)的4條多肽與APD3數(shù)據(jù)庫(kù)中收集的抗菌肽進(jìn)行氨基酸序列相似性比對(duì)，記錄最高的相似性，結(jié)果見表2。由表2可知，4條多肽與APD3數(shù)據(jù)庫(kù)中已收錄抗菌肽的氨基酸序列相似性均不超過50%。表明設(shè)計(jì)的4條多肽均是新的多肽。

表2 設(shè)計(jì)多肽與APD3數(shù)據(jù)庫(kù)中抗菌肽的相似性比對(duì)

2.3 多肽的理化特性

通過在線工具對(duì)設(shè)計(jì)的4條多肽進(jìn)行理化特性分析，結(jié)果見表3。由表3可知，4條多肽的等電點(diǎn)均>7；4條多肽均帶正電荷，其中YKK-18所帶電荷數(shù)較少，DLK-3所帶電荷數(shù)較多，而LJ-1和LJ-2所帶電荷數(shù)中等；總平均親水性(GRAVY)值均<0，表明4條多肽均為親水性多肽，推測(cè)溶于水；YKK-18為穩(wěn)定的多肽，其他3條多肽為不穩(wěn)定多肽；LJ-2的熱穩(wěn)定性最高，其次是DLK-3和LJ-1，YKK-18較差；YKK-18的總疏水率和疏水力矩均低于其他3條多肽，DLK-3、LJ-1和LJ-2的疏水力矩值依次降低，表明DLK-3、LJ-1和LJ-2的兩親性程度逐漸降低。

表3 設(shè)計(jì)多肽的理化性質(zhì)

2.4 設(shè)計(jì)多肽的二級(jí)結(jié)構(gòu)、3D模型及螺旋輪結(jié)構(gòu)

在線工具分析設(shè)計(jì)多肽的二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)結(jié)果見表4。由表4可知，YKK-18有2種二級(jí)結(jié)構(gòu)類型，即α-螺旋和β-轉(zhuǎn)角，且螺旋度較高；而改后的3條多肽(DLK-3、LJ-1和LJ-2)只有1種二級(jí)結(jié)構(gòu)類型，即α-螺旋。

表4 設(shè)計(jì)多肽的二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)結(jié)果

對(duì)設(shè)計(jì)多肽進(jìn)行3D模型模擬，結(jié)果見圖1。由圖1可知，YKK-18為全α-螺旋結(jié)構(gòu)，而DLK-3、LJ-1的中間為α-螺旋結(jié)構(gòu)，DLK-3的氮端和LJ-1的羧基端為延伸鏈結(jié)構(gòu)，LJ-2的兩端為α-螺旋結(jié)構(gòu)，中間有個(gè)無(wú)規(guī)則卷曲結(jié)構(gòu)，這與二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)結(jié)果有差異。但3D模型均表明4條多肽中均存在高含量的α-螺旋結(jié)構(gòu)。

圖1 設(shè)計(jì)多肽的3D模型

設(shè)計(jì)多肽的螺旋輪模型見圖2。由圖2可知，4條設(shè)計(jì)多肽均呈兩親性結(jié)構(gòu)，其中，DLK-3的兩親性最好，其次依次為L(zhǎng)J-1和LJ-2，而YKK-18的兩親性較差。

①黃色，非極性疏水性氨基酸殘基；藍(lán)色，極性帶正電荷氨基酸殘基；淡紅色，極性不帶電荷中性酰胺類氨基酸殘基；紫色，極性不帶電荷中性含羥基類氨基酸殘基；灰色，極性不帶電荷疏水性氨基酸殘基；淡藍(lán)色，極性不帶電荷堿性氨基酸；紅色，極性帶負(fù)電荷酸性氨基酸。②數(shù)字表示氨基酸殘基的位置；箭頭長(zhǎng)短表示疏水力矩大小，疏水力矩指示多肽的兩親性程度

2.5 多肽的抑菌活性

通過倍比稀釋法測(cè)定了4條設(shè)計(jì)多肽對(duì)不同菌株的MIC以反映設(shè)計(jì)多肽的抑菌活性，結(jié)果見表5。由表5可知，YKK-18對(duì)測(cè)試的13種菌株均沒有抑菌活性，但DLK-3、LJ-1和LJ-2對(duì)這13種測(cè)試菌株中的12種(除了奇異變形桿菌)均具有抑菌活性，其中DLK-3的抑菌活性比LJ-1和LJ-2強(qiáng)，LJ-1和LJ-2對(duì)革蘭陰性菌的抑菌活性強(qiáng)于對(duì)革蘭陽(yáng)性菌的抑菌活性，總體上LJ-2的抑菌活性低于DLK-3和LJ-1。表明設(shè)計(jì)的3條多肽DLK-18、LJ-1和LJ-2是具有不同抑菌活性的抗菌肽。

