賈新月，馬 靜，張艷艷，馬 勛，王正榮，薄新文,

(1.石河子大學(xué)動物科技學(xué)院，石河子 832000；2.新疆農(nóng)墾科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所，省部共建綿羊遺傳改良與健康養(yǎng)殖國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，石河子 832000)

預(yù)防傳染病最有效的手段是進(jìn)行疫苗免疫。接種疫苗大大減輕了傳染病帶給人類的負(fù)擔(dān)，疫苗在降低全球死亡率方面的作用僅次于清潔飲用水[1]。免疫接種不僅可直接保護(hù)接種疫苗的個(gè)體，還可通過產(chǎn)生群體免疫間接保護(hù)周圍環(huán)境[2]。但如今所用的商品疫苗多數(shù)為通過皮下注射或肌內(nèi)注射的針劑疫苗，疫苗技術(shù)標(biāo)準(zhǔn)通常只針對已穿過黏膜屏障的病原體[3]。由此產(chǎn)生的免疫反應(yīng)通常僅限于針對病原體或毒素的全身體液免疫，T細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞免疫有限，在黏膜表面產(chǎn)生的保護(hù)也相當(dāng)微弱[4]。相比之下，在黏膜表面接種疫苗可成功誘導(dǎo)黏膜抗體和細(xì)胞介導(dǎo)的免疫反應(yīng)，同時(shí)仍會產(chǎn)生全身抗體反應(yīng)，此途徑能刺激全身和黏膜部位的體液和細(xì)胞免疫反應(yīng)[5]。由于大多數(shù)病原體是通過黏膜感染的，此途徑還可有助于阻止早期感染，以建立更廣泛和持久的保護(hù)。

世界各國都備受寄生蟲病的困擾，寄生蟲大多以動物為中間宿主或終末宿主進(jìn)行寄生、繁殖，嚴(yán)重影響人類與動物的健康。現(xiàn)如今已開發(fā)了多種針對寄生蟲病的疫苗，但不是所有的疫苗在應(yīng)用時(shí)都會有理想的免疫效果，還需更進(jìn)一步進(jìn)行探索改良。目前的寄生蟲疫苗多為注射制劑，動物對針劑疫苗的受控程度差，服從性低，且動物對針刺敏感性很高，易產(chǎn)生應(yīng)激反應(yīng)，嚴(yán)重時(shí)會致使動物死亡，直接影響經(jīng)濟(jì)效益?？诜呙绲难兄茷榻鉀Q這一問題提供了很好的平臺，對于大型養(yǎng)殖場來講，開發(fā)口服疫苗比傳統(tǒng)的注射制劑更可取。筆者就口服疫苗的作用機(jī)理、動物寄生蟲口服疫苗的研究進(jìn)展及優(yōu)點(diǎn)和挑戰(zhàn)進(jìn)行綜述，以期為寄生蟲口服疫苗的開發(fā)提供參考。

1 黏膜免疫系統(tǒng)與口服疫苗的作用機(jī)理

1.1 黏膜免疫系統(tǒng)

黏膜免疫是指機(jī)體與外界相通的胃腸道、呼吸道、泌尿生殖道等黏膜組織及某些腺體的局部免疫，由黏膜組織中的免疫組織、免疫細(xì)胞和免疫分子組成，其主要功能是清除經(jīng)黏膜表面入侵機(jī)體的病原微生物[6]。上皮細(xì)胞表面的黏液層是機(jī)體生理屏障的第一道防線。在小腸上皮中，位于隱窩底部的潘氏細(xì)胞(Paneth cell)能分泌抗菌肽(AMPs)以應(yīng)對入侵機(jī)體的細(xì)菌或病原體，并有助于宿主腸道固有防御[7]。而上皮細(xì)胞則是黏膜免疫系統(tǒng)的第二道物理屏障，直接參與腸道的免疫監(jiān)視。上皮細(xì)胞不僅參與微生物的直接防御還可通過產(chǎn)生細(xì)胞因子和趨化因子向黏膜免疫系統(tǒng)發(fā)送信號[8]。位于上皮細(xì)胞中的固有淋巴細(xì)胞(ILCs)可被激活產(chǎn)生細(xì)胞因子，這些細(xì)胞因子在炎癥中起防御或致病作用。樹突狀細(xì)胞(DC)在免疫系統(tǒng)中具有有效識別和消除外源性病原體的能力。DC能持續(xù)通過屏障將抗原傳遞至黏膜相關(guān)淋巴組織或引流淋巴結(jié)[9]。在穩(wěn)定狀態(tài)下，DC能促進(jìn)CD4+T細(xì)胞向調(diào)節(jié)性T細(xì)胞(Tregs)分化，并通過非經(jīng)典自噬途徑激活Tregs，從而調(diào)節(jié)免疫耐受[10]。促炎性輔助T細(xì)胞(Th)在自身免疫中發(fā)揮重要作用，在宿主防御反應(yīng)中清除病原體，誘導(dǎo)組織炎癥，從而導(dǎo)致隨后的組織破壞。研究表明，Th17細(xì)胞和白介素17A(IL-17A)在全身寄生蟲感染中具有強(qiáng)大的保護(hù)作用[11]。Tregs是免疫耐受和炎癥的主要調(diào)節(jié)成分。此外，上皮細(xì)胞層的分泌細(xì)胞可合成和分泌蛋白多糖，形成黏液和其他參與輔助微生物防御的細(xì)胞[8]。上皮細(xì)胞也表達(dá)各種模式識別受體(PRR)參與免疫應(yīng)答[12]，包括Toll樣受體(TLR)和核苷酸結(jié)合寡聚域蛋白2(NOD2)，它們在抗炎刺激下也為骨髓細(xì)胞和淋巴細(xì)胞產(chǎn)生趨化因子[13]。微生物可通過PRR識別免疫調(diào)節(jié)因子，如趨化因子、促炎細(xì)胞因子和抗炎細(xì)胞因子，這些調(diào)節(jié)因子在自身免疫和適應(yīng)性免疫中發(fā)揮重要作用。