表5 設(shè)計(jì)多肽對(duì)部分菌株的最小抑菌濃度

2.6 抗菌肽的抑菌穩(wěn)定性

2.6.1 抗菌肽熱穩(wěn)定性分析 由圖3可知，隨著溫度的升高，抗菌肽DLK-3、LJ-1和LJ-2的抑菌活性逐漸降低，但仍有較高的抑菌活性，表明這3條多肽的抑菌活性具有熱穩(wěn)定性。

圖3 溫度對(duì)設(shè)計(jì)抗菌肽抑菌活性的影響

2.6.2 抗菌肽鹽離子穩(wěn)定性 由圖4可知，在7種不同的鹽溶液(生理性濃度)中，3條抗菌肽仍有抑菌活性，表明3條抗菌肽的抑菌活性具有鹽離子穩(wěn)定性。

1,pH 7.2 PBS；2，150 mmol/L NaCl，3，5 mmol/L KCl；4，1 mmol/L MgCl2；5，5 mmol/L CaCl2；6，4 μmol/L FeCl3；7，25 μmol/L CuSO4

2.6.3 抗菌肽酸堿穩(wěn)定性 由圖5可知，在pH 4.0～6.0或pH 8.0～10.0時(shí)，3條抗菌肽的抑菌活性比pH 7.0時(shí)有所降低，但抑菌活性仍較高，表明3條抗菌肽的抑菌活性具有酸堿穩(wěn)定性。

圖5 pH對(duì)設(shè)計(jì)抗菌肽抑菌活性的影響

2.6.4 抗菌肽反復(fù)凍融穩(wěn)定性 由圖6可知，隨著凍融次數(shù)的增加，3條抗菌肽的抑菌活性逐漸降低，但仍有較高抑菌活性，表明3條抗菌肽的抑菌活性具有反復(fù)凍融的穩(wěn)定性。

圖6 反復(fù)凍融對(duì)設(shè)計(jì)抗菌肽抑菌活性的影響

2.7 抗菌肽的溶血性

由圖7可知，抗菌肽DLK-3在25 μg/mL時(shí)的溶血率已超過5%，而抗菌肽LJ-1和LJ-2在200 μg/mL的高濃度時(shí)溶血率仍低于5%，表明抗菌肽DLK-3有較高的溶血性，而抗菌肽LJ-1和LJ-2有較低的溶血性。

圖7 設(shè)計(jì)抗菌肽的溶血性

3 討 論

抗菌肽作為抗生素替代物被廣泛開發(fā)和應(yīng)用，但其也存在一些缺點(diǎn)[14]。因此，對(duì)天然抗菌肽進(jìn)行改造或分子設(shè)計(jì)以獲得性能更佳的抗菌肽成為研究熱點(diǎn)?？咕姆肿釉O(shè)計(jì)中常以天然抗菌肽序列為模板進(jìn)行氨基酸替換及肽段截短、拼接或雜合[14-15]。本研究以動(dòng)物天然蛋白序列為基礎(chǔ)，根據(jù)抗菌肽的構(gòu)效關(guān)系篩選潛在抗菌肽序列，并以此為基礎(chǔ)，通過氨基酸替換，設(shè)計(jì)新的多肽序列并驗(yàn)證其抗菌活性，最終獲得2條性能較佳的抗菌肽。

生物機(jī)體蛋白的一級(jí)結(jié)構(gòu)是由氨基酸殘基經(jīng)排列組合后形成的長(zhǎng)短不一的多肽，其中某些肽段含有抗菌肽構(gòu)成的3個(gè)要素，即α-螺旋、帶正電荷和兩親性結(jié)構(gòu)。本研究從牛血紅蛋白β亞基中初篩潛在抗菌肽時(shí)即以上述3個(gè)要素為依據(jù)，同時(shí)為方便應(yīng)用，以親水性為參考，篩選了1條多肽YKK-18。本研究設(shè)計(jì)的多肽的二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)結(jié)果與3D模型預(yù)測(cè)結(jié)果有差異，可能與不同在線工具的算法有關(guān)。多肽成為抗菌肽的首要條件是有抗菌活性，而多肽YKK-18沒有抗菌活性。為此，以YKK-18的氨基酸序列為基礎(chǔ)，通過氨基酸替換，改變多項(xiàng)性能參數(shù)(如增加正電荷數(shù)，提高兩親性程度、螺旋含量、疏水率等)，重新設(shè)計(jì)了3條多肽，經(jīng)驗(yàn)證，3條多肽對(duì)不同測(cè)試菌株有不同程度的抗菌活性。