1.2 口服疫苗作用機(jī)理

腸上皮細(xì)胞下層是由B細(xì)胞和T細(xì)胞組成的固有層。當(dāng)口服疫苗進(jìn)入腸道后，T細(xì)胞迅速響應(yīng)來自腸道環(huán)境的信號并啟動免疫反應(yīng)，腸道微生物群促進(jìn)原始CD8+T細(xì)胞向CD4+T細(xì)胞的分化[14]。固有層CD4+T細(xì)胞分泌IL-17和IL-22，參與調(diào)節(jié)腸道炎癥[15]。腸上皮細(xì)胞可產(chǎn)生IL-17誘導(dǎo)趨化因子的表達(dá)，如CXC和CC趨化因子[16]。派爾集合淋巴結(jié)(Peyer’s patches)分布在小腸，其中75%為可產(chǎn)生IgA的成熟B細(xì)胞，20%為T細(xì)胞，以及腸道微皺褶細(xì)胞(M細(xì)胞)[17]。當(dāng)M細(xì)胞將足夠多的抗原通過黏膜屏障運(yùn)送到派爾集合淋巴結(jié)，然后通過抗原遞呈細(xì)胞(APCs)將抗原遞呈給T細(xì)胞時(shí)，就可實(shí)現(xiàn)口服疫苗的有效免疫[18]。在主要組織相容性復(fù)合體(MHC)的作用下APCs表面展示抗原的肽片段，從而激活CD4+T細(xì)胞[19]。隨后，通過活化的CD4+T細(xì)胞與CD40/CD80提供的配體相互作用進(jìn)行細(xì)胞因子分泌，使生發(fā)中心發(fā)育，包括B細(xì)胞親和力成熟和向IgA類轉(zhuǎn)換[20]。分泌IgA對保護(hù)腸道屏障起重要作用[21]。激活后，T細(xì)胞和B細(xì)胞返回固有層，作為特異性免疫反應(yīng)的一部分發(fā)揮作用[8]。此外，通過表達(dá)特異性趨化因子歸巢受體如CXCR5或CCR10，接受抗原刺激后的B細(xì)胞遷移到遠(yuǎn)處的效應(yīng)區(qū)，分化為漿細(xì)胞，能夠分泌二聚體或聚合物IgA分子，其中的sIgA被運(yùn)輸?shù)侥c腔[22]。

2 寄生蟲口服疫苗

寄生蟲病是危害人和動物的重要傳染病之一，疫苗是目前控制寄生蟲病最經(jīng)濟(jì)有效的方式。近年來，免疫學(xué)及生物工程的迅速發(fā)展極大地促進(jìn)了寄生蟲基因工程疫苗的研究[23]。目前，已有大量關(guān)于原蟲和蠕蟲的口服疫苗的報(bào)道。

2.1 原蟲口服疫苗

2.1.1 瘧原蟲 瘧疾是由瘧原蟲(Plasmodium)引起的一種紅細(xì)胞內(nèi)寄生蟲病，是人類歷史上最具破壞性的傳染病之一，目前在97個(gè)國家有超過33億人面臨感染風(fēng)險(xiǎn)[24]。據(jù)估計(jì)，嚴(yán)重的瘧疾在惡性瘧原蟲(Plasmodiumfalciparum)感染中占5%，占所有與瘧疾有關(guān)的死亡人數(shù)的98%。每年有58.4萬人死于嚴(yán)重瘧疾，其中大多數(shù)是5歲以下的兒童。在沒有疫苗的情況下，每年至少有24億歐元用于使用蚊帳、殺蟲劑和藥物治療的瘧疾控制項(xiàng)目[25]。

MSA2是惡性瘧原蟲裂殖子的一種保護(hù)性蛋白[26]，Ramasamy等[27]利用乳酸乳球菌構(gòu)建了表達(dá)惡性瘧原蟲MSA2的載體疫苗，以口服和鼻腔接種免疫兔，結(jié)果發(fā)現(xiàn)通過口服途徑免疫的兔血清中的抗體水平更高。但乳酸菌在體內(nèi)定植時(shí)間較短，機(jī)體無法持續(xù)獲得穩(wěn)定的免疫保護(hù)。

目前針對瘧疾雖沒有獲得許可的口服疫苗，但以植物為基礎(chǔ)的瘧疾疫苗正在開發(fā)中，Davoodi-Semiromi等[28]將霍亂弧菌的霍亂毒素B亞基(CTB)與瘧疾疫苗抗原頂膜抗原-1(AMA1)和裂殖子表面蛋白-1(MSP1)融合后，觀察到CTB融合AMA1蛋白(CTB-AMA1)和CTB融合MSP1蛋白(CTB-MSP1)在萵苣和煙草葉綠體中存在高水平表達(dá)，用融合的AMA1和MSP1口服免疫的小鼠產(chǎn)生抗原特異性抗體，并顯示出抵御瘧疾寄生蟲和霍亂毒素的保護(hù)作用，可見植物細(xì)胞堅(jiān)硬的細(xì)胞壁可提供有效的抗原保護(hù)。

2.1.2 微小隱孢子蟲 微小隱孢子蟲(Cryptosporidiumparvum)是一種廣泛存在于多種脊椎動物體內(nèi)，寄生于人和其他大多數(shù)哺乳動物的寄生蟲。2013年發(fā)布的調(diào)查已將微小隱孢子蟲列入世界六大腹瀉病因之一，同時(shí)也是引起艾滋病患者死亡的重要病因之一[29]。

李世杰[30]利用微小隱孢子蟲cp966胞外區(qū)片段構(gòu)建植物乳桿菌工程菌，通過口服的方式分別免疫小鼠和犢牛，結(jié)果發(fā)現(xiàn)小鼠小腸中TLR-4的表達(dá)升高，能促進(jìn)小鼠的先天性免疫；犢牛血清中細(xì)胞因子IL-2、IL-12、IL-4和γ干擾素(IFN-γ)含量上升；小腸黏膜中肥大細(xì)胞數(shù)量增加；微小隱孢子蟲卵囊排出率平均減少67.14%。結(jié)果表明cp966重組植物乳酸桿菌可作為抗微小隱孢子蟲的候選口服疫苗。

2.1.3 弓形蟲 弓形蟲病是由弓形蟲(Toxoplasmagondii)引起的一種在不同宿主動物之間傳播的人獸共患病，可感染全世界所有哺乳動物和鳥類[31]。動物在妊娠早期感染弓形蟲可能會導(dǎo)致胎兒畸形和宿主流產(chǎn)，且具有傳染性[32]。弓形蟲是頂復(fù)門原蟲，肉孢子蟲科弓形體屬，僅能在貓科動物小腸上皮進(jìn)行有性生殖，在所有弓形蟲宿主中，只有貓科動物能分泌卵囊。一只感染弓形蟲的貓?jiān)?0 d內(nèi)可排出上千萬個(gè)卵囊，這些卵囊是自然條件下弓形蟲病最主要的傳播形式。因此，控制卵囊的傳播意味著從源頭上阻斷了弓形蟲病的流行，可針對此方面研制有效的疫苗來控制弓形蟲病。

卵囊是弓形蟲傳播的重要階段，具有環(huán)境抗性[33]。弓形蟲T-263株是經(jīng)化學(xué)誘導(dǎo)的弓形蟲突變株，具有很強(qiáng)的免疫原性且喪失了形成卵囊的能力，在切斷弓形蟲傳播途徑方面具有重要意義[34]。Frenkel等[35]將T-263株的包囊給貓口服，結(jié)果表明，僅一次免疫即有84%的貓?jiān)谝吧旯ハx后不再排出蟲卵。Freyre等[36]對比了T-263株的包囊、緩殖子和速殖子作為疫苗對貓排卵囊的抑制效果，結(jié)果表明口服T-263株的包囊及緩殖子能抑制貓排卵囊。Dubey等[33]研究表明，感染T-263株雖可產(chǎn)生裂殖體，但不能產(chǎn)生成熟卵囊。上述結(jié)果表明，T-263菌株在卵囊形成方面存在缺陷，有望成為口服弓形蟲疫苗候選株。