抗菌肽抗菌活性受自身電荷數(shù)、疏水性、兩親性、二級(jí)結(jié)構(gòu)的影響[10]。目前，雖然存在不帶電荷或帶負(fù)電荷的抗菌肽，但絕大多數(shù)抗菌肽均帶有不同數(shù)量的正電荷[16]。兩親性對(duì)抗菌肽破壞細(xì)菌細(xì)胞膜非常重要[17]，是設(shè)計(jì)抗菌肽時(shí)亦要考慮的因素。兩親性程度高的抗菌肽具有較好的抗菌活性。絕大多數(shù)抗菌肽具有螺旋結(jié)構(gòu)，且抗菌譜廣[18-19]。增加多肽的疏水性亦能提高抗菌肽的抗菌活性[20]。本研究設(shè)計(jì)的3條新多肽所帶正電荷數(shù)、兩親性程度、螺旋含量、疏水率等均高于模板肽，是新設(shè)計(jì)多肽具有抗菌活性的重要基礎(chǔ)。增加多肽的電荷數(shù)是提高抗菌肽抗菌活性的重要手段[18]。本研究中多肽LJ-1和LJ-2均帶5個(gè)正電荷，多肽DLK-3帶8個(gè)正電荷，這亦可能是多肽DLK-3的總體抗菌活性優(yōu)于多肽LJ-1和LJ-2的原因。

溶血性是影響抗菌肽應(yīng)用的一個(gè)重要因素[21]。一般認(rèn)為，影響抗菌肽溶血性的因素主要包括帶正電荷數(shù)目、疏水性、兩親性程度、二級(jí)結(jié)構(gòu)等。其中，數(shù)量較多的正電荷會(huì)提高抗菌肽的溶血性[22]。因此，在抗菌肽設(shè)計(jì)過程中，在保證較好抗菌活性的基礎(chǔ)上，降低多肽的正電荷數(shù)，改變多肽的其他理化特征，可降低溶血率[21]。本研究結(jié)果顯示，多肽DLK-3帶較多的正電荷，其溶血率也較高，而多肽LJ-1和LJ-2所帶正電荷數(shù)少于DLK-3，溶血率也低。以多肽DLK-3為模板，可繼續(xù)進(jìn)行新抗菌肽的分子設(shè)計(jì)，以期獲得性能更佳的抗菌肽。

抗菌肽應(yīng)用于生物機(jī)體時(shí)受多種因素作用，進(jìn)而影響使用效果。影響抗菌肽使用效果的理化因素主要包括溫度、酸堿環(huán)境、鹽離子等[14]。因此，測(cè)定抗菌肽在這些理化因素作用下的穩(wěn)定性可評(píng)價(jià)抗菌肽的應(yīng)用潛力。熱穩(wěn)定性是影響抗菌肽保存和使用的重要因素。某些抗菌肽抗菌活性在受熱和反復(fù)凍融后會(huì)下降，如絲光綠蠅抗菌肽[23]、海南沼洼皮膚抗菌肽[24]、BSN-37[25]等，但仍保留有抗菌活性。經(jīng)分析，抗菌肽DLK-3、LJ-1和LJ-2經(jīng)高溫(100 ℃)處理及反復(fù)凍融14次后抗菌活性雖仍較高但也有所下降。這提示，在使用抗菌肽DLK-3、LJ-1和LJ-2時(shí)應(yīng)低溫保存，同時(shí)要避免多次反復(fù)凍融。pH和鹽離子是抗菌肽在生物體內(nèi)應(yīng)用時(shí)的重要影響因素[26]。在生物體生理性pH與鹽離子條件下有較好的抗菌活性，是抗菌肽開發(fā)應(yīng)用的前提。本研究結(jié)果顯示，抗菌肽DLK-3、LJ-1和LJ-2在生理性pH與鹽離子條件下仍能保留有較高的抗菌活性，值得繼續(xù)深入開發(fā)。

4 結(jié) 論

本研究從牛血紅蛋白β亞基篩選的1條多肽沒有抗菌活性，但以其序列為模板設(shè)計(jì)的3條新肽(DLK-3、LJ-1和LJ-2)對(duì)革蘭陽(yáng)性菌(金黃色葡萄球菌)、革蘭陰性菌(大腸桿菌、沙門菌、銅綠假單胞菌)和真菌(白色念珠菌)均有抗菌活性，抗菌肽DLK-3、LJ-1和LJ-2為親水性的陽(yáng)離子型α-螺旋多肽，具有較好的熱穩(wěn)定性、酸堿穩(wěn)定性、鹽離子穩(wěn)定性、反復(fù)凍融穩(wěn)定性，抗菌肽DLK-3的溶血性較高，而抗菌肽LJ-1和LJ-2的溶血性極低?？咕腖J-1和LJ-2具有作為抗生素替代物的極高潛力，值得進(jìn)行深入研究。