頂復(fù)門原蟲可通過獨(dú)特的滑動運(yùn)動機(jī)制在固體基質(zhì)上移動并侵入宿主細(xì)胞[37]。這種機(jī)制依賴于肌動蛋白-肌球蛋白系統(tǒng)中名為微粒體的頂端分泌囊泡中的蛋白質(zhì)，即微線體蛋白(MICs)。MICs包含與高等真核蛋白質(zhì)的黏附結(jié)構(gòu)域同源的模塊，并可與宿主細(xì)胞上的受體結(jié)合[38]。MICs為寄生蟲滑動和宿主細(xì)胞入侵提供動力，在寄生蟲對細(xì)胞入侵方面起著十分重要的作用[39]。Mic-1基因缺失的蟲株減弱了弓形蟲的入侵能力，Mic-3基因缺失的蟲株毒力降低。RH株作為Ⅰ型蟲株，具有很強(qiáng)的毒力，但在貓?bào)w內(nèi)喪失了形成卵囊的能力[40]。以RH株為野生株，敲除基因Mic-1和Mic-3得到了Micl-3KO株，該蟲株在小鼠體內(nèi)的毒性降低[41]。Le Roux等[42]分別給貓口服或靜脈注射免疫M(jìn)icl-3KO速殖子，之后使用76K株包囊攻蟲，結(jié)果免疫組貓均產(chǎn)生了高水平的IgM和IgG，但攻蟲后均排出基因型為76K的卵囊，表明Micl-3KO可誘導(dǎo)貓產(chǎn)生高水平抗體，具有良好的免疫原性和安全性，但不能抵抗野生株的感染，感染野生株后依然能排出卵囊。微線體蛋白16(TgMIC16)是弓形蟲中一種新的保護(hù)蛋白，屬于跨膜微線體蛋白(TM-MIC)[43]。TM-MIC存在于寄生蟲表面，是能與宿主細(xì)胞受體相互作用的復(fù)合物。酵母表面展示技術(shù)常用于口服疫苗的研究，其原理是將目的抗原與酵母中的細(xì)胞壁蛋白融合表達(dá)，并在細(xì)胞壁蛋白的協(xié)助下將目的抗原錨定在細(xì)胞表面[44]。Wang等[45]利用釀酒酵母表面表達(dá)TgMIC16蛋白，并通過口服和腹腔免疫BALB/c小鼠。結(jié)果表明，與未免疫的對照組相比，用pCTCON2-TgMIC16/EBY100疫苗可刺激體液和細(xì)胞免疫應(yīng)答，免疫組小鼠存活時(shí)間延長，說明展示在釀酒酵母細(xì)胞表面的TgMIC16可作為潛在的弓形蟲RH株的潛在疫苗。

弓形蟲致密顆粒抗原4(GRA4)存在于弓形蟲致密顆粒及納蟲泡中并能分泌出來，當(dāng)速殖子分裂并侵入細(xì)胞時(shí)，其可作為抗原刺激機(jī)體免疫系統(tǒng)產(chǎn)生黏膜免疫和全身免疫，且在急慢性感染中普遍存在[46]。弓形蟲GRA4抗原在葉綠體中表達(dá)后，經(jīng)轉(zhuǎn)基因葉片口服免疫小鼠后，可以產(chǎn)生細(xì)胞和黏膜免疫應(yīng)答，感染弓形蟲后小鼠腦內(nèi)包囊負(fù)荷降低60%[47]，是一種很有潛力的疫苗候選分子。

不同亞型弓形蟲表面抗原SAG1蛋白相對保守，雖然SAG1蛋白只占弓形蟲全部蛋白的3%左右，但弓形蟲感染動物產(chǎn)生的血清中約有50%的抗體識別SAG1，是非常好的診斷指標(biāo)[48]。也有學(xué)者將其應(yīng)用于疫苗的開發(fā)研究中，Albarracín等[49]將Li HSP83的熱休克蛋白融合到SAG1后，提高了煙草葉綠體中SAG1的表達(dá)，也降低了口服免疫小鼠的包囊負(fù)荷。表明SAG1不僅可以用于診斷，也有望成為弓形蟲的候選疫苗。

2.1.4 柔嫩艾美耳球蟲 雞球蟲病是由頂端復(fù)合原蟲艾美耳球蟲屬的多種球蟲寄生在雞小腸或黏膜引起的，寄生于雞盲腸上皮細(xì)胞的柔嫩艾美耳球蟲(Eimeriatenella)是7種艾美耳球蟲中致病性最強(qiáng)的一種，也是影響全球家禽業(yè)的一種主要寄生蟲[50]。雖然化學(xué)預(yù)防和活卵囊疫苗作為主要方法已被用于控制雞球蟲病多年，但每種方法都有其自身的局限性和缺點(diǎn)。因此，迫切需要新的方法來控制雞球蟲病[51]。科研人員嘗試開發(fā)新型口服活疫苗作為預(yù)防球蟲病的有效替代策略[52]。

EtMic2是柔嫩艾美耳球蟲的一種微線體蛋白，由微線體分泌，與宿主細(xì)胞入侵密切相關(guān)[53]。Sathish等[54]研究表明，EtMic2蛋白對雞感染柔嫩艾美耳球蟲有部分保護(hù)作用，是用于疫苗開發(fā)的一個(gè)很好的候選靶標(biāo)。Sun等[55]在釀酒酵母表面表達(dá)雞球蟲EtMic2并評估其作為抗柔嫩艾美耳球蟲攻擊的潛在口服疫苗，結(jié)果顯示，口服酵母活疫苗能誘發(fā)雞的體液免疫和細(xì)胞免疫，使雞體重增加，盲腸病變減少，糞便中檢測到的脫落卵囊數(shù)量減少。表明在細(xì)胞表面表達(dá)EtMic2的釀酒酵母可作為潛在的雞球蟲口服活疫苗。釀酒酵母作為一種活載體系統(tǒng)，其表達(dá)水平穩(wěn)定，且酵母細(xì)胞壁成分會提高生長速度，并調(diào)節(jié)宿主的免疫力[56]。

已有報(bào)道證明乳酸菌可將DNA質(zhì)粒遞送到宿主細(xì)胞內(nèi)[57]。周芳玉[58]以錨定表達(dá)載體pSIP409表達(dá)雞柔嫩艾美耳球蟲EtMiC2蛋白，成功獲得重組乳酸菌pSIP409-pgsA-EtMiC2并通過口服方式免疫雛雞，結(jié)果顯示pSIP409-pgsA-EtMiC2口服疫苗具有中等抗球蟲效果。

2.2 蠕蟲口服疫苗

2.2.1 鉤蟲 鉤蟲(Ancylostoma)是鉤口科線蟲的統(tǒng)稱，發(fā)達(dá)的口囊是其形態(tài)學(xué)特征。在寄生于人體消化道的線蟲中鉤蟲的危害性最嚴(yán)重，人體一旦被鉤蟲寄生，將會出現(xiàn)長期慢性失血情況，從而導(dǎo)致貧血及貧血相關(guān)癥狀[59]。雖然鉤蟲病可治療，但由于其流行分布廣泛，很易造成循環(huán)再感染。在中國，鉤蟲病仍是危害人民健康的寄生蟲病之一[60]。

Bartlett等[61]設(shè)計(jì)了一種脂肽口服給藥系統(tǒng)，該系統(tǒng)利用美洲新諾蟲天冬氨酸蛋白酶Na-APR-1的B細(xì)胞表位，該表位結(jié)合輔助性T細(xì)胞表位。將脂肽自組裝成納米顆?；虬缓Ｔ逅猁}和三甲基殼聚糖靜電包被的脂質(zhì)體中。將該佐劑作為疫苗通過口服方式免疫小鼠，檢測到小鼠針對鉤蟲腸道肽抗原和親本蛋白產(chǎn)生體液免疫反應(yīng)，免疫小鼠的平均腸道蠕蟲和卵負(fù)荷分別降低了98%和99%。說明小鼠口服該佐劑后，可產(chǎn)生針對鉤蟲多肽抗原和親本蛋白的體液免疫應(yīng)答，并能顯著降低腸道蠕蟲和蟲卵的負(fù)擔(dān)。這項(xiàng)研究證明了聚合物保護(hù)的脂質(zhì)體結(jié)構(gòu)不需要強(qiáng)有力的口服抗原遞呈，相反，形成桿狀聚集結(jié)構(gòu)的脂肽在胃腸道條件下可存活，并誘導(dǎo)抗體反應(yīng)，與鉤蟲腸道中的天然蛋白質(zhì)結(jié)合，并對寄生蟲挑戰(zhàn)產(chǎn)生顯著的保護(hù)作用。此佐劑方法有望成為一種技術(shù)簡單、潛在安全的口服鉤蟲疫苗。

2.2.2 旋毛蟲 旋毛蟲(Trichinellaspiralis)又稱旋毛形線蟲，是人獸共患線蟲，成蟲寄生于宿主的小腸，幼蟲寄生在宿主的肌肉內(nèi)，人嚴(yán)重感染時(shí)能急性致死[62]。旋毛蟲病是最嚴(yán)重的食源性寄生蟲病之一，在世界各地都有分布，因此有必要研制一種疫苗，以阻斷動物向人類的傳播。

王君耀[63]研究表明，旋毛蟲ES抗原是旋毛蟲的代謝分泌產(chǎn)物，并且在感染過程中直接與被感染者的免疫系統(tǒng)接觸，具有較強(qiáng)的免疫原性。而沙門氏菌為胞內(nèi)侵襲菌，能有效遞呈抗原，激發(fā)抗沙門氏菌和誘導(dǎo)外源蛋白的特異性體液免疫反應(yīng)與細(xì)胞免疫反應(yīng)，能同時(shí)誘導(dǎo)黏膜免疫與全身免疫[64]。王君耀[63]將旋毛蟲ES抗原與沙門氏菌結(jié)合，構(gòu)建了旋毛蟲43kuES蛋白的重組減毒沙門氏菌，口服免疫小鼠后可刺激脾臟和腸系膜淋巴結(jié)的增殖，產(chǎn)生較高水平的抗體和細(xì)胞因子，攻蟲后，免疫小鼠體內(nèi)旋毛蟲數(shù)量顯著減少，結(jié)果表明43kuES蛋白的重組減毒沙門氏菌有成為旋毛蟲口服疫苗的可能。

Qi等[65]從旋毛蟲的成蟲(aw)和腸道感染性幼蟲(iil)的表面或排泄/分泌蛋白質(zhì)中篩選出一個(gè)旋毛蟲成蟲特異性DNA酶ii-1(TsDNase Ⅱ)。利用減毒沙門氏菌Δasl1344株構(gòu)建了口服活載體TsDNase Ⅱ DNA疫苗，口服接種小鼠后發(fā)現(xiàn)引起了明顯的黏膜sIgA反應(yīng)和全身IgG反應(yīng)，其中IgG1占主導(dǎo)地位。免疫小鼠的脾臟和腸系膜淋巴結(jié)細(xì)胞中Th1和Th2細(xì)胞因子明顯升高，aw和iil分別下降了53.85%和59.26%，此結(jié)果表明，TsDNase Ⅱ DNA口服疫苗有顯著的免疫保護(hù)作用。

2.2.3 華枝睪吸蟲 華枝睪吸蟲(Clonorchissinensis)又稱肝吸蟲、華肝蛭。成蟲寄生于人或其他哺乳動物的肝膽管中，因此其危害性主要是導(dǎo)致患者的肝臟受損，嚴(yán)重感染時(shí)可造成膽管炎、膽囊炎、阻塞性黃疸[66]。感染華枝睪吸蟲還可引起膽管上皮細(xì)胞增生甚至癌變，主要為腺癌。

諸多試驗(yàn)證明，來自肝片吸蟲、衛(wèi)氏并殖吸蟲、弓形蟲等的亮氨酸氨基肽酶2(LAP2)可誘導(dǎo)相對有效的免疫反應(yīng)，抵抗相應(yīng)寄生蟲的感染。華支睪吸蟲的LAP2(CsLAP2)隨后也被確定為華支睪吸蟲排泄和分泌產(chǎn)物(CsESP)的一個(gè)組成部分，并在華支睪吸蟲后尾蚴的階段大量表達(dá)，CsLAP2可通過皮下免疫誘導(dǎo)高水平的體液和細(xì)胞免疫應(yīng)答[67]。屈紅伶等[68]制備重組CsLAP2枯草芽孢桿菌芽孢口服疫苗，通過口服方式免疫小鼠，結(jié)果發(fā)現(xiàn)該免疫組小鼠肝臟病理變化較對照組輕微，且重組疫苗可引起小鼠的細(xì)胞和黏膜免疫。

2.2.4 鏈狀帶絳蟲 鏈狀帶絳蟲(Taeniasolium)又稱豬帶絳蟲、豬肉絳蟲或有鉤絳蟲，是中國主要的人體寄生蟲[69]。豬和野豬是其主要的中間宿主，人是唯一的終末宿主，人也可作為其中間宿主，被囊尾蚴寄生的豬肉，俗稱“米豬肉”，人因吃入未煮熟的“米豬肉”而感染，成蟲寄生于小腸內(nèi)，引起豬帶絳蟲病，而囊尾蚴寄生在人的肌肉、腦、眼等處，引起囊蟲病[70]。

在豬帶絳蟲生活史中，六鉤蚴階段被認(rèn)為是入侵宿主機(jī)體的關(guān)鍵時(shí)期，此階段表達(dá)的特異性抗原Tsol 18具有較強(qiáng)的免疫原性和抗原性[71]。張雪彬等[72]構(gòu)建了表達(dá)豬帶絳蟲六鉤蚴Tsol 18抗原的重組減毒鼠傷寒沙門氏菌疫苗株，將疫苗株口服免疫小鼠，結(jié)果顯示，免疫組小鼠的CD4+、CD8+T淋巴細(xì)胞數(shù)目明顯增多，CD4+/CD8+T細(xì)胞比值極顯著增高，提示口服疫苗X4550/pYA3341-Tsol 18可能同時(shí)誘導(dǎo)Th1和Th2免疫應(yīng)答反應(yīng)，表明口服疫苗X4550/pYA3341-Tsol 18具有良好的免疫效果。

2.2.5 細(xì)粒棘球絳蟲 細(xì)粒棘球蚴病又稱囊型包蟲病，是由細(xì)粒棘球絳蟲(Echinococcusgranulosus)幼蟲引起的寄生蟲病。細(xì)粒棘球絳蟲是一種嚴(yán)重危害人類健康和畜牧業(yè)生產(chǎn)的帶科、棘球?qū)俳{蟲[73]。其擁有兩任宿主，成蟲主要寄生于犬科食肉動物的小腸里，如犬、狼等(終末宿主)，幼蟲寄生于牛、羊等食草動物和人(中間宿主)，細(xì)粒棘球蚴病是呈全球性分布的人獸共患寄生蟲病。

在寄生蟲體內(nèi)天然存在多種蛋白質(zhì)可誘導(dǎo)宿主機(jī)體抵抗寄生蟲的侵害，包括副肌球蛋白[74]和原肌球蛋白[75]。在細(xì)粒棘球絳蟲中也存在這些蛋白的類似物，如原肌球蛋白(EgTrp)和與副肌球蛋白相似的纖維蛋白(EgA31)。有試驗(yàn)證明EgA31和EgTrp都是犬抗細(xì)粒棘球蚴免疫發(fā)展中潛在的抗原[76]。Petavy等[77]將EgTrp和EgA31 2種細(xì)粒棘球絳蟲重組蛋白克隆并在減毒沙門氏菌中表達(dá)以制備口服疫苗，經(jīng)口投喂試驗(yàn)犬。結(jié)果顯示犬蟲體負(fù)擔(dān)顯著降低70%～80%，證明沙門氏菌疫苗EgA31-EgTrp有很好的效果，在減少細(xì)粒棘球絳蟲對人和動物的傳播方面有潛在作用，表明其可作為一種新的口服細(xì)粒棘球絳蟲候選疫苗。

部分寄生蟲口服疫苗中所涉及的蟲種、靶分子、載體種類、免疫動物及免疫效果見表1。

表1 寄生蟲口服疫苗

3 口服疫苗的優(yōu)點(diǎn)與挑戰(zhàn)

3.1 口服疫苗的優(yōu)點(diǎn)

與傳統(tǒng)注射疫苗相比，口服疫苗易于給藥，最大限度地減少了對醫(yī)護(hù)人員的需求，可進(jìn)一步降低疫苗項(xiàng)目的成本[78]。從監(jiān)管的角度來看，口服疫苗的生產(chǎn)更具成本效益，傳統(tǒng)的注射方式需在合成和制造過程中保證無菌，在儲存和運(yùn)輸時(shí)所需條件要求也很高，且在使用后會產(chǎn)生大量生物危險(xiǎn)廢物，大多數(shù)發(fā)展中國家尚無適當(dāng)處理這些廢物的基礎(chǔ)設(shè)施[79]。此外，注射方式會引起動物產(chǎn)生應(yīng)激反應(yīng)。所有這些因素都直接或間接增加了免疫接種的成本，這可能會影響某些地區(qū)的接種意愿度，甚至?xí)?yán)重影響緊急接種疫苗的機(jī)會或?qū)е旅庖咝Ч麉⒉畈积R，這些情況利用口服疫苗可得到緩解。且許多潛在的致命性疾病通常是由腸道病原體越過胃腸道的黏膜屏障引起的[80]，因此形成強(qiáng)大的黏膜免疫屏障將是防止微生物與宿主接觸感染的有效策略。

3.2 口服給藥面臨的挑戰(zhàn)

胃腸道是機(jī)體消化、吸收營養(yǎng)物質(zhì)的主要場所，胃腸道包括高度酸性的胃內(nèi)環(huán)境及有顯著的pH范圍、有限滲透性的腸段，并且胃腸道內(nèi)富含多種降解蛋白質(zhì)的蛋白水解酶和膽鹽，這些特性會影響生物分子的運(yùn)輸，如抗原蛋白或肽，這些生物分子極易發(fā)生變性或被降解。此外，大部分生物分子的吸收過程發(fā)生在小腸，但一般來說食物在小腸的滯留時(shí)間只有3～4 h，因此某些生物分子的吸收還需考慮時(shí)間因素的影響，即是否會受到時(shí)間的限制[81]。為了促進(jìn)強(qiáng)大的免疫反應(yīng)，口服抗原需要克服胃腸道中的多種物理化學(xué)和生物障礙。

另外，與傳統(tǒng)的非腸道免疫相比，黏膜免疫需要更高劑量的抗原來誘導(dǎo)免疫反應(yīng)[18]。這一特性限制了可用作載體的制劑，因?yàn)樗鼈儽仨毮艹晒y帶所需的抗原劑量。更大的劑量也會增加誘導(dǎo)耐受性的風(fēng)險(xiǎn)，而不是刺激保護(hù)性反應(yīng)[82]。胃腸道經(jīng)常接觸食物與環(huán)境中的各種病原體，如果疫苗沒有誘導(dǎo)適當(dāng)?shù)奈ｋU(xiǎn)信號，則會誘導(dǎo)成以Tregs為基礎(chǔ)的耐受性反應(yīng)，而不是Th17介導(dǎo)的保護(hù)性免疫。機(jī)體可將其識別為非致病性，避免觸發(fā)免疫反應(yīng)，導(dǎo)致免疫耐受而不是保護(hù)[83]。因此，在口服疫苗載體的設(shè)計(jì)中，要促進(jìn)效應(yīng)細(xì)胞而不是調(diào)節(jié)細(xì)胞的誘導(dǎo)及設(shè)計(jì)有效的佐劑來充分刺激免疫系統(tǒng)。

4 展 望

目前，已有部分口服疫苗在動物試驗(yàn)中獲得了較好的效果，但暫時(shí)還沒有被批準(zhǔn)生產(chǎn)使用。主要是因?yàn)榭诜呙缰亟M載體的表達(dá)量較低，免疫原性要達(dá)到理想水平需克服其表達(dá)量低這一困難。因此，各國研究者在載體設(shè)計(jì)改進(jìn)、傳統(tǒng)佐劑優(yōu)化、分子佐劑共表達(dá)等方面開展了大量研究工作。想要成功研制亞單位口服疫苗需設(shè)計(jì)專門給藥載體，還需考慮部分載體的自身毒性問題，并選擇合適的能增強(qiáng)其免疫效果的佐劑，以引起強(qiáng)烈而平衡的免疫反應(yīng)。生物安全性也是口服疫苗備受關(guān)注的方面，因?yàn)榭诜呙绲拇蠖鄶?shù)載體為減毒活載體，安全性不能百分百保證。另外，如何高效通過服用者的胃內(nèi)酸性環(huán)境，保證抗原不被降解也是一個(gè)嚴(yán)峻問題?？诜呙绲拿庖咝Яσ才c機(jī)體胃腸道系統(tǒng)的營養(yǎng)和健康有關(guān)系，如熱帶腸病所導(dǎo)致的營養(yǎng)不良、腸道吸收障礙、炎癥，都會降低口服疫苗的免疫效力[84]。不過在疫苗中添加輔助因子(維甲酸)可改善接種個(gè)體的反應(yīng)[85]。如本綜述所述，口服途徑接種疫苗優(yōu)點(diǎn)突出；同時(shí)對于抗原的保護(hù)、釋放及載體的輔助能力等方面還面臨著挑戰(zhàn)。為了克服這些挑戰(zhàn)，如何研制出效果更好更優(yōu)質(zhì)的口服疫苗，仍需進(jìn)一步探索。

隨著寄生蟲培養(yǎng)處理和口服疫苗合成技術(shù)的不斷進(jìn)步，寄生蟲口服疫苗開發(fā)研究平臺也越來越成熟?；蚝痛x工程等方面的研究進(jìn)展也使研究者能制造出安全且能產(chǎn)生免疫反應(yīng)的新分子。同時(shí)生物材料領(lǐng)域研究的突破，可設(shè)計(jì)更好的抗原運(yùn)載工具。這些載體的設(shè)計(jì)和開發(fā)可能包括免疫調(diào)節(jié)劑、黏液滲透策略、佐劑和其他方法，將有助于生產(chǎn)黏膜疾病的亞單位口服疫苗，也將為成功研發(fā)更多寄生蟲病口服疫苗提供技術(shù)平臺，進(jìn)而為寄生蟲病的有效防控提供強(qiáng)有力的技術(shù)支撐。